Este protocolo describe un método noble y fácil para crear tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de partes corporales inducidas por el hombre y células cardíacas derivadas de células STEM. La flexibilidad de la geometría del tejido y la escalabilidad de la función de tejido preservado son las principales ventajas de esta técnica. Las ECT de forma de malla implantada pueden restaurar una estructura cardíaca y funcionar en un modelo de infarto de miocardio de rata.
Confirmando su viabilidad para su uso en terapia regenerativa cardíaca. Estas técnicas requieren el procesamiento reproducible de células STEM humanas y las habilidades de cultivo de tejidos para obtener resultados consistentes. Comience cortando una hoja PDMS curada al tamaño adecuado para permitir que la hoja se una con adhesivo de silicona para fabricar una bandeja rectangular de 21 por 20,5 milímetros con siete milímetros de largo 0,5 milímetros de ancho y postes rectangulares de 2,5 milímetros de alto en posiciones escalonadas.
El espaciado horizontal entre dos líneas de postes debe ser de 2,5 milímetros. Autoclave la bandeja a 120 grados Celsius durante 20 minutos antes de recubrir el molde con 1%Poloxamer 407 en PBS durante una hora. A continuación, enjuague bien el molde con PBS y coloque el molde en un pozo de una placa de seis pozos.
Para el análisis de linaje, combine las células del cardiomiocitos más los protocolos de células murales endoteliales y vasculares. De modo que la concentración final de células murales es de 10 a 20% en un número de célula total de seis veces 10 a las seis celdas por construcción. Mezclar 133 microlitros de colágeno de cola de rata soluble en ácido tipo una solución y 17 microlitros de tamampón alcalés a 17 microlitros de 10X Mínimo Esencial Medio sobre hielo.
A continuación, agregue 67 microlitros de matriz de membrana de sótano a la solución de colágeno. A continuación, centrifugar las células y resuspender el pellet en 167 microlitros de alto nivel de glucosa alta Dulbecco's Minimal Essential Medium complementado con suero bovino fetal y antibióticos. Mezclar las células en la solución de matriz en hielo.
A continuación, vierta cuidadosamente 400 microlitros de la suspensión de la matriz celular en el poloxámero 407 recubierto de molde de tejido PDMS. Incubar la mezcla de matriz celular en una incubadora de cultivo celular estándar a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 60 minutos. Cuando el tejido se haya formado, remoje cuidadosamente el molde con cuatro mililitros de medio de cultivo de TEC y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 14 días.
Antes de la implantación de la TEC, esterilizaste fórceps finos para eliminar cuidadosamente la TEC de los postes de carga. Los moldes de tejido se pueden fabricar con varios patrones, longitudes de poste y espaciado posterior para generar diferentes geometrías de ECT finales. Para este análisis, se utilizó un molde con postes de siete milímetros de largo con intervalos de 2,5 milímetros de ancho.
Poloxámero 407 evita la adhesión de las células al molde y permite la formación de una estructura de malla característica, después de una rápida compactación del gel en 14 días. La estructura se mantiene incluso después de que el ECT se libera del molde. La construcción del tejido fabricado tiene aproximadamente 1,5 centímetros de ancho y 0,5 milímetros de espesor.
Y el ancho de cada paquete en la malla es de aproximadamente 0,5 milímetros de media. Es posible generar un ECT de malla de 3 centímetros de ancho final que contiene 24 millones de celdas de un molde cuatro veces más grande con el mismo diseño de poste escalonado. Este ECT de malla más grande también se puede quitar fácilmente del molde y genera un acto local de fuerza equivalente a la malla más pequeña ECT.
Es importante verter la mezcla de matriz celular uniformemente en el molde de tejido sin generar burbujas para evitar que se sientan defectos en el gel final. Caracterización funcional del contratista. y las relaciones de cuarta frecuencia se pueden realizar utilizando sistemas incorporados.
Nuestro objetivo final es la traducción de paradigmas DE TEC en terapias clínicas que utilizan grandes estudios preclínicos animales.
