Para comenzar, tome 100 miligramos de pañuelo fresco o 20 miligramos de pañuelo secado al aire y colóquelo en un tubo centrífugo de dos mililitros. Coloque dos perlas de acero inoxidable de cinco milímetros en el tubo de centrífuga y transfiéralo a una trituradora de tejidos de alto rendimiento que funcione a 60 hercios durante 60 segundos. Para la extracción de ADN, agregue 800 microlitros de tampón de aislamiento nuclear preenfriado a la muestra y colóquela en un mezclador de vórtice durante cinco minutos.
A continuación, coloque la muestra en una centrífuga y centrifuga a 13,780 g durante 10 minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante con cuidado. A continuación, añada 600 microlitros de tampón P1, seguidos de cinco microlitros de ARNasa A a la muestra.
Después del vórtice, incube las muestras en un baño de agua a 65 grados centígrados durante 1,5 horas, invirtiendo los tubos dos o tres veces durante la incubación. A continuación, añade 200 microlitros de tampón P2. Homogeneizar. Y coloque la muestra en hielo durante 15 minutos.
Después, centrifugar a 13, 780 g durante 10 minutos. Aspire cuidadosamente el sobrenadante en una columna de filtro AF y centrifugue a 13,780 g durante dos minutos. Transfiera el filtrado inferior a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.
Después de calcular el volumen del filtrado, agregue 1,5 veces el volumen de tampón P3 a la muestra y agite inmediatamente para mezclar la muestra. Agregue 650 microlitros de la mezcla preparada a una columna de absorción e incube durante cinco minutos. Luego, centrifugar a 13, 780 g durante 30 a 60 segundos.
Vuelva a añadir el filtrado obtenido en la columna de absorción. Centrifugar y desechar el líquido residual. Lave la columna dos veces con 600 microlitros de solución de enjuague WB. Después de la centrifugación, deseche el líquido usado, luego coloque la columna de absorción en un tubo de recolección vacío.
Después de centrifugar la muestra a 13,780 g durante dos minutos, déjela a temperatura ambiente para que evapore el etanol residual. Transfiera la columna de absorción a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mililitros y agregue 45 microlitros de agua desionizada esterilizada precalentada a 65 grados Celsius al centro de la membrana adsorbente. Cinco minutos después, centrifugar el tubo a 13,780 g durante dos minutos a temperatura ambiente.
Luego, use un espectrofotómetro. Determine la concentración de ADN en la solución filtrada. Las relaciones de absorbancia de OD260 a OD280 oscilaron entre 1,8 y 1,84, y la cantidad de ADN superó los 100 nanogramos por microlitro, lo que confirma la buena calidad del ADN extraído.
