Este trabajo fue apoyado por una subvención del Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) en el enfoque de Bernstein: Bases neuronales del aprendizaje (BFNL) a DE Randolf Menzel Agradecemos los valiosos comentarios sobre una versión anterior del manuscrito.

1. Las abejas la captura de la colmena <ol><li> Un día antes de que el experimento comienza, entre 2 y 4 de la tarde, dejando a las abejas de la colmena se encuentran atrapados. Para ello, una luz UV permeable pirámide de plexiglás (altura = 30 cm, el ápice de 3,5 x 3, 5 cm, base 18 x 18 cm), que se puede cerrar en el vértice y la base, se mantiene en un 20 - 30 cm de distancia frente a la entrada de la colmena con la base abierta y el ápice cerrado para que las abejas de la colmena dejando entrar a la base de la pirámide. La base se cierra y las abejas capturadas se haya traído al laboratorio para su posterior manejo. </li></ol> 2. La transferencia de las abejas de la Pirámide en viales de vidrio <ol><li> En el laboratorio, la pirámide se coloca en su base. Las paredes de la pirámide son oscuras (por ejemplo, con una toalla), pero el vértice se deja sin cubrir. Debido a su fototaxis positivo, las abejas dejan la pirámide a través de la punta cuando se abre. Uno por uno, las abejas se transfieren de la pirámide en viales de vidrio mediante la celebración de los viales en el ápice abierto. Un vial es utilizada por las abejas. