Il PDK è supportato da un sistema operativo CIHR sovvenzione (MOP 86523)

1. Tecnica chirurgica <ol><li> Gli esperimenti deve essere effettuata usando tecniche asettiche e seguendo i protocolli di uso di animali della vostra istituzione specifica. Strumenti e materiali (soluzioni, sostanze in esame, traccianti, aghi, ecc), entrando in contatto con tessuti vivi, devono essere sterili per prevenire l&#39;infezione e impatti negativi sul benessere degli animali e il potenziale impatto negativo sullo studio. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> I ratti saranno anestetizzati con un sistema veterinario vaporizzatore isoflurano. Usare l&#39;ossigeno per uso medico a una velocità di 0,8 L / min per vaporizzare il gas isoflurano. Posto l&#39;animale nella casella di anestesia attaccato e comporre in una concentrazione di isoflurano del 4% fino a quando il respiro si è rallentato e l&#39;animale è calmo. </li><li> Quindi, interruttore il flusso di gas per l&#39;attaccamento maschera antigas per il telaio stereotassico e posto l&#39;animale in dell&#39;apparato stereotassico. Girare la concentrazione di isofluorano al 2% e monitorare l&#39;anestesia. Animali più grandi (&gt; 300g) può richiedere una maggiore concentrazione di isoflurano. L&#39;anestesia deve essere monitorata durante l&#39;intervento chirurgico e il dosaggio isoflurano aggiustato di conseguenza. La profondità e la velocità di respirazione deve essere costantemente valutata e un pizzico di valutazione tep (ogni 5 minuti) per l&#39;assenza di dolore profondo deve essere eseguito. </li><li> Una volta che l&#39;operazione è completata, spegnere l&#39;isoflurano e permettere all&#39;animale di respirare ossigeno per alcuni minuti prima della rimozione dal dispositivo stereotassico. La temperatura corporea deve essere mantenuta coprendo l&#39;animale con una coperta chirurgico e / o utilizzando una coperta riscaldamento regolabile durante l&#39;intervento. </li></ol> 3. Approccio chirurgico <ol><li> Bagnare il pelo sulla parte superiore della testa con il 70% di etanolo per rendere il pelo più facile da tagliare. Rimuovere la pelliccia dal mezzo agli occhi con un clipper o forbici taglienti. Pulire l&#39;area di incisione per tre volte con applicazioni alternate di soluzione di iodio detergente (Proviodine, Betadine, ecc), seguito da etanolo al 70%. Mantenere la cornea umida per tutta la chirurgia dell&#39;occhio applicando pomata oftalmica (Tears Naturale PM) alla cornea. Stendere l&#39;unguento sulla superficie della cornea manualmente l&#39;apertura e la chiusura delle palpebre. </li><li> Utilizzando una lama n ° 11, fare un&#39;incisione lungo la linea mediana della testa di circa 0,5 cm davanti agli occhi a 1 cm dietro gli occhi. Ritrarre il lembo di pelle sopra l&#39;occhio con pinze e delicatamente stuzzicare via il tessuto connettivo sottostante, con la parte posteriore del bisturi. Poi, ritirare il lembo di pelle lateralmente e verso il basso e tenere in posizione con un divaricatore chirurgico che può essere registrata alla base dello strumento stereotassico. </li><li> Fare un&#39;incisione lungo il bordo superiore dell&#39;osso orbitale mentre si tira su la fascia sovrastante con una pinza tagliente. Questo ritirerà la fascia sovrastante l&#39;orbita dell&#39;occhio. Il bordo dell&#39;osso orbitale può essere chiaramente delimitato utilizzando pinze a spingere verso il basso la fascia sovrastante l&#39;orbita. Utilizzando un dispositivo di cauterizzazione o bisturi, continuare l&#39;incisione a ritroso verso il limite posteriore dell&#39;orbita dell&#39;occhio. Utilizzare l&#39;osso dell&#39;orbita superiore come una guida per l&#39;incisione. Avanti continuare l&#39;incisione in avanti verso il limite anteriore dell&#39;orbita. L&#39;incisione dell&#39;orbita superiore è meglio farlo con un piccolo dispositivo cauterizzazione al fine di prevenire le emorragie dai vasi sottostanti che comunicano con i seni venosi. </li><li> Se l&#39;emorragia si verifica diversi passaggi possono essere prese. In primo luogo, applicare una