Esta investigación fue financiada en parte por el nuevo director de los NIH Programa Premio a la Innovación, que forma parte de la hoja de ruta del NIH para la investigación médica, a través de la subvención número 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. agradecer a la NSF para una Beca de Investigación de Tesis.

1. Pre-procesamiento de los tejidos de preparación <ol class="lalpha"><li> Antes de utilizar este protocolo, se debe tener ya descelularizada el tejido de elección. Para este ejemplo, fresca de porcino y muestras humanas pericardio descelularizada utilizando enjuagues hipotónica e hipertónica en agua desionizada (DI) y dodecilsulfato sódico (SDS). </li><li> En concreto, primero se deben lavar el pericardio porcino en agua DI durante 30 minutos, luego revolver continuamente en SDS al 1% en tampón fosfato salino (PBS) durante 24 horas, seguido de un 5 horas de agua DI enjuague. Para pericárdica humanos, primero enjuague con agua DI durante 30 minutos, luego revolver continuamente en SDS al 1% en PBS durante 60-65 horas, seguido de una noche a la mañana di enjuague. Eliminar todos los ejemplares de su solución final y aclarar de nuevo bajo el chorro de agua DI 1. </li><li> Para verificar descelularización, extraer una pequeña cantidad, fresco congelarlo en un medio de octubre de congelación, y tener 10 secciones de tejido m cada 100 m en toda la muestra para el examen a través del análisis histológico, como se informó anteriormente 34-36. </li><li> El uso de hematoxilina y eosina (H &amp; E) para examinar el tejido de la ausencia de núcleos. También se podría utilizar un fluorescente Hoescht 33342 mancha (1,0 mg / mL) de ADN para verificar la H &amp; E produce, brevemente, fijar las secciones, rehidratar y enjuague con agua ya las manchas durante 10 minutos y luego enjuague bien y guardar en la oscuridad. Alternativamente, se puede utilizar un kit como la sangre y el kit de Qiagen DNeasy tejido, que está diseñado para cuantificar el contenido total de ADN de una muestra. </li></ol> 2. Preparación de inyectables ECM <ol class="lalpha"><li> Liofilización <ol class="lroman"><li> Después de una preparación adecuada, congelar las muestras descelularizada con nitrógeno líquido o mediante el almacenamiento a -80 ° C. Liofilizar las muestras hasta que esté completamente seco. Dependiendo de su sistema y el contenido de agua de las muestras, esto puede tomar de 12 a 72 horas. </li></ol></li><li> Molienda <ol class="lroman"><li> Una vez completamente seco, un molino Wiley Mini se utiliza para moler el ECM seca en un polvo fino. Seleccione el tamaño del tamiz adecuado para sus propósitos, aquí, la malla de calibre 40 se utiliza. Una vez que la mayoría de la muestra ha llegado a través del filtro, retire el recipiente de recogida con el polvo molido ECM. Si sólo hay una pequeña muestra, el resto de la muestra puede ser extraída de la planta en una variedad de formas, aquí, un Q-tip se utiliza para eliminar el ECM atrapado detrás de las hojas de la planta estacionaria. </li><li> Asegúrese siempre de que el molino está limpio y libre de residuos. También es importante asegurarse de que tanto el molino y la muestra está totalmente seca, y cualquier resto de humedad hará que el ECM para agregar y se agrupan, la prevención de la molienda de éxito. El ECM puede recoger la humedad del aire y por lo tanto deben ir directamente desde el liofilizador a la fábrica. </li></ol></li><li> Digestión <ol class="lroman"><li> Para formar el ECM inyectables, el polvo se digiere la pepsina. El siguiente protocolo fue modificado a partir de Freyetes, et al. (2). </li><li> Es importante mantener un producto tan estéril como sea posible, ya que se inyecta en vivo y la contaminación puede causar complicaciones. Por lo tanto, utilizar los viales estériles y con un peso cucharas y filtro de todas las soluciones antes de su uso. Un paso de liofilización después de la molienda y antes de la digestión también ayudará a mantener la esterilidad. </li><li> Pesar la cantidad necesaria de polvo de ECM en un vial de centelleo apropiado. Por el volumen total de menos de 1 ml, se recomienda que utilice un vial de 2 ml y para grandes volúmenes, a 20 ml frasco. Esto asegura que hay suficiente líquido en el fondo del frasco para mezclar con eficacia. </li><li> Pesar la cantidad deseada de la pepsina en un vial de centelleo. Añadir 0,1 M de tal manera que la pepsina a una concentración de 1 mg / ml de HCl. Asegúrese de que la pepsina se haya disuelto completamente (sin partículas) antes de usar esto puede ser acelerada por agitación la solución de pepsina. </li><li> Añadir la solución de pepsina / HCl en el vial de centelleo con el polvo de ECM para que el ECM se encuentra en una concentración de 10 mg / ml. </li><li> Mezcle una solución de forma continua durante 60-65 horas, periódicamente raspando los lados del vial con una cuchara o una espátula de peso. </li></ol></li><li> Regulación del pH <ol class="lroman"><li> Este paso se realiza para llevar el material de la matriz líquido a pH fisiológico y para inactivar la pepsina, evitando que cortando el ECM más. De nuevo, asegúrese de usar las soluciones de filtrado hecho con agua Millipore. </li><li> 1 M se añade NaOH a 1 / 10 del volumen original. Probar el pH en este punto y añadir pequeñas cantidades (2-10 l) de NaOH o HCl tales que el pH deseado (7,4) se alcanza. Lleve un registro de todas las pequeñas cantidades añadido para la neutralización o eliminarse para medir el pH. Una vez que la solución ha sido neutralizada, añadir 10x PBS a 1 / 10 del volumen final (1 / 9 del volumen actual). Determinar la concentración de la ECM inyectable y luego añadir 1x PBS para llegar a co final deseadancentration, aquí 6 mg / ml. </li><li> Caracterización de la ECM inyectable se puede hacer a través de SDS-PAGE, ensayo colorimétrico Blyscan GAG, y espectroscopia de masas. </li><li> En este punto, el material de la matriz puede ser inyectado en vivo para formar un andamiaje para ingeniería de tejidos del miocardio. </li></ol></li><li> Biotina-Etiquetado <ol class="lroman"><li> El ECM se pueden etiquetar con biotina antes de la inyección para una fácil visualización de la ECM inyecta. </li><li> Prepare una solución de 10 mM de biotina y añadir a la ECM inyectable en una proporción de 0.3mg/mg. El ECM se debe a la concentración deseada para la inyección. Si se inyectan en una concentración de 6 mg / ml, añadir 40 Biotina L por 1 ml de ECM. Antes de la inyección, mantener la solución de biotina-ECM en hielo durante al menos 1 hora. </li></ol></li><li> Todos los pasos del proceso se puede realizar a temperatura ambiente. Para mantener la matriz inyectable de gelificación, el paso de ajuste del pH se puede hacer sobre el hielo. </li></ol> 3. Las inyecciones de miocardio <ol class="lalpha"><li> Inyección de preparación <ol class="lroman"><li> De las ratas hembras (225-250 g) se usa aquí, el 75 inyecciones de L de pH 7,4 inyectable ECM se prepararon en 0,1 ml jeringas con punta de agujas de calibre 30. Si las ratas macho (375-400 g) fueron utilizados, 90 l podría ser inyectada. </li><li> Todos los suministros quirúrgicos deben ser esterilizados antes de la cirugía, aquí usamos una bolsa de autoclave quirúrgica que contiene todas las herramientas necesarias. </li></ol></li><li> En el día de la cirugía, una Harlan Sprague-Dawley, ratas se anestesia con isofluorano al 5%, intubación con un otoscopio, y luego se mantuvo en el 2,5% isoflurano durante todo el procedimiento. </li><li> Añadir ungüento de lágrimas artificiales para los ojos del animal para proteger contra la sequedad y el cabello. Administrar 3 ml de solución de Ringer lactato para la hidratación durante la cirugía. Esto debe hacerse mediante una inyección subcutánea en el abdomen inferior. </li><li> Colocar el animal en decúbito supino sobre la mesa de operaciones y la cinta suavemente las extremidades. Use tijeras para quitar el pelo en el abdomen y el pelo de vacío libre antes de fregar. </li><li> Hacer una serie de pequeñas inyecciones (aproximadamente 50 l cada uno) de lidocaína al 2% a lo largo de una diagonal desde el proceso de zyphoid a la baja del lado derecho del abdomen. Luego frote tres veces con betadine, comenzando en el centro y hacia el exterior. Repita con el 70% de etanol. Cubrir al animal con un paño quirúrgico, con una ventana circular pre-hechas, seguro con pinzas toalla, si es necesario. </li><li> El uso de un bisturí N º 10 hacen una incisión de 3-4 cm de la apófisis xifoides a la parte inferior del lado derecho del abdomen. Localizar proceso xifoides y diseccionar verticalmente hacia abajo a través del músculo a la derecha, teniendo cuidado de evitar el vaso grande de la derecha. Una vez que ha diseccionado a través del músculo, use tijeras para cortar lateralmente a través del músculo, dejando al descubierto el diafragma. Tenga cuidado de evitar el hígado. </li><li> Utilizando una longitud de 36 pulgadas de 3-0 sutura Vicrile y un par de pinzas hemostáticas, unidad de una aguja a través del proceso de zyphoid y tirar de la sutura a medio camino. Cinta de los extremos de la sutura en conjunto y fijar que a un punto por encima y detrás del animal esencialmente el levantamiento de la zyphoid y exponer el diafragma. Con otra longitud de 36 pulgadas de 3-0 sutura Vicrile, la unidad de una aguja a través del músculo más cercano a la apófisis xifoides y, una vez más, pasar a través y fijar los extremos a otro punto a la derecha de la mesa de operaciones, exponiendo completamente la cavidad quirúrgica. </li><li> En este punto, usted debería ser capaz de ver el corazón a través del diafragma. El uso de un pequeño par de dientes de rata microforceps, toma el centro del diafragma, tire de él hacia usted y hacer una pequeña incisión con tijeras de punta roma. Es muy importante utilizar unas tijeras muy contundente con el fin de evitar meter los pulmones. Una vez que el agujero se ha hecho, los pulmones, se retrae, lo que le permite hacer una incisión de 2-3 cm verticalmente a través del diafragma para visualizar el corazón. </li><li> Inserte una de 3 pulgadas Q-tip a la izquierda de la cavidad para empujar a los pulmones del camino. Utilice una abrazadera toalla para asegurar el Q-tip en su lugar. Utilice otro Q-tip para mover el pulmón derecho del camino a fin de localizar el saco pericárdico. Con un par de microforceps y un par de grandes pinzas dentadas, corte a través del saco pericárdico, la exposición del ápice del corazón. Si el animal ha sido sometidos previamente a un procedimiento de miocardio, el pericardio ya va a estar ausente. </li><li> Coge la punta del corazón con la microforceps diente de ratón y se inyecta el material de la matriz líquida de un tercio de la subida desde el vértice. Insertar la aguja paralela a la superficie del epicardio y se inyecta con el borde biselado de la aguja a la izquierda. Asegúrese de evitar la gran vena cardíaca. Espere un par de segundos antes de retirar la aguja. Usted debe ver a un blanqueamiento de los tejidos en el sitio de la inyección. </li><li> Limpieza de sangre en la cavidad y retire la abrazadera toalla y Q-tip que sostenía el pulmón derecho. Use microhemostats curva y la ratadiente microforceps para cerrar el diafragma. Haga un nudo inicial y luego usar las pinzas dentadas y microhemostats para cerrar el diafragma con una sutura continua y una aguja cónica. Antes de cerrar completamente, inserte PE160 tubos de succión y el uso de una jeringa de 10 ml para evacuar la cavidad torácica cuando la sutura se tensa. </li><li> Cuando está debidamente evacuada y cerrada, el diafragma debe ser cóncava. Un diafragma convexo indica que aún hay aire en la cavidad. </li><li> En este punto el isoflurano puede ser rechazada al 1%. </li><li> Sacar los dos puntos de sutura 3-0 Vicrile la celebración de la cavidad abierta. El uso de agua estéril para hidratar el músculo, eliminando el exceso de distancia con un Q-tip o una gasa estéril. Use una nueva longitud de 3-0 sutura para cerrar la capa muscular con suturas intermitentes. </li><li> En este punto, el isoflurano se puede apagar. </li><li> Limpie el área con agua estéril y grapas utilizar para cerrar la piel. Si grapas interferir con el estudio, 5-0 sutura prolina también se puede utilizar. En ese caso, utilice un corte inversa (RC) para cerrar la aguja de la piel con suturas intermitentes. En ambos casos, la mancha de pegamento quirúrgico más se cierra la incisión. </li><li> Usar un Q-tip para ungir el lugar de la incisión con un ungüento antibiótico triple. </li><li> Que el animal pueda recuperarse bajo oxígeno al 100%. </li><li> Cuando los animales comienza a respirar en todo el ventilador, retire el tubo de la tráquea. </li><li> Una vez que los animales son esternal, administrar una inyección subcutánea de 0,05 mg / kg de hidrocloruro de buprenorfina y devolverlos a su jaula con una toalla estéril. </li><li> Los animales deben recibir después de la operación de observación y cuidado. </li><li> En los puntos de tiempo de interés, los animales son sacrificados y los corazones para su análisis. Corta las secciones transversales del eje se toman y se puede teñir con hematoxilina y eosina (H &amp; E) para el análisis de los tejidos bruto. En los puntos de tiempo, la región inyectada aparecerá como una red de color rosa y fibroso que se ha extendido intersticial. En momentos posteriores, se observará un flujo de células y una eventual degradación de la matriz de inyección después de 2 a 3 semanas. Si el ECM fue marcado con biotina antes de la inyección, puede ser más directa visualizado por tinción de la biotina con el conjugado HRP-estreptavidina. La tinción inmunohistoquímica puede ser utilizado para identificar células o estructuras específicas de la región de la inyección, aquí las diapositivas se han co-teñidos con un isolectina FITC-conjugado que se une a las células endoteliales y verde fluorescente y un anticuerpo anti-actina de músculo liso con una