Nos gustaría agradecer a los miembros del grupo de Potter para proporcionar valiosos comentarios sobre el protocolo. Este trabajo fue financiado por una beca de formación en investigación clínica de la Academia Americana de Neurología Fundación para la CMS, una beca del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS; <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> ) a JDR (GM08169 ), una beca del Instituto de NIH Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NS054809), una Ruth L. Kirschstein de Investigación del Servicio Nacional de Premio a JDR (NS060392), un NSF Efri subvención (0.836.017), el Premio de la Fundación de Investigación Traslacional Coulter, y un beca de investigación traslacional de JDR (NS007480).

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	<li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies.">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li><li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+thick+brain+slices:+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability.">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task.">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li><li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+in+networks+of+cortical+neurons.">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li><li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks.">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li><li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings.">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li><li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks.">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li><li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+plasticity+in+cortical+assemblies.">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li><li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays:+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration.">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li><li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+(1-42)+peptide+concentrations.">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li><li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies.">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li><li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density:+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen.">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li><li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates.">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li><li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy.">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li><li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts.">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li><li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays,+with+real-time+control.">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li><li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks.">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li><li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures.">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li><li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting.">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks.">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li><li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation.">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li><li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons.">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells. , (1998).</li></ol>

CMS no tiene nada que revelar.<br /&gt; JDR y leche desnatada en polvo se paga a los consultores Axion Biosystems.<br /&gt; Las tasas de presentación y las tasas de procesamiento de video para este artículo y el vídeo fueron patrocinados por la gracia sistemas multi-canal.

Este protocolo muestra instrucciones acerca de cómo la cultura y mantener las redes neuronales en arrays de micro-electrodos, así como una introducción a la grabación de las redes neuronales y estimulante. Algunos de los problemas más comunes durante la grabación de los acuerdos ambientales multilaterales también se discutieron en la sección de solución de problemas MEA. Hay variaciones ocasionales en el protocolo como discutido a lo largo y muchas veces estos cambios son utilizados para optimizar las condiciones específicas requeridas por ciertos diseños experimentales. Aunque el sistema de registro y estimulación que aquí se presenta se compone de nuestro diseño personalizado NeuroRighter 15 con el previo MCS, hay varios otros sistemas que pueden proporcionar una interfaz con las redes neuronales. La elección de una configuración particular dependerá de las necesidades experimentales específicas. Grabación simple y ejemplos de estimulación fueron en el presente Protocolo sin embargo, estas culturas de los acuerdos ambientales multilaterales se puede utilizar para proporcionar información sobre cuestiones complejas sobre la actividad sináptica y la conectividad de la red neuronal. Como se mencionó anteriormente, los trabajos en curso es la utilización de esta tecnología para estudiar procesos como la plasticidad celular, el desarrollo, la excitotoxicidad y neurodegeneración. 6-10 Por ejemplo, una publicación reciente de nuestro laboratorio mostraron objetivo reproducible aprendizaje dirigido in vitro en tiempo real con la estimulación de circuito cerrado en respuesta a la actividad actual de la red neuronal 3. Aunque las culturas MEA son a menudo meticuloso y delicado, gracias a su sencillez y accesibilidad (en comparación con animales intactos), que proporcionan un poderoso modelo para estudiar la actividad neuronal a nivel de red.