pressione utilizzando tamponi sterili chirurgici o tamponi di cotone. Se l&#39;emorragia continua, si applica a freddo, sterile, soluzione salina tampone fosfato (PBS) per l&#39;area con un contagocce, e mantenere la pressione. Sanguinamenti minori si fermerà dopo alcuni secondi con questa procedura. Se il sanguinamento persiste, applicare la trazione ai tessuti con il tampone chirurgico o tampone di cotone al fine di identificare la fonte di sanguinamento e rapidamente cauterizzare la nave compromessa. Dopo che il sanguinamento è contenuto, utilizzare freddo PBS sterile per pulire l&#39;area chirurgica di sangue. L&#39;area chirurgica dovrebbe essere periodicamente puliti in questo modo al fine di visualizzare meglio le strutture nell&#39;orbita dell&#39;occhio. </li><li> Una volta che l&#39;incisione è stata pulita, utilizzare forcipe e la parte posteriore del bisturi per pulire il tessuto connettivo nella parte posteriore dell&#39;occhio che ricopre il contenuto orbitale. Il retro del n. 11 bisturi funziona bene come la punta va bene. Si aprirà porzioni più profonde della cavità orbitale che fornisce una finestra più grande chirurgico per lavorare in Usa 7b Dumont # sharp-curve-seghettato pinze quando si lavora in un occhio come il loro curvatura e suggerimenti multa sono ideali per la manipolazione di strutture in orbita. Inoltre, le scanalature aiutano con le strutture di presa. </li><li> Quindi, rimuovere il tessuto connettivo che circonda la branca oftalmica del nervo trigemino che si trova nei pressi della linea mediana, e rimuovere il nervo utilizzando pinze. Questo passaggio non è necessario, tuttavia la rimozione del nervo fornirà una finestra più grande di accessos al nervo ottico in seguito. </li><li> Dopo la rimozione del nervo, usare il forcipe per ritirare il vaso sanguigno sotto e completamente cauterizzare la nave. Questo passo non è inoltre necessario, tuttavia cauterizzazione del vaso permette di essere spostato anteriormente, creando così una finestra più grande una volta che il nervo ottico viene raggiunto. </li><li> Utilizzare un paio di pinze taglienti, pinze o che hanno avuto le loro punte piegate verso l&#39;interno per scegliere bene e togliere il sottile strato di tessuto connettivo sui muscoli extraoculari e la ghiandola lacrimale. Ritrarre i muscoli oculari extra da anteriore a posteriore dell&#39;orbita. Afferrare la parte prossimale del muscolo con un paio di pinze e usare un secondo paio di pinze curve vestirsi occhio seghettata per applicare la trazione verso l&#39;esterno sul muscolo. Assicurarsi che la pinza occhio spogliatoio sono orientate nella stessa direzione in cui tira il muscolo, per evitare strappi. Rimuovere il muscolo più anteriore dell&#39;orbita (obliquo superiore) in questo modo. Il muscolo verrà liberato dal profondo l&#39;orbita e la lunghezza rimanente può essere ritratto in modo da ruotare l&#39;occhio verso l&#39;esterno. </li><li> Ripetere il passaggio con il muscolo 3,8 successivo (retto mediale) che si trova tra i lobi della ghiandola lacrimale e Gland Harderian vicino alla linea mediana della superficie dorsale dell&#39;occhio. Nastro lungo il divaricatore per mantenere la trazione sui muscoli. </li><li> Rimuovere delicatamente qualsiasi tessuto connettivo rimanenti sulla superficie della ghiandola lacrimale e sollevare la ghiandola verso l&#39;alto con pinze. Non comprimere o spremere la ghiandola. Al fine di ritirare la ghiandola, ma solo una nave unica al polo posteriore deve essere cauterizzato. Sollevare l&#39;estremità posteriore della ghiandola verso l&#39;alto, e poi cauterizzare la nave. </li><li> Successivamente, lembo della ghiandola lacrimale in avanti per aprire la parte posteriore dell&#39;orbita e consentire il libero accesso ai muscoli che si sovrappongono al nervo ottico. Mantenere l&#39;area costantemente umido con PBS sterile, e asciugatura con tamponi chirurgici o tamponi di cotone. </li><li> Utilizzando pinze taglienti ancora una volta, rimuovere il tessuto connettivo sottile che circonda i muscoli dell&#39;orbita posteriore (elevatore della palpebra superiore e retto superiore) e separare i fasci del muscolo sottostante. Ritrarre i muscoli in modo indipendente o all&#39;unisono, usando la curva seghettato Pinza medicazione occhio, ancora una volta, tirando in linea con le fibre muscolari. Fissare le lunghezze muscolari restanti, il riavvolgitore con i muscoli che sono stati ritratta nei passaggi 3.8 e 3.9 e nastro in basso, il riavvolgitore per applicare la trazione. Un totale di 4 muscoli sarà ora allegata al riavvolgitore. Questo ruoterà l&#39;occhio in avanti e verso l&#39;esterno al fine di rivelare la guaina che contiene grassi che circonda il nervo ottico. </li></ol> 4. Accesso al nervo ottico <ol><li> Utilizzare pinze taglienti (Fine punta Dumont) per tirare verso l&#39;alto sul tessuto connettivo che circonda la guaina grassa del nervo ottico. Fare un taglio longitudinale con piccole forbici primavera Vännäs. Espandere il taglio, se necessario. Il grasso contenuto dalla guaina inizierà a gonfiarsi una volta il taglio è fatto. Avanti rimuovere i lembi di tessuto connettivo con attenzione tirando verso l&#39;alto dal bordo e tagliare i lembi di tessuto a forma di mezzaluna. </li><li> Togliere il grasso sovrastante il nervo ottico utilizzando forcipe per tirare su il grasso, mentre il taglio con le forbici a molla il Vännäs. Mantenere l&#39;area pulita utilizzando PBS sterile e tamponi chirurgici per pulire le piccole quantità di sangue che derivano dalla rimozione del tessuto. </li><li> Il nervo ottico è ora visibile. Per accedere al nervo, la guaina che circonda meningea il nervo deve essere rimosso senza danneggiare l&#39;arteria oftalmica che alimenta la retina interna. Esaminare il motivo della guaina vascolare meningeo con pinze a ruotare delicatamente la guaina. Cercare una zona priva di vasi sanguigni e permettendo un taglio longitudinale da effettuare nel fodero meningea. </li><li> Utilizzando multa punta Dumont pinza, stringere la dura e tirare verso l&#39;alto. Vicino alla base del cuneo di forma triangolare di durata che si crea, usare le forbici primavera Vännäs di fare una piccola incisione nel fodero. Inserire la lama inferiore della forbice nel incisione e taglio parallelo alla direzione guaina del nervo ottico, attenzione a non danneggiare la vascolarizzazione con tagli laterali. Utilizzare le pinze e forbici per coprire la dura su entrambi i lati del nervo ottico. </li><li> L&#39;unica copertura rimanente del nervo è la membrana aracnoide. E &#39;molto sottile e trasparente. Al fine di determinare se la membrana è ancora presente, utilizzare pinze taglienti per pizzicare la superficie del nervo. E &#39;l&#39;aracnoide è presente, pizzicare la membrana e tirare verso l&#39;alto per creare un cuneo triangolare di tessuto. Fai una piccola incisione con la punta delle forbici simili alla Fase 4.4. Poi, inserire la lama inferiore delle forbici e fare un taglio longitudinale nella aracnoide. Successivamente, utilizzare le forbici e pinze a drappeggio l&#39;aracnoide su entrambi i lati del nervo ottico. </li><li> Utilizzando una micro-surgancio gico, elevare il nervo ottico dalla guaina meningea. Passare la punta del gancio intorno al bordo esterno del nervo e assicurarsi che il gancio rimane in contatto con il nervo in modo che non cattura le membrane meningee con il gancio e accidentalmente transetto. Sollevare delicatamente il nervo ottico dalla guaina meningea e completamente transetto il nervo dietro il punto supportato dal gancio. Il moncone transected nervo ottico avrà ora un estremità libera, consentendo la rimozione del gancio. </li><li> Se il RGCs stanno per essere retrogrado etichettati al fine di quantificare la sopravvivenza, posto un piccolo pezzo di Gelfoam imbevuto nel 3% Fluorogold (o un altro tracciante retrogrado) sul ceppo transected nervo ottico (vedi <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2261">JOVE protocollo 2261</a> ). </li></ol> 5. Di chiusura e recupero <ol><li> Alleviare la trazione sui muscoli oculari in più e tornare l&#39;occhio ad una posizione neutra. Nel farlo, assicuratevi di spingere il Gelfoam giù nell&#39;orbita dell&#39;occhio per garantire che l&#39;occhio non viene riportato in posizione, il Gelfoam rimane attorno al moncone del nervo ottico. Ritorna la ghiandola lacrimale e muscoli oculari in più per le loro posizioni naturali. </li><li> Restituire il lembo di pelle alla linea mediana e suturare la ferita. Applicare occhio pomata oftalmica in entrambi gli occhi. Poi, spegnere la fonte isoflurano e permettere all&#39;animale di respirare ossigeno per alcuni minuti. Posto l&#39;animale in una gabbia riscaldata o una gabbia sotto una lampada di calore per recuperare. Non appoggiare letto nella gabbia di recupero per eliminare la possibilità di aspirare letto durante il recupero. </li><li> Animali dovrebbero essere accolti in modo indipendente dopo l&#39;intervento chirurgico. Messaggio analgesici chirurgici deve essere somministrato secondo le linee guida della vostra autorità cura degli animali e gli animali devono essere attentamente monitorati dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Transezione dei risultati nervo ottico la perdita del 90% dei feriti RGCs entro 14 giorni postaxotomy 9-11. Il meccanismo principale di morte RGC è apoptosi 9, 12. La densità normale di RGCs è circa 2500 cellule / mm 2. Immagini epifluorescenza o confocale può essere utilizzato per visualizzare RGCs retrogrado etichettati dopo assotomia. Apoptosi RGC è ritardato di circa 4 giorni dopo assotomia, lasciando una finestra temporale per le manipolazioni sperimentali. Al 1 giorno dopo assotomia e marcatura retrograda con Fluorogold, corpi cellulari RGC nello strato di cellule gangliari della retina e fascicoli degli assoni nello strato delle fibre nervose della retina sono chiaramente visibili quando immagini una preparazione flatmounted (Fig. 1a). Con 14 giorni dopo assotomia, la maggior parte dei RGCs sono morti, e un RGCs pochi rimasti si alternano tra retina microglia (Fig. 1b). Quando RGCs apoptosi, microglia fagocitare le cellule morte e, quindi, sia transcellularly etichettati con il tracciante fluorescente che è stato usato per etichettare il RGCs 13, 14. L&#39;aspetto del tracciante nel fagosomi della microglia è diverso da quello in RGCs sopravvivere. Microglia contenere il tracciante in fagosomi altamente concentrato e molto luminosi che sono relativamente grandi e sparse in tutta la loro citoplasma (Fig. 1c). RGCs hanno un modello più diffuso della colorazione (Fig. 1c) con piccole vescicole puntata retrogrado che sono stati trasportati i loro assoni deposito del citoplasma cellulare. Queste vescicole sono molto più piccole e hanno meno intensa fluorescenza permettendo di differenziare RGCs superstiti microglia. Inoltre, microglia hanno corpi cellulari molto più piccolo e tendono ad avere una morfologia stellata o ameboide in contrasto con RGCs che hanno corpi cellulari relativamente grande e arrotondata. Gli alberi dendritici di RGCs può anche aiutare a distinguerli dai processi breve brillante della microglia, nel quantificare la sopravvivenza delle cellule. Sopravvivenza delle cellule può essere quantificato in diverse regioni della retina e la densità (cellule / mm 2) può essere estrapolata dalla zona del micrografie corrispondente, dal momento che RGCs si trovano in un monostrato all&#39;interno dello strato di cellule gangliari. <img src="/files/ftp_upload/2241/2241fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Micrografie epifluorescenza di Fluorogold RGCs etichettati dopo assotomia e l&#39;applicazione del tracciante al moncone del nervo ottico. (A) 1 giorno dopo RGCs assotomia ed i loro fascicoli assone sono etichettati con il tracciante in un modo sottile puntata. (B) Entro il 14 assotomia giorni dopo, il 90% di RGCs sono morti e brillantemente etichettato microglia che hanno fagocitato le cellule morte sono etichettati con il tracciante. (C) superiore di ingrandimento che illustra la differenza tra RGCs e microglia (punte di freccia rossa) a 14 postaxotomy giorni. Barra di scala in A e B è di 50 micron. Barra di scala in C è di 25 micron.

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	<li>Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+or+let+die+-+retinal+ganglion+cell+death+and+survival+during+development+and+in+the+lesioned+adult+CNS.">Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS.</a> Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).</li><li>Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+retinal+ganglion+cell+development,+survival,+and+regeneration.">Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration.</a> Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).</li><li>Koeberle, P. D., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+guidance+cues+for+regenerating+axons:+where+have+they+gone.">Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone.</a> J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).</li><li>Weishaupt, J. H., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+as+a+model+for+neuronal+apoptosis+in+the+central+nervous+system+-+molecular+death+and+survival+pathways.">Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways.</a> Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).</li><li>Valenzuela, G. a. r. c. i. a., E, S. C. S. h. a. r. m. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+retinal+ganglion+cells+from+axotomy-induced+apoptosis+through+TRK+oncogene+transfer.">Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer.</a> Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).</li><li>Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+by+adenoviral+vector+administration+at+the+optic+nerve+stump:+an+in+vivo+model+system+for+the+inhibition+of+neuronal+apoptotic+cell+death.">Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death.</a> Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).</li><li>Lingor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+apoptosis+mediators+by+RNAi+inhibits+axotomy-induced+retinal+ganglion+cell+death+in+vivo.">Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo.</a> Brain. 128, 550-558 (2005).</li><li>Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+adenoviral-mediated+gene+transfer+of+interleukin-10,+interleukin-4,+and+transforming+growth+factor-beta+on+the+survival+of+axotomized+retinal+ganglion+cells.">Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells.</a> Neuroscience. 125, 903-920 (2004).</li><li>Berkelaar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy+results+in+delayed+death+and+apoptosis+of+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats.">Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).</li><li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+peripheral+nerve+grafts+on+the+survival+and+regrowth+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats.">Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 8, 265-280 (1988).</li><li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+protracted+phases+of+retinal+ganglion+cell+loss+follow+axotomy+in+the+optic+nerve+of+adult+rats.">Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats.</a> J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).</li><li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+death+in+experimental+glaucoma+and+after+axotomy+occurs+by+apoptosis.">Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).</li><li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+transcellular+carbocyanine-labelling+of+rat+retinal+microglia+during+injury-induced+neuronal+degeneration.">Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration.</a> Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).</li><li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+transcellular+staining+of+microglia+in+the+adult+rat+after+traumatic+degeneration+of+carbocyanine-filled+retinal+ganglion+cells.">Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells.</a> Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ci sono molte varianti di questa procedura chirurgica e parecchi dei passi in questo protocollo non sono necessari. E &#39;solo necessario ritirare i muscoli che si sovrappongono al nervo ottico al fine di ottenere l&#39;accesso al nervo. Tuttavia, questo si traduce in uno spazio molto limitato di lavoro intorno al nervo rendendo le fasi critiche finale di transezione più difficile. In certe situazioni è auspicabile trasfezione delle cellule dal tronco del nervo ottico e lo spazio maggiore accesso offerta dalla scompa...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Gas Mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anesthesia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VetEquip</td>
<td>901806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (PrAErrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter Corp</td>
<td>DIN 02225875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI, Zeiss, Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>39286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gelfoam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacia &amp; Upjohn</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tears Naturale P.M.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proviodine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Medline</td>
<td>MDS093945H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine tip Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro surgical hook</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10062-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eye dressing serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #7b sharp curved serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11270-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cauterizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18010-00</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optic nerve transection: a model of adult neuron apoptosis in the central nervous system

Cellule gangliari della retina (RGCs) sono i neuroni del SNC che in uscita le informazioni visive dalla retina al cervello attraverso il nervo ottico. Il nervo ottico si può accedere nell&#39;orbita dell&#39;occhio e completamente sezionato (axotomized), tagliando gli assoni di tutta la popolazione RGC. Resezione del nervo ottico è un modello riproducibile di apoptosi morte delle cellule neuronali del sistema nervoso centrale adulto 1-4. Questo modello è particolarmente interessante perché la camera vitreo dell&#39;occhio agisce come una capsula per la somministrazione di farmaci alla retina, permettendo manipolazioni sperimentali attraverso iniezioni intraoculari. La diffusione di sostanze chimiche attraverso il fluido vitreo assicura che agiscono su tutta la popolazione RGC. Inoltre, RGCs possono essere selettivamente trasfettate mediante l&#39;applicazione di breve RNA interferenti (siRNA), plasmidi o vettori virali per la fine taglio dei vettori nervo ottico 5-7 o iniettando nelle loro target, il collicolo superiore 8. Questo permette ai ricercatori di studiare i meccanismi apoptotici nella popolazione neuronale desiderato senza effetti confondenti sui neuroni spettatore o glia circostante. Un ulteriore vantaggio è la facilità e la precisione con cui sopravvivenza cellulare può essere quantificato dopo l&#39;infortunio. La retina è un piatto, tessuto stratificato e RGCs sono localizzate nello strato più interno, lo strato di cellule gangliari. La sopravvivenza di RGCs possono essere monitorati nel tempo mediante l&#39;applicazione di un tracciante fluorescente (3% Fluorogold) alla fine taglio del nervo ottico al momento della assotomia, o iniettando il tracciante nel collicolo superiore (target RGC) una settimana prima assotomia. Il tracciante è retrogrado trasportato, etichettatura l&#39;intera popolazione RGC. Poiché lo strato di cellule gangliari è un monostrato (una cella di spessore), densità RGC può essere quantificato in tessuto piatto montato, senza la necessità di stereologia. Resezione del nervo ottico conduce alla morte apoptotica del 90% dei feriti RGCs entro 14 giorni postaxotomy 9-11. RGC apoptosi è una caratteristica tempo-corso in cui viene ritardata la morte delle cellule postaxotomy 3-4 giorni, dopo di che le cellule degenerano rapidamente. Questo fornisce una finestra temporale per manipolazioni sperimentali diretti contro meccanismi coinvolti nella apoptosi.

