Para comenzar, adquiera imágenes multivista de embriones de pez cebra en etapa temprana utilizando un microscopio de lámina de luz. Una vez detectados los puntos de interés, seleccione todas las vistas, haga clic con el botón derecho y elija Registrar con puntos de interés. Para comprobar la precisión con la que ha funcionado el registro, seleccione dos vistas consecutivas.
Vaya a la región superpuesta y alterne entre las dos vistas para observar si las cuentas visualizadas desde diferentes ángulos están superpuestas. Después de registrarse correctamente, haga clic en Guardar en la ventana del explorador multivista para guardar el archivo XML actualizado. Ahora abre la cuenta.
XML en un editor de texto de su elección y copie todo el bloque en registros de vista. Abre el embrión. XML y reemplace el bloque de registros de vista con el bloque copiado del archivo de cuentas.
A continuación, abre el embrión. XML en Big Stitcher y compruebe cuidadosamente si el registro ha funcionado con éxito para el embrión. Repita lo mismo para las cuentas comprobando la superposición de estructuras de interés en cada dos vistas consecutivas.
Para realizar la deconvolución de varias vistas, seleccione todas las vistas del archivo de cuentas, haga clic con el botón derecho y elija las funciones de dispersión de puntos y las opciones de extracción. Proceda con los tamaños de función de dispersión de puntos predeterminados y haga clic en Aceptar. A continuación, vuelva a guardar el archivo XML. A continuación, abre el embrión.
XML y asigne la función de dispersión de puntos para cada vista por separado. Haga clic con el botón derecho en una vista, haga clic en Funciones de dispersión de puntos, elija Asignar y seleccione Avanzado, seguido de Asignar nuevo PSF a todas las vistas seleccionadas. Haga clic en Examinar, vaya a la ruta del archivo XML y abra la carpeta PSF.
En la vista seleccionada, elija la función de dispersión de puntos coincidentes con el ID correspondiente y haga clic en Aceptar. Una vez asignada la función de dispersión de puntos para todas las vistas, haga clic con el botón derecho y elija la deconvolución multivista. Seleccione el cuadro delimitador como vistas seleccionadas actualmente. Al 70% de la epibolia, los embriones asumieron orientaciones horizontales, verticales u oblicuas dentro del tubo polimérico, siendo la horizontal la menos representada, mientras que las posiciones vertical y oblicua se observaron igualmente.
Cuando las muestras se prepararon antes de la gastrulación, alrededor del 25% de los embriones mostraron orientación horizontal. El resto de los embriones exhibieron otras orientaciones en la etapa de brote. Sin embargo, muchos de ellos se reorientaron a la posición horizontal durante la formación temprana de somitas.
Una comparación de las imágenes infundidas con información a escala celular no mostró diferencias significativas en la información de los núcleos, pero los límites celulares se resolvieron mejor en el conjunto de 30 grados. En comparación con las imágenes de entrada originales, las imágenes segmentadas contenían errores. El software no pudo detectar un límite de celda o dibujó límites de celda inexistentes.
El número de errores aumentó drásticamente las imágenes infundidas obtenidas a partir de imágenes a intervalos angulares de 45 y 60 grados en comparación con los 30 grados.