Suministros <ul><li> Desechables botella superior del filtro (150 ml, 0.2μm de tamaño de poro; Nalgene # 565 a 0.020) </li><li> Embrionarias día 18 de disolución-rata hembra embarazada </li><li> Microelectrodos (ver descripción en el protocolo, B1) </li><li> Tapas de microelectrodos array (ver descripción en el protocolo, B3) </li><li> Nylon de células colador (40μm, BD Falcon, # 352340) </li><li> Polipropileno cónico viales (estéril, 15 ml) </li><li> Poliestireno Petri (estériles, de 35 mm y 100x15mm) </li><li> Puntas de pipeta (estéril, 20μl, 200μl y 1000μl) </li><li> Pipetas serológicas (5 ml) </li></ul> Equipos: <ul><li> Gabinete de seguridad biológica / campana de flujo laminar </li><li> Contador de células </li><li> Centrífugo </li><li> Contenedor de hielo </li><li> Tijeras y pinzas de disección (esterilizada) </li><li> Microscopio de disección en una campana de flujo laminar </li><li> De mano eléctrico Pipetman </li><li> Hemocitómetro </li><li> Isofluorano y la cámara de gas </li><li> Microscopio de luz </li><li> Mano Pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) </li><li> MEA sistema de grabación (ver descripción en el protocolo, D1) </li><li> Roedores guillotina </li><li> Tri-incubadora de gas (ver descripción en el protocolo, B15) </li><li> Termo con aspirador conectado en la campana </li><li> Vórtice </li><li> Baño de agua (35-37 ° C) </li></ul> Soluciones y reactivos: BSA solución: Hacer 5% de BSA (Sigma A-9418) en tampón fosfato salino pH 7,4 y se filtran a 0.2μm. Esta solución se puede preparar con anticipación y se almacenan a 4 ° C durante varios meses. Celular Medio: Combine 90 modificado ml Dulbecco medio de Eagle (Irvine Scientific 9024), 10 ml de suero de caballo (Gibco 16.050), piruvato de sodio 1 ml (100 mM, Gibco 11.360), 250 l Glutamax (Gibco 35.050), y la insulina (concentración final de 2,5 mg / ml, Sigma I-5500) a continuación, pasar a través de un 0,2 micras filter.22 caliente y equilibrar el medio celular en la incubadora antes de su uso. Disección de solución para la preparación de solución de papaína: 23 <table border="1"><tr><td> Disección de la solución (100 ml de archivo) </td><td> Se combinan en el orden, filtro de 0,22 micras y se almacenan a 4 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> Componente </td><td> Ml de volumen </td><td> La concentración final (mM) </td></tr><tr><td> Agua doblemente destilada </td><td> 91.175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M de MgCl2 </td><td> 0.58 </td><td> 5,8 mM </td></tr><tr><td> 1 M de CaCl2 </td><td> 0.025 </td><td> 0,25 mm </td></tr><tr><td> HEPES 0,5 M </td><td> 0.32 </td><td> 1,6 mM </td></tr><tr><td> 0,5% de rojo fenol </td><td> 0.2 </td><td> (0,001%) </td></tr><tr><td> 0,1 N NaOH </td><td> 0.2 </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4.5 </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3.0 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> 0,1 M de ácido quinurénico </td><td> 1.0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1.0 </td><td> 0,05 mM </td></tr></table> Esta solución se puede preparar con anticipación y se almacenan a 4 ° C durante varios meses. DNAsa I: Invitrogen (# 18047019). Alícuotas de 50μl se destello congeladas y almacenadas a -80 ° C. Una alícuota se descongela en la campana de flujo laminar antes de iniciar el proceso de disociación celular. Solución salina equilibrada de Hank: Sigma (# 4891). Una solución 1X es preparado en agua desionizada, estéril filtrado a 0.2μm y almacenadas a 4 ° C. Hibernate solución: Preparar el día de cultivo. Combine 98 ml medio L-15 (Invitrogen 11415) con 2 ml de suplemento de B-27 (50X, Invitrogen # 17504) y el filtro de 0,2 micras. Laminina solución: Preparar el día de cultivo. Diluir 20μl de laminina (1mg/ml, Sigma L-2020) en 980 l medio celular para una concentración final de 0.02mg/ml. Alícuotas de 20 l de la laminina (1mg/ml) se almacenan a -80 ° C y descongelar antes de su uso. Descongelación se producen en la parte superior del banco y no en el baño de agua en rápido proceso de deshielo en ocasiones puede conducir a la gelificación de la laminina. Solución de papaína: 23 Ml de solución caliente 10 disección (arriba) a 30-32 º C. Añadir 200 unidades de papaína (Sigma P-4762) y 1,6 mg L-cisteína (Sigma C-7880). Ajustar el pH a 7,4 con unos 14 l de NaOH 0,1 N. Se incuba durante unos 30 minutos hasta que la solución cllos oídos, filtro de 0,2 micras, congelar flash con nitrógeno líquido en alícuotas de 2 ml en 15 ml de polipropileno estéril frascos cónicos y almacenar a -80 ° C. Descongelar una alícuota a 35-37 ° C antes de comenzar el protocolo. Polietilenimina (PEI) solución: 13 100 l de PEI (50% w / v, Sigma P-3143) se diluye en 100 ml de tampón de borato de sodio (0,1 M pH 8,4, Sigma B-9876) para una concentración final de 0,05% w / v. Filtro estéril de 0,2 micras. Esto puede ser preparado con antelación y se almacenan a 4 ° C durante meses. Estéril con agua desionizada: Autoclave y dejar enfriar a temperatura ambiente antes de su uso. Tripsina (0,25% con EDTA, Gibco 25200): Alícuotas de 1 ml se destello congeladas y almacenadas a -80 ° C. Alícuotas se descongelan en el baño de 35-37 ° C el agua antes de su uso.

how to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (meas)

Durante el último siglo, muchos neurocientíficos de todo el mundo han dedicado su vida a la comprensión de cómo las redes neuronales funcionan y por qué dejar de trabajar en diversas enfermedades. Los estudios han incluido observaciones neuropatológicas, microscopía de fluorescencia con el etiquetado de genética, y el registro intracelular, tanto en neuronas disociadas y preparaciones rebanada. Este protocolo describe otra tecnología, que consiste en cultivar cultivos de neuronas disociadas en matrices de micro-electrodos (también llamados electrodos múltiples arrays, AAM). Hay muchas ventajas de usar este sistema frente a otras tecnologías. Disociarse cultivos neuronales en los acuerdos ambientales multilaterales proporcionan un modelo simplificado en el que se puede manipular con la actividad de red secuencias de estimulación eléctrica a través de múltiples electrodos de la matriz. Debido a que la red es pequeña, el impacto del estímulo se limita a las áreas observables, que no es el caso de las preparaciones intactas. Las células crecen en una monocapa de hacer cambios en la morfología fácil de controlar con técnicas de imagen. Finalmente, los cultivos en los acuerdos ambientales multilaterales pueden sobrevivir durante más de un año in vitro que elimina las limitaciones de tiempo claro inherentes a las técnicas de cultivo de otros 1. Nuestro laboratorio y otros en todo el mundo están utilizando esta tecnología para hacer preguntas importantes acerca de las redes neuronales. El objetivo de este protocolo es proporcionar la información necesaria para la creación, el cuidado, la grabación de la estimulación eléctrica de las culturas y en los acuerdos ambientales multilaterales. En las redes in vitro proporcionan un medio para pedir fisiológicamente preguntas relevantes en la red y los niveles celulares que conducen a una mejor comprensión de la función cerebral y la disfunción.

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How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs

Este protocolo proporciona la información necesaria para la creación, el cuidado, la grabación de la estimulación eléctrica de las culturas y en los acuerdos ambientales multilaterales.<em&gt; In vitro</em&gt; Redes proporcionan un medio para pedir fisiológicamente preguntas relevantes en la red y los niveles celulares que conducen a una mejor comprensión de la función cerebral y la disfunción.

Cómo Cultura, Registro y estimular las redes neuronales en matrices de micro-electrodos (MEA)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

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How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

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