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Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Resezione del nervo ottico è un modello ampiamente utilizzato degli adulti lesioni del SNC. Il novanta per cento delle cellule gangliari della retina (RGCs) i cui assoni sono completamente recisi (assotomia) muoiono entro 14 giorni dopo assotomia. Questo modello è facilmente suscettibile di manipolazioni sperimentali e altamente riproducibile.

Resezione del nervo ottico: un modello di apoptosi Neuron adulti nel Sistema Nervoso Centrale

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

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Neuroscience

20.5K Views.  University of Toronto. Resezione del nervo ottico è un modello ampiamente utilizzato degli adulti lesioni del SNC. Il novanta per cento delle cellule gangliari della retina (RGCs) i cui assoni sono completamente recisi (assotomia) muoiono entro 14 giorni dopo assotomia. Questo modello è facilmente suscettibile di manipolazioni sperimentali e altamente riproducibile.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Metodi per manipolazioni sperimentali dopo resezione del nervo ottico nel sistema nervoso centrale dei mammiferi

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Ricerca

Neuroscienze

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In vivo Interrogatorio del Sistema Nervoso Centrale Translatome da Polyribosome Frazionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Registrazione potenziale evocato visivo in un modello murino di sperimentale del nervo ottico demielinizzazione

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection is considered a useful and reproducible model. Compared with other optic nerve injury models used commonly for assessing secondary degeneration, e.g. complete optic nerve transection and optic nerve crush models, the partial optic nerve transection model is superior as it distinguishes primary from secondary degeneration in situ. Therefore, it serves as an excellent tool for evaluating secondary degeneration. This study describes a novel operative approach of partial optic nerve transection by directly accessing the area of the retrobulbar optic nerve through the orbital lateral wall of the eyeball. Moreover, we present a newly designed, low cost surgical instrument to assist with transection. As demonstrated by the representative results in distinguishing the boundary of primary and secondary injury areas, the new approach and instrument ensures high efficiency and stability of the model by providing adequate space for surgical operation. This in turn makes it easy to separate the meningeal sheath and ophthalmic vessels from the optic nerve before transection. An additional benefit is that this space-saving operative approach improves the investigators&#39; ability to administer drugs, carriers, or selective RGC tracers to the stump of the partially transected optic nerve, allowing the exploration of mechanisms behind secondary injury in RGCs, in a new way.

Secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. This study describes an innovative operative approach for partial optic nerve transection. The use of this space-saving operative approach extends the model's application range, and allows exploration of secondary injury mechanisms in RGCs in a new way.

Transection parziale del nervo ottico in ratti: un modello stabilito con un nuovo approccio operativo per valutare la degenerazione secondaria delle cellule ganglionari retiniche

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with neurodegenerative diseases or injuries, but also in the normal brain. Here, we describe a newly-established micromechanical system to rapidly, reliably, and reversibly induce axonal varicosities, allowing us to understand the mechanisms governing varicosity formation and heterogeneous protein composition. This system represents a novel means to evaluate the effects of compression and shear stress on different subcellular compartments of neurons, different from other in vitro systems that mainly focus on the effect of stretching. Importantly, owing to the unique features of our system, we recently made a novel discovery showing that the application of pressurized fluid can rapidly and reversibly induce axonal varicosities through the activation of a transient receptor potential channel. Our biomechanical system can be utilized conveniently in combination with drug perfusion, live cell imaging, calcium imaging, and patch clamp recording. Therefore, this method can be adopted for studying mechanosensitive ion channels, axonal transport regulation, axonal cytoskeleton dynamics, calcium signaling, and morphological changes related to traumatic brain injury.

This protocol describes a physiologically relevant, pressurized fluid approach for rapid and reversible induction of varicosities in neurons.

Un sistema di Microbiomechanical per lo studio della formazione del Varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...