Biz protokol sağlamak için paha biçilmez bir yorum Potter grup üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Amerikan Nöroloji Vakfı Akademisi CMH klinik araştırma eğitim bursu, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS bir burs tarafından finanse edildi <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> JDR (GM08169) ), NIH Ulusal Nörolojik Hastalıklar Enstitüsü ve hibe Stroke (NS054809), JDR için bir Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü (NS060392), bir NSF EFRI hibe (0.836.017), Coulter Vakfı Translasyonel Araştırma Ödülü, ve JDR translasyonel araştırma bursu (NS007480).

<ol>
	<li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies.">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li><li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+thick+brain+slices:+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability.">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task.">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li><li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+in+networks+of+cortical+neurons.">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li><li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks.">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li><li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings.">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li><li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks.">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li><li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+plasticity+in+cortical+assemblies.">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li><li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays:+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration.">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li><li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+(1-42)+peptide+concentrations.">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li><li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies.">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li><li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density:+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen.">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li><li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates.">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li><li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy.">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li><li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts.">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li><li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays,+with+real-time+control.">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li><li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks.">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li><li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures.">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li><li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting.">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks.">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li><li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation.">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li><li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons.">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells. , (1998).</li></ol>

CMH ifşa etmek için hiçbir ilgisi yoktur.<br /&gt; JDR ve SMP Axion Biosystems için danışmanlar ödenir.<br /&gt; Bu yazı ve video gönderme ücretleri ve video işleme ücretleri nezaketle Multi-Channel Sistemleri tarafından desteklenen edildi.

Bu protokol, kültürü ile ilgili talimatlar gösterir ve nöron ağlarının yanı sıra mikro-elektrod kayıt ve nöron ağları uyarıcı bir giriş korumak. ÇÇA kayıt daha yaygın sorunlardan bazıları da MEA sorun giderme bölümünde ele alındı. Boyunca tartışılmış ve çoğu zaman bu değişiklikler bazı deneysel tasarımları gerektirdiği özel koşullar optimize etmek için kullanıldığı gibi, protokolde zaman zaman farklılıklar vardır. Burada sunulan kayıt ve MCS preamp NeuroRighter 15 tasarlanmış özel oluşan uyarıcı sistem olmasına karşın, birden fazla nöron ağları ile bir arayüz sağlayabilir diğer sistemler vardır. Belirli bir kurulum seçimi spesifik deneysel gereksinimlerine bağlı olacaktır. Ancak bu kültürlerin ÇÇA üzerinde basit bir kayıt ve stimülasyon örnekleri sinaptik aktivite ve nöronal ağ bağlantısı ile ilgili karmaşık sorular içgörü sağlamak için kullanılabilir, bu protokolde verilmiştir. Yukarıda belirtildiği gibi, devam eden çalışmaları hücresel plastisite gibi süreçleri incelemek için bu teknolojiyi kullanan, geliştirme, eksitotoksisitesi ve nörodejenerasyon 6-10 Örneğin, bizim laboratuvarda yeni bir yayın tekrarlanabilir hedefe, gerçek zamanlı kapalı döngü stimülasyonu ile in vitro öğrenme yönetti gösterdi nöronal ağ etkinliği 3 yanıt. MEA kültürler genellikle finicky ve hassas olmasına rağmen, basitlik ve erişilebilirlik (sağlam hayvanlara kıyasla) sayesinde, bir ağ düzeyinde nöronal aktivitenin çalışmak için güçlü bir model sağlar.

