Para empezar, centrifugar una vez 10 a la potencia de siete líneas celulares HeLa que contienen fragmentos de ADN de restricción telomérica a 1.000 g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de PBS. Después del tratamiento con proteinasa K SDS y cloruro de sodio, centrifugar la suspensión celular a 16, 900 g durante 10 minutos.
Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga y agregue un volumen igual de isopropanol, evitando lípidos flotantes o sedimentos. Centrifugar a alta velocidad y lavar el pellet con 500 microlitros de etanol al 70%. Después de secar el pellet de ADN, vuelva a suspenderlo con cuidado en 475 microlitros de tampón TE y mezcle suavemente golpeando la parte inferior del tubo.
Ahora, agregue 25 microlitros de 10 miligramos por mililitro de ARN y golpee el tubo hasta que el pellet se disuelva por completo. A continuación, agregue 1/10 de volumen de acetato de sodio de tres molares y dos volúmenes de etanol 100% frío y coloque el tubo a menos 80 grados centígrados durante dos o tres horas. Después de la centrifugación y los lavados con etanol al 70%, agregue 100 microlitros de tampón TE al gránulo de ADN, golpee el tubo para mezclar y colóquelo a cuatro grados centígrados durante dos horas para que se disuelva por completo.
Para la digestión del ADN, combine cuatro microgramos de ADN genómico con un microlitro de CviAII, dos microlitros de tampón de digestión 10X y agua para alcanzar un volumen total de 20 microlitros. Incubar la mezcla a 25 grados centígrados durante 12 horas. En un termociclador, calienta la mezcla a 75 grados centígrados durante tres minutos.
Luego, disminuya la temperatura en 0,1 grados centígrados cada 30 segundos hasta llegar a 25 grados centígrados. Después de la limpieza y el secado, cubra los deslizadores de la cubierta inferior con 20 microlitros de nitrocelulosa al 0,1% y agregue perlas de referencia. Hornee los cubreobjetos a 100 grados centígrados durante cuatro minutos.
Ensamble el sándwich de celda de flujo. Y después de calentar a 85 grados centígrados, use dos hisopos para masajear el conjunto hasta que el Parafilm selle el canal. Lave 10 microlitros de perlas M-270 cinco veces con 50 microlitros de tampón de trabajo usando un imán.
Después del lavado, agregue las perlas sobre el ADN genómico digerido en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Golpee suavemente el tubo unas cuantas veces para mezclar las cuentas y la muestra de ADN. Deja la mezcla en hielo durante una hora.
Después de la incubación, lave la mezcla con 500 microlitros de tampón de trabajo tres veces usando un imán para tirar de las perlas hacia abajo con intervalos de 10 minutos entre lavados. Vuelva a suspender la muestra en un tampón de trabajo y cargue 30 microlitros de la mezcla en la celda de flujo. Enjuague las cuentas magnéticas sueltas después de 30 minutos.
Después de colocar la celda de flujo en la parte superior de la lente del objetivo, seleccione un par de imanes cúbicos de cinco milímetros dispuestos en una configuración vertical y alinee el soporte del imán con el eje x de la trayectoria de la luz de las pinzas magnéticas para obtener imágenes. Inicie el software de programación gráfica y conecte los controladores para las pinzas magnéticas. Ajuste el campo de visión para ubicar un cordón de referencia en la parte inferior de la celda de flujo y ajuste ligeramente la lente del objetivo para que el cordón de referencia muestre anillos de defracción claros.
Escriba un script en MATLAB para controlar los movimientos del motor para ensayos de rampa de fuerza. Importe el script en un software de programación gráfica para probar los experimentos de una sola molécula. A un caudal lento, cargue 200 microlitros de TRF1 de 10 nanomolares en la celda de flujo.
Después de 30 minutos de enlace, elija un script para un experimento de rampa de fuerza con una tasa de carga de fuerza de más/menos un piconewton por segundo. Asigne un nombre a los archivos de datos y ejecute el experimento. La integridad del ADN genómico se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa, y el TRS resultante mostró longitudes consistentes en varias líneas celulares humanas.
Las secuencias repetidas teloméricas en TRS se detectaron a través de Southern blot, mostrando claras señales de hibridación. Las curvas de extensión de fuerza del ensayo de rampa de fuerza mostraron patrones en zigzag durante el estiramiento, lo que indica la ruptura de las interacciones entre el ADN de las proteínas. La cinética de disociación de los complejos de proteínas de ADN telomérico mostró una relación lineal entre la fuerza y la tasa de disociación.
Además, la heterogeneidad de la longitud del ADN telomérico de las células humanas investiga el mecanismo de formación de bucles en telómeros de varias longitudes.
