Incluso los embriones muy tempranos contienen muchas moléculas de señalización diferentes, lo que puede dificultar el discernimiento de la función completa de cualquier señal embrionaria individual. Al aislar las células de los centros de señalización endógenos, estos explantes permiten a los investigadores examinar el papel de una molécula de señalización dada en el aislamiento relativo. La principal ventaja de esta técnica es que somos capaces de recapitular el tiempo embrionario, los movimientos celulares y los patrones de expresión génica dentro de un sistema ex vivo simplificado sin el tiempo o el esfuerzo necesarios para mantener las células madre en cultivo.
Comience cortando primero los explantes de los embriones no infectados. Si los explantes extienden el cultivo, entonces el corte se hizo para cerrarse a la yema. Comience llenando una aguja capilar de vidrio tirado con ARN.
Coloque la aguja llena en un micro-manipulador y rompa la punta de la aguja con las pinzas. Calibre el volumen de inyección utilizando un micrómetro de etapa con una gota de aceite mineral, ajustando el tiempo de inyección y la presión en el inyector neumático para lograr un bolo del tamaño deseado. Mantenga la punta de la aguja de ARN sumergida en el aceite hasta que esté lista para inyectar.
Cargue los embriones en la placa de inyección con una pipeta Pasteur y una bomba de pipeta, y luego use un dedo enguantado para presionar los huevos en los comederos suavemente. Inyectar 10 picogramos de ARN ndr2 en la yema de embriones unicelulares hasta que se alcance el número deseado de embriones o hasta que los embriones comiencen a dividirse. Use un chorro suave de agua de huevo de una botella de compresión para lavar los embriones de la placa de inyección en una placa de Petri etiquetada.
Coloque los embriones en la incubadora de 28,5 grados centígrados hasta que alcancen la etapa de 128 células. Retire los huevos no fertilizados y los embriones muertos del plato. Una vez que los embriones hayan alcanzado la etapa de 128 células, colóquelos en placas de Petri de vidrio etiquetadas y decante la mayor cantidad de agua de huevo posible de ellos.
Etiquete los platos cristalizados de vidrio con cinta de laboratorio correspondiente a los nombres de platos pequeños y llene dos tercios del camino con agua de huevo. Coloque estos platos junto al microscopio de disección para una rápida accesibilidad. Agregue un mililitro de 20 miligramos por mililitro de pronasa, descongelado en hielo a 15 mililitros de solución de 3X Danieau en un tubo cónico de 50 mililitros.
Añadir al menos cinco mililitros de solución de pronasa a cada placa de Petri de vidrio que contenga embriones. Agitar los platos de vidrio en un movimiento circular, monitoreando el progreso de la decoroción consistentemente bajo un microscopio de disección. Una vez que los coriones comienzan a arrugarse y uno o dos embriones están fuera de sus coriones, sumerja cuidadosamente la placa de Petri de vidrio que contiene pronasa y los embriones en el plato de cristalización de vidrio correspondiente que contiene agua de huevo.
Lave los embriones de descoración tres veces con agua de huevo y decante el agua de huevo del plato. Realice el tercer y último lavado con la solución de Danieau 0.3X. Cubra los embriones decororonados con una tapa de placa de Petri y devuélvalos a la incubadora a 28,5 grados centígrados hasta que alcancen la etapa de 256 células.
Llene una placa de Petri recubierta de agarosa con la solución de Danieau 3X. Una vez que los embriones estén en la etapa de 256 células, transfiéralos a la placa recubierta de agarosa que contiene la solución de Danieau 3X, alineándolos a lo largo del centro del plato. Use un par de bórceps, que se mantienen cerrados para estabilizar el embrión, y use el otro para cortar el blastodermo.
Para cortar, apriete suavemente las células del blastodermo con un par de bórceps, luego tome las pórceps estabilizadoras y colórtelas a lo largo de las otras pórceps para cortar aproximadamente la mitad del blastodermo. Gire el embrión, colocando los pórceps en el corte existente y luego corte el blastodermo ortogonal restante al primer corte. Mantenga los explantes en la solución de Danieau 3X durante al menos cinco minutos para que sanen, y luego transfiéralos al pozo recubierto de agarosa de una placa de seis pozos llena de cuatro mililitros de medios de explante.
Coloque las placas de cultivo de explante en la incubadora de 28,5 grados centígrados hasta que se alcance el punto de tiempo o etapa deseado. Para cortar los explantes quiméricos, use un plato con agarosa moldeada en 12 pequeños pozos poco profundos con cuentas de vidrio de un milímetro. Llene el plato con la solución 3X danieau.
Prepárese agregando 12 embriones de un genotipo o condición al lado izquierdo de la placa, y 12 embriones del otro genotipo se acondicionan al lado derecho de la placa. Mueva un embrión de cada condición al centro de la placa cerca de uno de los 12 pozos. Usando forrceps, corte un explante de cada embrión como se describe para los explantes de un solo embrión.
Presione rápidamente los bordes cortados de los dos explantes juntos dentro del pozo poco profundo usando forrceps para permitir que las dos mitades sanen juntas en un solo explante. Continúe con los 12 pozos restantes dentro de la placa. Una vez que los explantes estén curados, transfiéralos al pozo recubierto de agarosa de una placa de seis pozos llena de cuatro mililitros de medios de explante.
Repetir hasta que se logre el número deseado de explantes. El cultivo se explanta en la incubadora de 28,5 grados centígrados hasta que los embriones hermanos intactos alcanzan la etapa deseada. Los explantes de control cortados de los embriones de tipo silvestre no infectados o aquellos inyectados con 50 picogramos de ARNm que codifican la proteína fluorescente verde permanecieron redondeados durante todo el período de cultivo y no lograron expresar marcadores de mesodermo, endodermo o neuroectodermo.
Los explantes cortados de embriones inyectados con 10 picogramos de ARNm ndr2 se alargaron mucho después de ocho a nueve horas en cultivo. Las imágenes de lapso de tiempo en vivo de estos explantes mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial revelaron que la extensión comienza alrededor de las ocho horas posteriores a la fertilización. Los explantes de embriones inyectados con 10 picogramos de ndr2 exhibieron una expresión robusta de los marcadores mesodermo, tbxta, noto, tbx16 y el marcador de neuroectodermo sox2.
Es muy importante cortar los explantes muy por encima del margen embrionario. De lo contrario, los explantes contendrán señales endógenas del margen y no serán ingenuos. En este método, se utilizaron explantes para abordar el papel de la señalización ganglionar en la morfogénesis de la gastrulación.
En el futuro, otros investigadores pueden utilizar este enfoque para probar el papel de las moléculas de señalización adicionales, por ejemplo, en cualquier número de procesos de desarrollo.