Sarf Malzemeleri <ul><li> Tek kullanımlık şişe top filtresi (150ml, 0.2μm gözenek boyutu; Nalgene # 565-0020) </li><li> Embriyonik gün 18 zamanlı hamile kadın sıçan </li><li> Mikroelektrod diziler (B1, protokol açıklamayı görmek) </li><li> Mikroelektrod dizi kapakları (protokol, B3 açıklama bakınız) </li><li> Naylon hücre süzgeç (40μm, BD Falcon, # 352.340) </li><li> Polipropilen konik şişeleri (steril, 15ml) </li><li> Polistiren Petri kapları (35mm, steril ve 100x15mm) </li><li> Pipetleyin ipuçları (steril 20μl, 200μl ve 1000μl) </li><li> Serolojik pipetleri (5ml) </li></ul> Ekipman: <ul><li> Biyolojik güvenlik kabini / laminer akış kaputu </li><li> Hücre sayıcı </li><li> Santrifüj </li><li> Buz konteyner </li><li> Diseksiyon makas ve forseps (steril) </li><li> Laminer akış kaput mikroskop Diseksiyon </li><li> Taşınabilir elektrik Pipetman </li><li> Hemasitometre </li><li> Isofluorane ve gaz odasında </li><li> Işık mikroskobu </li><li> El Pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) </li><li> MEA kayıt sistemi (bkz. protokol, D1 açıklama) </li><li> Kemirgen Giyotin </li><li> Tri-gaz inkübatör (protokol, B15 açıklama bakınız) </li><li> Vakum şişesi kaputu bağlı aspiratör </li><li> Girdap </li><li> Su banyosu (35-37 ° C) </li></ul> Çözümler ve Reaktifler: BSA çözüm: % 5 BSA fosfat (Sigma A-9418) tuzlu pH 7.4 ve 0.2μm süzülmüş tamponlu. Bu çözüm, 4 ° C&#39;de birkaç ay önceden hazırlanan ve saklanan olabilir. Cep Orta: 90 ml Dulbecco&#39;nun Kullanıcı modifiye Eagle Kullanıcı orta (Irvine Bilimsel 9024), 10 ml at serumu (Gibco 16050), 1 ml sodyum piruvat (Gibco 11.360, 100 mM), 250 ul GlutaMAX (Gibco 35.050), ve insülin (final konsantrasyon birleştirin 2.5 mg / ml, Sigma I-5500) sonra 0.2 mikron filter.22 Sıcak geçmesine ve kullanmadan önce inkübatör hücre orta dengelenmesi. Diseksiyon papain çözüm hazırlamak için çözüm: 23 <table border="1"><tr><td> Diseksiyon çözüm (100ml stok) </td><td> 4, filtre 0,22 mikron ve mağaza birleştirin ° C </td><td></td></tr><tr><td> Bileşen </td><td> Cilt ml </td><td> Final Konsantrasyon (mM) </td></tr><tr><td> Çift distile su </td><td> 91,175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0,58 </td><td> 5.8 mM </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 0,025 </td><td> 0,25 mm </td></tr><tr><td> 0,5 M Hepes </td><td> 0,32 </td><td> 1.6 mm </td></tr><tr><td> % 0.5 fenol kırmızısı </td><td> 0,2 </td><td> (% 0.001) </td></tr><tr><td> 0.1 N NaOH </td><td> 0,2 </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4,5 </td><td> 90 mm </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3,0 </td><td> 30 mm </td></tr><tr><td> 0.1 M Kynurenic asit </td><td> 1,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1,0 </td><td> 0.05 mm </td></tr></table> Bu çözüm, 4 ° C&#39;de birkaç ay önceden hazırlanan ve saklanan olabilir. DNAz I: Invitrogen (# 18.047.019). 50μl alikotları -80 ° C&#39;de dondurulmuş flaş ve saklanır Bir kısım hücre disosiasyon süreci başlamadan önce laminer akış kaputun içindeki çözülmüş. Hank dengeli tuz çözeltisi: Sigma (# 4891). 1X çözüm steril 0.2μm süzülmüş ve 4 saklanan ° C, deiyonize su ile hazırlanır Hazırda Bekleme çözüm: Kültür, günü hazırlayın. 98 ml L-15 orta (Invitrogan 11415) 2 ml B-27 takviyesi (50X, Invitrogen # 17504) ve 0.2 mikron filtre ile birleştirin. Laminin çözüm: Kültür, günü hazırlayın. 0.02mg/ml son bir konsantrasyon için 980 ul hücre orta laminin 20μl sulandırınız (1mg/ml, Sigma L-2020). 20 ul alikotları laminin (1mg/ml) -80 ° C&#39;de saklanır ve kullanımdan hemen önce çözülmüş. Çözülme tezgah üstünde gerçekleşmesi gereken ve su banyosu gibi hızlı çözülme bazen laminin jelleşme yol. Papain çözüm: 23 30-32 Sıcak 10 ml (üstte) diseksiyonu çözüm ° C 200 adet papain ekle (Sigma P-4762) ve 1.6 mg L-sistein (Sigma C-7880). Ul yaklaşık 14 0.1 N NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın. Çözüm cl kadar yaklaşık 30 dakika boyunca inkübekulaklar, filtre 0.2 mikron, -80, 15 ml polipropilen steril konik şişeleri ve mağaza, 2 ml alikotları sıvı nitrojen ile flash dondurma ° C 35-37 ° C protokolü başlamadan önce bir kısım çözülme. Polietilenimin (PEI) çözüm: 13 PEI, 100 ul (% 50 w / v, Sigma P-3143), bir final konsantrasyon% 0.05 w / v için 100 ml sodyum borat tamponu (0.1 M, pH 8.4, Sigma B-9876) ile seyreltilir Steril filtre 0.2 mikron. Bu, önceden hazırlanmış ve ay süreyle 4 ° C&#39;de saklanabilir. Steril de-iyonize su: Otoklav ve kullanmadan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Tripsin (EDTA, Gibco 25200 ile% 0.25): 1ml alikotları -80 ° C&#39;de dondurulmuş flaş ve saklanır Alikot kullanılmadan önce 35-37 ° C su banyosunda çözülmüş.

