Para empezar, extrae el ADN del tejido vegetal y determina la concentración de ADN. Configure la reacción después de agregar todos los componentes necesarios a un tubo de centrífuga de 0,2 mililitros. Después de la amplificación del cebador, cargue tres microlitros del producto PCR y dos microlitros de un marcador de ADN de 5.000 pares de bases en los pocillos de un gel de agarosa.
Ajuste el voltaje a 120 voltios, la corriente a 400 miliamperios y ejecute la electroforesis durante 40 minutos. Utilice un versátil sistema de análisis de imágenes en gel para ver y analizar los resultados del gel. Después de ejecutar el ejemplo a través de una unidad de secuenciación, seleccione Crear un nuevo proyecto y haga clic en Aceptar para ir a la página principal del software.
En el menú Archivo, seleccione Importar y agregar muestras. Elija el archivo de formato de seguimiento de secuencia e impórtelo como el archivo que se procesará en muestras sin ensamblar. Elija Contig.
A continuación, vaya a Ensamblaje avanzado y seleccione Ensamblar en grupos. Cuando aparezca el cuadro de diálogo que solicita definir nombres, modifique el nombre del archivo en la sección Definir partes de nombre de muestra y haga clic en Ensamblar para mostrar la secuencia alineada. Seleccione Ir, luego elija Secuencia de búsqueda y haga clic en Aceptar para buscar la secuencia coincidente.
Elija Contig y, a continuación, seleccione Eliminar para eliminar los pasajes 5.8S y 28S, junto con las secuencias de baja calidad. Exporte la salida con las secuencias empalmadas para que coincidan. Seleccione una búsqueda BLAST utilizando la base de datos de nucleótidos en NCBI.
Elija la herramienta de identificación de especies y el cebador específico ITS-2, correspondiente a la Base de Datos del Genoma de la Farmacopea Global. Descargue secuencias de tres especies de Angelica y una especie de Peucedanum praeruptorum como un grupo externo del NCBI. Analice estas secuencias junto con las secuencias de resultados obtenidas.
A continuación, haga clic en Archivo. Seleccione Abrir un archivo o sesión para importar el archivo y aparecerá un cuadro de diálogo. Elija Alinear seguido de ADN y seleccione Alinear por ClustalW para la comparación de secuencias.
Vaya a filogenia y haga clic en Construir árbol de unión de vecino de prueba para generar un árbol filogenético. Los resultados de la electroforesis en gel mostraron bandas claras individuales de alrededor de 500 pares de bases para las muestras AS1, AS2 y AS3, sin bandas en el control negativo, lo que indica una amplificación exitosa del ADN extraído. Los resultados de la secuenciación identificaron Angelica sinensis con una similitud de secuencia del 100% utilizando BLAST, coincidiendo con los resultados de la base de datos GPGD.
En el análisis filogenético, las secuencias de empalme agrupadas con Angelica sinensis OR8797150.1, con un valor de soporte de bootstrap de 100, lo que demuestra la identificación como Angelica sinensis.
