PDK es apoyado por una subvención de funcionamiento CIHR (MOP 86523)

1. Técnica quirúrgica <ol><li> Los experimentos deben llevarse a cabo utilizando una técnica aséptica y siguiendo los protocolos de uso de los animales de su institución específica. Instrumentos y materiales (soluciones, las sustancias químicas, marcadores, agujas, etc) que entran en contacto con el tejido vivo debe ser estéril para prevenir la infección y los efectos negativos sobre el bienestar animal y los posibles impactos negativos en el estudio. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Las ratas se anestesiaron con un sistema veterinario vaporizador isoflurano. El uso de oxígeno de uso médico a un ritmo de 0,8 L / min para vaporizar el gas isoflurano. Colocar el animal en el cuadro adjunto de anestesia y marcar en una concentración de isoflurano del 4% hasta que la respiración se ha desacelerado y el animal está tranquilo. </li><li> A continuación, cambiar el flujo de gas a la unión máscara de gas para el marco estereotáxico y el lugar del animal en el aparato estereotáxico. A su vez la concentración de isoflurano al 2% y el monitor de anestesia. Los animales más grandes (&gt; 300 g) pueden requerir una mayor concentración de isoflurano. Anestesia deben ser controlados durante la cirugía y la dosis de isoflurano ajustarse en consecuencia. Profundidad y la velocidad de la respiración debe ser constantemente evaluados, y la evaluación de los pies de presión (cada 5 minutos) por la ausencia de dolor profundo se debe realizar. </li><li> Una vez terminada la cirugía, apague el isoflurano y permitir que el animal oxígeno respiración durante varios minutos antes de la remoción del dispositivo estereotáxico. La temperatura del cuerpo se debe mantener al cubrir al animal con una manta quirúrgico y / o el uso de una manta de calefacción regulada durante la cirugía. </li></ol> 3. Abordaje quirúrgico <ol><li> Humedezca la piel en la parte superior de la cabeza con el 70% de etanol para hacer la piel más fácil de cortar. Retire la piel de entre los ojos con un clipper o tijera afilada. Limpie el área de la incisión tres veces con aplicaciones alternas de solución de yodo detergente (Proviodine, Betadine, etc), seguido de etanol al 70%. Mantener la córnea húmeda durante toda la cirugía mediante la aplicación de ungüento oftálmico ojo (Tears Naturale PM) a la córnea. Esparza la pomada sobre la superficie de la córnea de forma manual la apertura y cierre de los párpados. </li><li> Usando una hoja N º 11, hace una incisión a lo largo de la línea media de la cabeza de aproximadamente 0,5 cm por delante de los ojos a 1 cm por detrás de los ojos. Retraer el colgajo de piel sobre el ojo con las pinzas y suavemente se burlan de el tejido conectivo subyacente con la parte posterior del bisturí. A continuación, retire el colgajo de piel lateralmente y hacia abajo y mantenerla en su lugar con un retractor quirúrgico que puede ser pegado a la base del instrumento estereotáxico. </li><li> Hacer una incisión a lo largo del borde superior del hueso orbital mientras tira de la fascia que recubre con una pinza fuerte. Esto se retirará de la fascia que recubre la órbita del ojo. El borde del hueso orbital puede estar claramente delimitadas mediante el uso de fórceps para empujar hacia abajo en la fascia que recubre la órbita. El uso de un dispositivo de cauterio o el bisturí, la incisión seguir hacia atrás hasta el límite posterior de la órbita del ojo. El uso del hueso de la órbita superior, como una guía para la incisión. A continuación siguen los delanteros incisión hacia el límite anterior de la órbita. La incisión de la órbita superior, se hace mejor con un dispositivo de cauterio pequeños con el fin de prevenir el sangrado de los vasos subyacentes que se comunican con los senos venosos. </li><li> Si se produce una hemorragia varios pasos se pueden tomar. En primer lugar, aplicar presión con hisopos estériles quirúrgicos o bastoncillos de algodón. Si el sangrado continúa, aplique solución salina fría y estéril de tampón fosfato (PBS) en el área con un gotero, y mantener la presión. La hemorragia menor se detendrá después de unos segundos con este procedimiento. Si la hemorragia persiste, aplique tracción en el tejido con un bastoncillo de algodón o quirúrgica con el fin de identificar la fuente del sangrado y rápida cauterizar el vaso comprometido. Después de que el sangrado se encuentra, use frío PBS estéril para limpiar el área quirúrgica de la sangre. El área quirúrgica debe ser periódicamente limpiado de esta manera con el fin de visualizar mejor las estructuras en la órbita del ojo. </li><li> Una vez que la incisión se ha limpiado, el uso de fórceps y la parte posterior del bisturí para limpiar el tejido conectivo en la parte posterior del ojo que cubre el contenido de la órbita. La parte posterior del bisturí N º 11 funciona bien cuando la punta está muy bien. Esto abrirá más porciones de la cavidad orbital proporciona una ventana más grande quirúrgica para trabajar, lo Utilice Dumont 7b # afiladas curvas dentadas fórceps cuando se trabaja en el ojo como su curvatura y punta fina son ideales para la manipulación de estructuras en la órbita. Además, las estrías ayuda con las estructuras de sujeción. </li><li> A continuación, retirar el tejido conjuntivo que rodea a la rama oftálmica del nervio trigémino que se encuentra cerca de la línea media, y eliminar el nervio con el fórceps. Este paso no es necesario, sin embargo la eliminación del nervio proporcionará una ventana más grande de accesos en el nervio óptico en el futuro. </li><li> Después de la extirpación del nervio, el uso de fórceps para retraer los vasos sanguíneos por debajo y completamente cauterizar el vaso. Este paso no es necesario, sin embargo, la cauterización del vaso permite que sea movido hacia delante, creando así una ventana más grande una vez que el nervio óptico se alcanza. </li><li> Use un fuerte par de pinzas o fórceps que han tenido sus puntas dobladas hacia adentro para recoger con cuidado y quitar la capa delgada de tejido conectivo en los músculos extraoculares y de la glándula lagrimal. Retraer los músculos extraoculares de anterior a posterior de la órbita. Agarre la parte proximal del músculo con un par de pinzas y el uso de un segundo par de pinzas curvas dentadas vestir ojo para aplicar una tracción hacia fuera en el músculo. Asegúrese de que las pinzas de vestir los ojos se orientan en la misma dirección que el músculo cuando se tira con el fin de evitar que se desgarre. Eliminar el músculo anterior de la órbita (oblicuo superior) de esta manera. El músculo se libera desde lo más profundo dentro de la órbita y la longitud restante puede ser retirado con el fin de girar la vista hacia el exterior. </li><li> Repita el paso 3.8 con el músculo siguiente (recto interno) que se encuentra entre los lóbulos de la glándula lagrimal y glándula de Harder, cerca de la línea media de la superficie dorsal del ojo. Pegue los retractores para mantener la tracción en los músculos. </li><li> Quite con cuidado cualquier resto de tejido conectivo sobre la superficie de la glándula lagrimal y levantar la glándula hacia arriba con unas pinzas. No comprimir o exprimir la glándula. Con el fin de retirar la glándula, sólo un solo vaso en el polo posterior debe ser cauterizada. Levante el extremo posterior de la glándula hacia arriba, y luego cauterizar el vaso. </li><li> A continuación, girar la glándula lagrimal hacia adelante para abrir la parte posterior de la órbita y permitir el acceso sin trabas a los músculos que recubren el nervio óptico. Mantenga el área constantemente húmeda con PBS estéril y secar con paños quirúrgicos o bastoncillos de algodón. </li><li> El uso de pinzas afiladas, una vez más eliminar la delgada de tejido conectivo que rodea los músculos de la órbita posterior (elevador del párpado superior y recto superior) y separar los haces de músculo subyacente. Retraer los músculos de forma independiente o en conjunto, utilizando la curva dentada fórceps vestir los ojos, una vez más, tirando en línea con las fibras musculares. Fije la longitud de los músculos restantes del retractor, junto con los músculos que se retractó en los pasos 3.8 y 3.9 y la cinta por el retractor de aplicar la tracción. Un total de cuatro músculos ahora se adjuntará a la retractor. Esto hará girar el ojo hacia afuera y hacia el exterior a fin de revelar la vaina grasa que contiene que rodea el nervio óptico. </li></ol> 4. Acceso al nervio óptico <ol><li> El uso de fórceps fuerte (Fine Dumont punta) para tirar hacia arriba en el tejido conjuntivo que rodea la vaina grasa del nervio óptico. Haga un corte longitudinal con tijeras pequeñas de primavera Vannas. Ampliar el corte si es necesario. La grasa contenida en la vaina va a comenzar a bulto a cabo una vez se hace el corte. A continuación, retire las capas de tejido conectivo con cuidado tirando hacia arriba desde el borde y cortar las aletas de forma de media luna de los tejidos. </li><li> Retire la grasa que recubre el nervio óptico mediante el uso de fórceps para extraer la grasa, mientras que el corte con las tijeras de primavera Vannas. Mantener el área limpia con PBS estéril e hisopos quirúrgico para limpiar las pequeñas cantidades de sangre que surgen de la eliminación de los tejidos. </li><li> El nervio óptico es visible ahora. Con el fin de acceder a los nervios, la vaina meníngea que rodea el nervio se debe quitar sin dañar la arteria oftálmica que alimenta a la retina interna. Examine el patrón vascular de la vaina meníngea con unas pinzas para girar suavemente la vaina. Busque un área desprovista de vasos sanguíneos, y que permite un corte longitudinal que se hizo en la vaina de las meninges. </li><li> Utilizando unas pinzas punta fina Dumont, una pizca de la duramadre y tire hacia arriba. Cerca de la base de la cuña triangular de duración que se crea, el uso de las tijeras de primavera Vannas para hacer una pequeña incisión en la vaina. Inserte la hoja inferior de la tijera en la incisión y cortar la cubierta paralela a la dirección del nervio óptico, con cuidado de no dañar los vasos con cortes laterales. Use las pinzas y las tijeras para cubrir la duración de cada lado del nervio óptico. </li><li> La única cobertura restante del nervio es la aracnoides. Es muy fino y transparente. Con el fin de determinar si la membrana está todavía presente, el uso de fórceps fuerte pellizcar la superficie del nervio. Es la aracnoides está presente, una pizca de la membrana y tire hacia arriba para crear una cuña triangular de tejido. Haga una pequeña incisión con la punta de las tijeras similar a la etapa 4.4. A continuación, introduzca el extremo inferior de las tijeras y hacer un corte longitudinal en la aracnoides. A continuación, use las tijeras y pinzas para cubrir el aracnoides a cada lado del nervio óptico. </li><li> El uso de un micro-sur-gancho gica, elevar el nervio óptico de la vaina meníngea. Pase la punta del gancho en el borde exterior del nervio y asegúrese de que el gancho se mantiene en contacto con el nervio para que no se enganchen las meninges con el gancho y accidentalmente transecto. Levante con cuidado el nervio óptico de la vaina meníngea y completamente transecto nervio detrás del punto de apoyo del gancho. El tronco seccionado el nervio óptico ahora tendrán un extremo libre, lo que permite la eliminación del gancho. </li><li> Si la CGR van a ser retrógrada etiquetado con el fin de cuantificar la supervivencia, coloque un pequeño trozo de espuma de gel empapada en el 3% Fluorogold (u otro trazador retrógrado) sobre el muñón del nervio seccionado óptico (ver <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2261">JoVe protocolo 2.261</a> ). </li></ol> 5. Cierre y recuperación <ol><li> Aliviar la tracción en los músculos extraoculares y volver los ojos a una posición neutral. Al hacerlo, asegúrese de empujar el gelfoam abajo en la órbita del ojo para asegurarse de que la vista se gira en su lugar, la espuma de gel se mantiene alrededor del tronco del nervio óptico. Volver a la glándula lagrimal y los músculos oculares adicionales a su posición natural. </li><li> Devolver el colgajo de piel a la línea media y la sutura de la herida. Aplique un ungüento oftálmico ojo en ambos ojos. A continuación, apague la fuente de isoflurano y permitir que el animal oxígeno respiración durante varios minutos. Colocar el animal en una jaula o una jaula con calefacción por debajo de una lámpara de calor para recuperarse. No ponga la ropa de cama en la jaula de recuperación para eliminar la posibilidad de aspirar camas durante la recuperación. </li><li> Los animales deben ser alojados de manera independiente después de la cirugía. Nota analgésicos quirúrgica se debe administrar de acuerdo con las directrices de las autoridades de su cuidado de los animales y los animales deben ser controlados cuidadosamente después de la cirugía. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Sección transversal de los resultados del nervio óptico en la pérdida del 90% de la CGR heridos dentro de 14 días postaxotomy 09.11. El principal mecanismo de la muerte de las CGR es la apoptosis 9, 12. La densidad normal de la CGR es de aproximadamente 2.500 células / mm 2. De imagen confocal de epifluorescencia o se puede utilizar para visualizar CGR retrógrada etiquetado después de axotomía. RGC apoptosis es un retraso de aproximadamente 4 días después de axotomía, dejando una ventana de tiempo para la manipulación experimental. En un día después de axotomía y etiquetado retrógrada con Fluorogold, organismos RGC células en la capa de células ganglionares de la retina y fascículos de axones en la capa de fibras nerviosas de la retina son claramente visibles cuando la imagen de una preparación flatmounted (Fig. 1a). A los 14 días después de axotomía, la mayoría de la CGR han muerto, y una pocas CGR se intercalan entre la retina microglia (Fig 1b). Cuando CGR someterse a la apoptosis, la microglía fagocitar las células muertas, y como resultado se transcellularly marcado con el marcador fluorescente que se utiliza para etiquetar la CGR 13, 14. La aparición del marcador en el fagosomas de la microglía es diferente de la CGR supervivientes. Microglia contienen el marcador en fagosomas muy concentrados y extremadamente brillantes, que son relativamente grandes y dispersos en el citoplasma (Fig. 1c). CGR tiene un patrón más difuso de tinción (Fig. 1c), con pequeñas vesículas puntiformes que han sido transportados por vía retrógrada sus axones presentación del citoplasma celular. Estas vesículas son mucho más pequeñas y tienen menos intensa fluorescencia que permite a uno diferenciar CGR supervivientes de la microglia. Por otra parte, la microglía tiene mucho más pequeños cuerpos celulares y tienden a tener una morfología estrellada o ameboide a diferencia de la CGR que han cuerpos celulares relativamente grandes y redondeados. Los árboles dendríticas de la CGR también puede ayudar a diferenciarlos de los procesos a corto brillante de la microglía, la hora de cuantificar la supervivencia celular. La supervivencia celular se puede cuantificar en diferentes regiones de la retina y la densidad (células / mm 2) se pueden extrapolar de la zona de las micrografías correspondientes, ya que la CGR se encuentra en una monocapa en la capa de células ganglionares. <img src="/files/ftp_upload/2241/2241fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Micrografías de epifluorescencia Fluorogold CGR etiqueta después de axotomía y la aplicación del trazador en el muñón del nervio óptico. (A) 1 día después de axotomía CGR y sus fascículos axón se etiquetan con el marcador de forma puntiforme bien. (B) A los 14 días después de axotomía, el 90% de la CGR han muerto y etiquetado brillantes microglia que han fagocitado células muertas están catalogadas por el marcador. (C) Mayor aumento que ilustra la diferencia entre la CGR y la microglia (puntas de flecha de color rojo) a los 14 postaxotomy días. Barra de escala en A y B es de 50 micras. Barra de escala en la C es de 25 micras.

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	<li>Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+or+let+die+-+retinal+ganglion+cell+death+and+survival+during+development+and+in+the+lesioned+adult+CNS.">Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS.</a> Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).</li><li>Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+retinal+ganglion+cell+development,+survival,+and+regeneration.">Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration.</a> Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).</li><li>Koeberle, P. 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D., Gauldie, J., Ball, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+adenoviral-mediated+gene+transfer+of+interleukin-10,+interleukin-4,+and+transforming+growth+factor-beta+on+the+survival+of+axotomized+retinal+ganglion+cells.">Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells.</a> Neuroscience. 125, 903-920 (2004).</li><li>Berkelaar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy+results+in+delayed+death+and+apoptosis+of+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats.">Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).</li><li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+peripheral+nerve+grafts+on+the+survival+and+regrowth+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats.">Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 8, 265-280 (1988).</li><li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+protracted+phases+of+retinal+ganglion+cell+loss+follow+axotomy+in+the+optic+nerve+of+adult+rats.">Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats.</a> J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).</li><li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+death+in+experimental+glaucoma+and+after+axotomy+occurs+by+apoptosis.">Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).</li><li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+transcellular+carbocyanine-labelling+of+rat+retinal+microglia+during+injury-induced+neuronal+degeneration.">Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration.</a> Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).</li><li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+transcellular+staining+of+microglia+in+the+adult+rat+after+traumatic+degeneration+of+carbocyanine-filled+retinal+ganglion+cells.">Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells.</a> Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).</li></ol>

Hay muchas variaciones de este procedimiento quirúrgico, y varios de los pasos de este protocolo no son necesarios. Sólo es necesario retraer los músculos que recubren el nervio óptico, con el fin de tener acceso a los nervios. Sin embargo, esto se traduce en un espacio muy limitado de trabajo alrededor del nervio haciendo que el final de las etapas críticas de la sección transversal más difícil. En ciertas situaciones es deseable para transfectar las células del tronco del nervio óptico y el espacio que ofrec...

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<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Gas Mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anesthesia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VetEquip</td>
<td>901806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (PrAErrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter Corp</td>
<td>DIN 02225875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI, Zeiss, Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>39286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gelfoam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacia &amp; Upjohn</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tears Naturale P.M.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proviodine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Medline</td>
<td>MDS093945H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine tip Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro surgical hook</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10062-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eye dressing serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #7b sharp curved serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11270-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cauterizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18010-00</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optic nerve transection: a model of adult neuron apoptosis in the central nervous system

Las células ganglionares de la retina (CGR) son las neuronas del SNC que la producción de información visual desde la retina hasta el cerebro, a través del nervio óptico. El nervio óptico se puede acceder dentro de la órbita del ojo y completamente seccionado (axotomized), el corte de los axones de la población RGC todo. Transección del nervio óptico es un modelo reproducible de la muerte apoptótica de las células neuronales en el SNC adulto 1-4. Este modelo es particularmente atractivo debido a que la cámara vítrea del ojo actúa como una cápsula para administración de fármacos a la retina, lo que permite manipulaciones experimentales a través de inyecciones intraoculares. La difusión de los productos químicos a través del humor vítreo se asegura de que actúan sobre la población RGC todo. Por otra parte, la CGR puede ser selectiva transfectadas mediante la aplicación a corto RNAs de interferencia (siRNA), plásmidos o vectores virales para el corte final de los vectores del nervio óptico o la inyección de 5-7 en su objetivo, el colículo superior 8. Esto permite a los investigadores a estudiar los mecanismos de apoptosis en la población neuronal que desee, sin factores de confusión en las neuronas o glía espectador otras circundantes. Un beneficio adicional es la facilidad y la precisión con la que se puede cuantificar la supervivencia celular después de la lesión. La retina es un tejido plano, capas y CGR se localizan en la capa más interna, la capa de células ganglionares. La supervivencia de las CGR se pueden rastrear en el tiempo mediante la aplicación de un indicador fluorescente (3% Fluorogold) para el extremo del corte del nervio óptico en el momento de axotomía, o mediante la inyección del trazador en el colículo superior (objetivo RGC) una semana antes de axotomía. El marcador se transportan por vía retrógrada, el etiquetado de la población RGC todo. Debido a que la capa de células ganglionares es una monocapa (una célula de espesor), la densidad de RGC se puede cuantificar en el tejido plano de montaje, sin necesidad de estereología. Transección del nervio óptico conduce a la muerte apoptótica de 90% de la CGR heridos dentro de 14 días postaxotomy 11.09. RGC apoptosis tiene una característica de tiempo-por supuesto por el que se retrasa la muerte celular postaxotomy 3-4 días, después de que las células degeneran rápidamente. Esto proporciona una ventana de tiempo para la manipulación experimental dirigida contra los involucrados en la apoptosis.

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Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Transección del nervio óptico es un modelo ampliamente utilizado de la lesión en el SNC adulto. El noventa por ciento de las células ganglionares de la retina (CGR) cuyos axones son completamente seccionado (axotomía) mueren dentro de 14 días después de axotomía. Este modelo es fácilmente susceptible de manipulaciones experimentales y altamente reproducible.

La transección del nervio óptico: un modelo de apoptosis neuronal de adultos en el sistema nervioso central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

optic-nerve-transection-model-adult-neuron-apoptosis-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.5K vistas.  University of Toronto. Transección del nervio óptico es un modelo ampliamente utilizado de la lesión en el SNC adulto. El noventa por ciento de las células ganglionares de la retina (CGR) cuyos axones son completamente seccionado (axotomía) mueren dentro de 14 días después de axotomía. Este modelo es fácilmente susceptible de manipulaciones experimentales y altamente reproducible.

Video: Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Los métodos para la manipulación experimental después de la transección del nervio óptico en el SNC de los mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Investigación

Neurociencias

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular directa de medicamentos al roedor Sistema Nervioso Central

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Grabación de potencial evocado visual en un modelo de rata de Experimental del Nervio Óptico Desmielinización

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptico del sistema nervioso central del ratón Utilizando CLARITY pasiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection is considered a useful and reproducible model. Compared with other optic nerve injury models used commonly for assessing secondary degeneration, e.g. complete optic nerve transection and optic nerve crush models, the partial optic nerve transection model is superior as it distinguishes primary from secondary degeneration in situ. Therefore, it serves as an excellent tool for evaluating secondary degeneration. This study describes a novel operative approach of partial optic nerve transection by directly accessing the area of the retrobulbar optic nerve through the orbital lateral wall of the eyeball. Moreover, we present a newly designed, low cost surgical instrument to assist with transection. As demonstrated by the representative results in distinguishing the boundary of primary and secondary injury areas, the new approach and instrument ensures high efficiency and stability of the model by providing adequate space for surgical operation. This in turn makes it easy to separate the meningeal sheath and ophthalmic vessels from the optic nerve before transection. An additional benefit is that this space-saving operative approach improves the investigators&#39; ability to administer drugs, carriers, or selective RGC tracers to the stump of the partially transected optic nerve, allowing the exploration of mechanisms behind secondary injury in RGCs, in a new way.

Secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. This study describes an innovative operative approach for partial optic nerve transection. The use of this space-saving operative approach extends the model's application range, and allows exploration of secondary injury mechanisms in RGCs in a new way.

Transección parcial del nervio óptico en ratas: un modelo con un nuevo enfoque operativo para evaluar la degeneración secundaria de las células ganglionares de la retina

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...