how to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (meas)

Geçen yüzyıl boyunca, dünyanın pek çok Nörobilimadamları nöral ağların nasıl çalıştığını anlamak için hayatlarını adamış ve çeşitli hastalıkların neden çalışmayı durdurur. Çalışmalar nöropatolojik gözlem, genetik etiketleme ile floresan mikroskopi ve ayrışmış nöronlar ve dilim hazırlıkları hem de hücre içi kayıt dahil ettik. Bu protokol, mikro-elektrot dizileri (aynı zamanda multi-elektrot diziler, ÇÇA denir) ayrışmış nöronal kültürlerin büyüyen içeren bir başka teknoloji tartışıyor. Diğer teknolojilere kıyasla, bu sistemi kullanarak birden fazla avantajı vardır. ÇÇA üzerindeki kontrol grubuyla nöronal kültürlerin ağ aktivite dizinin birden fazla elektrotlar üzerinden elektrik stimülasyonu dizileri ile manipüle edilebilir olan basitleştirilmiş bir model sağlar. Ağ küçük olduğundan, stimülasyon etkisi gözlemlenebilir alanları, bozulmadan hazırlıklarında söz konusu değildir sınırlıdır. Çeşitli görüntüleme teknikleri ile izlemek için morfolojisi kolay değişiklik yapmadan bir tek tabaka hücreleri büyümek. Son olarak, in vitro olarak bir yıl boyunca diğer kültür teknikleri ile doğasında herhangi bir net zaman sınırlamaları kaldırır ÇÇA üzerindeki kültürleri hayatta. 1 Dünya çapında laboratuvar ve diğerleri nöron ağları hakkında önemli sorular sormak için bu teknolojiyi kullanıyor. Bu protokolün amacı, bakımını kurma gelen kayıt ve elektriksel uyarıcı ÇÇA üzerindeki kültürleri için gerekli bilgileri sağlamak için, ağ fizyolojik ilgili sorular soran ve daha iyi anlaşılmasına yol açan hücre düzeyine için bir araç sağlayan in vitro ağlarda beyin fonksiyonu ve disfonksiyonu.

Watch this Scientific Journal Video about How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs at JoVE.com

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs

Bu protokol kurmak, bakımını, kayıt ve elektriksel uyarıcı ÇÇA üzerindeki kültürleri için gerekli bilgileri sağlar.<em&gt; In vitro</em&gt; Ağlar, ağ ve hücre düzeyine beyin fonksiyonu ve disfonksiyonu daha iyi anlaşılmasına yol açan fizyolojik ilgili sorular sorarak için bir araç sağlar.

Nasıl Kültür, Kayıt ve mikro-elektrot Diziler Sinir Ağları Teşvik (ÇÇA)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

how-to-culture-record-stimulate-neuronal-networks-on-micro-electrode

Research

JoVE Journal

Biology

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

54.3K Görüntüleme.  Emory University School of Medicine. Bu protokol kurmak, bakımını, kayıt ve elektriksel uyarıcı ÇÇA üzerindeki kültürleri için gerekli bilgileri sağlar. In vitro Ağlar, ağ ve hücre düzeyine beyin fonksiyonu ve disfonksiyonu daha iyi anlaşılmasına yol açan fizyolojik ilgili sorular sorarak için bir araç sağlar.