secundaria AlexaFluor anticuerpos que los informes del SMC en rojo. </li></ol> 4. Resultados representante Caracterización previa de los materiales de matriz preparada de esta manera demostró la retención de una gran variedad de macromoléculas. En concreto, múltiples proteínas fibrosas y glicoproteínas fueron identificados a través de espectrometría de masas (Tabla 1). Si los materiales de matriz procesados ​​de acuerdo con este protocolo se encuentran ya no contienen un complejo conjunto de macromoléculas, podría ser que el protocolo descelularización empleado es demasiado dura. Una vez totalmente liofilizado, el secado ECM pericárdico parece muy rígido, papel arrugado. Otros tipos de tejidos se asemejan a los cacahuetes de embalaje. Si bien molido, el MEC debe caer por el tamiz y se recogerán en el frasco en la parte inferior. Si hay humedad presentes en la muestra, el ECM se agrupan y se atascan en la cámara de molienda. Después de la digestión, la solución ECM debe ser de un color lechoso y completamente libre de partículas visibles. También será ligeramente más viscoso que el solo HCl. Si el ECM no digiere bien, todavía habrá partículas de mayor tamaño en el vial, como alternativa, el ECM se puede bloquear de la solución. Después de ajustar el pH, no hay ningún cambio visible en la solución, y el ECM sigue siendo un líquido turbio, homogéneo. Si comienza a gel, la viscosidad aumenta y será difícil o imposible de extraer el material en una jeringa. Si esto sucede, realice el paso de ajuste de pH en el hielo, con pre-enfriado soluciones. Una vez que las inyecciones se han preparado, mantenerlos en hielo hasta su uso. Si la inyección se realiza correctamente, la región alrededor de la punta de la aguja blanquea y un pequeño bolo es visible. Si esto no se observa, la inyección puede haber entrado en la cámara en lugar de en la pared. Cuando la sutura de los animales hasta después de la inyección, el cierre de cuidado de la membrana es el paso más importante. Si se hace correctamente, el diafragma se firme contra los pulmones y aparecerá cóncavo. Si hay algún aire que queda dentro de los pulmones, el diafragma se mantendrá convexa, o tener un área en la que se hincha. Al examinar la histología de la región de la inyección en un punto de tiempo temprano (30 minutos a 4 horas después de la inyección), uno debe ver a un área rosada, fibrosa que carece de células éste es el material de la matriz a montar después de la inyección (Figura 2) . La red a menudo se disemina intersticial y puede estar presente a lo largo de muchas secciones. A possexplicación ible para ver sólo un área muy pequeña de la matriz del gel es que una parte de la inyección se perdió el objetivo de intramuros y se inyectarse en la cámara de baja tensión o escape de la ubicación de la inyección. Además, dependiendo del tiempo de gelificación, la difusión intersticial puede variar. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) resultados. (A) estándar de peso molecular. (B) cola de rata de colágeno tipo I (2,5 mg / ml) en comparación con la humana solubilizada (C) y porcino (D) pericárdico ECM (7 mg / mL). Tenga en cuenta la presencia de colágeno, así como varias otras proteínas y péptidos en las muestras de la matriz del pericardio. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109table1.jpg" alt="Tabla 1" /> Tabla 1. Componentes de ECM identificado con la espectroscopia de masas. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 inyecciones de miocardio:. Gelificación en vivo. H &amp; E tinción de los derechos humanos (A) y porcino (B) inyecciones pericárdico matriz de gel que tienen en vivo después de 45 minutos. Las flechas indican la ubicación de la matriz, manchada de rosa más claro que el miocardio. Barra de escala es de 500 micras. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Infiltración de células vasculares. Manchas fluorescentes para los buques en el ser humano inyectado (CA) y porcino (DF) geles matriz en dos semanas. Las células endoteliales son etiquetados verde (A, D), mientras que las células del músculo liso están marcados de color rojo (B, E). Imágenes fusionadas se muestran en la barra de C y F. Escala es de 100 micras. Las líneas de puntos blancos indican la zona de la inyección de la matriz, según lo determinado por el análisis de H &amp; E de la sección cercana. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Las células madre dentro de la región de la inyección de la matriz. A Hoescht tinción de los núcleos (azul) y c-kit (verde) identifica las células madre en el ser humano (A) y porcino (B) las regiones de la inyección de la matriz. Barra de escala es de 50 micras.

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Uso de Animales: Todos los experimentos en este estudio se realizaron de acuerdo con las directrices publicadas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Universidad de California, San Diego y la Asociación Americana para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio.

Este método permite la generación de origen biológico, andamios inyectables para la ingeniería de tejido miocárdico. Aunque estos métodos fueron desarrollados inicialmente para la fabricación y las pruebas in vivo de una matriz de gel de miocardio y que aquí se presenta con una matriz de gel pericárdico, este protocolo puede ser adaptado para su uso con cualquier tejido, siempre que el tejido puede ser apropiada descelularizada. Descelularización se debe realizar y verificados antes de la uti...

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		<th>Comment</th>
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<tr>
<td>Reagents:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pepsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>p6887-1G</td>
<td>Lyophilized </td>
</tr>
<tr>
<td>Biotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>21217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutravidin-HRP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>21130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equipment: </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wiley Mini Mill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>3383L10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Labconco Lyophilizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labconco, Inc</td>
<td>7670520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical supplies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Purdue Products, L.P.</td>
<td>67618-154-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lactated Ringers Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>003966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KY Jelly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>28658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lidocaine, 2%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>17767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buprenorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd.</td>
<td>12496-0757-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Artificial tear ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>NC9860843</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triple antibiotic ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>19082795</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>60307-120-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Otoscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>008699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stop cock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>006245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-0 Vicrile suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>J327H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-0 Proline suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>s-1173</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Reverse cutting (RC) needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>8684G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microhemostats </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>13013-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat tooth microforceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11084-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>No. 10 scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10110-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blunt scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14108-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sharp, curved scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14085-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Large, serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>1106-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE160 suction tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427430 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clippers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MWI</td>
<td>21608</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Skin staples/stapler </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>PRR35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>General supplies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stir plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 M HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 M NaOH</td>
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<td>10x PBS</td>
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<td>0.1 mL syringes</td>
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<td>10 mL syringe</td>
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<td>Q-tips</td>
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<td>Surgical glue</td>
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<td>Surgical drape</td>
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<td>Towel clamps</td>
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<td>Small hand-held vacuum </td>
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fabrication of biologically derived injectable materials for myocardial tissue engineering

Este protocolo proporciona los métodos para la preparación de un inyectable de la matriz extracelular (ECM) de gel para el infarto de aplicaciones de ingeniería de tejidos. En pocas palabras, el tejido descelularizada es liofilizada, se muele, se digiere enzimáticamente, y luego llevados a un pH fisiológico. La liofilización elimina todo el contenido de agua de los tejidos, dando lugar a ECM seco que puede ser molido en un polvo fino con un pequeño molino. Después de la molienda, el polvo de ECM es digerido con pepsina para formar una matriz de inyectables. Después del ajuste a un pH de 7.4, el material de la matriz líquida se puede inyectar en el miocardio. Los resultados de los ensayos de caracterización previos han mostrado que los geles matriz obtenida a partir de tejido de miocardio y pericardio descelularizada retener los componentes nativos ECM, incluyendo diversas proteínas, péptidos y glicosaminoglicanos. Dado el uso de este material para la ingeniería de tejidos, en la caracterización in vivo es especialmente útil, aquí, un método para realizar una inyección intramural en el ventrículo izquierdo (VI) de la pared libre se presenta como una forma de analizar la respuesta del huésped a la matriz de gel en un modelo de animal pequeño. El acceso a la cavidad torácica se obtiene a través del diafragma y la inyección se hace un poco por encima del vértice de la pared libre del VI. El origen biológico andamio puede ser visualizado por biotina-etiquetado antes de la inyección y luego teñir secciones de tejido con rábano picante y conjugado con peroxidasa neutravidin y visualización mediante diaminobencidina (DAB) tinción. Análisis de la región de inyección también se puede hacer con la tinción histológica e inmunohistoquímica. De esta manera, los geles de la matriz ya examinada pericardio y miocardio, se mostró a formar redes de fibra, porosa y promover la formación de vasos en la región de la inyección.

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Los métodos para preparar una matriz de gel inyectable de tejidos descelularizada e inyectarlo en ratas miocardio<em&gt; In vivo</em&gt; Se describen.

Fabricación de materiales de origen biológico inyectable para ingeniería de tejidos del miocardio

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K vistas.  University of California, San Diego. Los métodos para preparar una matriz de gel inyectable de tejidos descelularizada e inyectarlo en ratas miocardio In vivo Se describen.

Video: Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Investigación

Bioingeniería

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproducción de procesamiento de las Fibras electrospun de Ingeniería de Tejidos

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingeniería 3D Cellularized colágeno Geles para Vascular Regeneración Tisular

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Diseño y Construcción de Artificial matriz extracelular (AECM) Las proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Para la piel Ingeniería de Tejidos

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Fabricación de Mecánicamente sintonizable y Bioactivos metal andamios para Aplicaciones Biomédicas

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing drugs targeted at the liver, requires a platform in which cells receive proper biochemical and mechanical cues. Recent liver tissue engineering systems have employed three-dimensional (3D) scaffolds composed of synthetic or natural hydrogels, given their high water retention and their ability to provide the mechanical stimuli needed by the cells. There has been growing interest in the inverted colloidal crystal (ICC) scaffold, a recent development, which allows high spatial organization, homotypic and heterotypic cell interaction, as well as cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Herein, we describe a protocol to fabricate the ICC scaffold using poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and the particle leaching method. Briefly, a lattice is made from microsphere particles, after which a pre-polymer solution is added, properly polymerized, and the particles are then removed, or leached, using an organic solvent (e.g., tetrahydrofuran). The dissolution of the lattice results in a highly porous scaffold with controlled pore sizes and interconnectivities that allow media to reach cells more easily. This unique structure allows high surface area for the cells to adhere to as well as easy communication between pores, and the ability to coat the PEGDA ICC scaffold with proteins also shows a marked effect on cell performance. We analyze the morphology of the scaffold as well as the hepatocarcinoma cell (Huh-7.5) behavior in terms of viability and function to explore the effect of ICC structure and ECM coatings. Overall, this paper provides a detailed protocol of an emerging scaffold that has wide applications in tissue engineering, especially liver tissue engineering.

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

La fabricación de cristal invertida coloidal poli (etilenglicol) Andamios: Una célula Plataforma de cultivo tridimensional para ingeniería de tejidos de hígado

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

La fabricación de espumas y microportadores derivados de la matriz extracelular como específica de tejido de cultivo celular y las plataformas de entrega

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several angiogenic and prevascularization strategies have been established. However, most cell-based approaches include time-consuming in vitro steps for the formation of a microvascular network. Hence, they are not suitable for intraoperative one-step procedures. Adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) represent promising vascularization units. They can be easily isolated from fat tissue and exhibit a functional microvessel morphology. Moreover, they rapidly reassemble into new microvascular networks after in vivo implantation. In addition, ad-MVF have been shown to induce lymphangiogenesis. Finally, they are a rich source of mesenchymal stem cells, which may further contribute to their high vascularization potential. In previous studies we have demonstrated the remarkable vascularization capacity of ad-MVF in engineered bone and skin substitutes. In the present study, we report on a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from murine fat tissue.

We present a protocol to isolate adipose tissue-derived microvascular fragments that represent promising vascularization units. They can be rapidly isolated, do not require in vitro processing and, thus, may be used for one-step prevascularization in different fields of tissue engineering.

Aislamiento de murino tejido adiposo derivado de microvascular Fragmentos como Unidades Vascularización para ingeniería de tejidos

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Fabricación escalable de elástico, doble canal, Chips microfluídicos órgano

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...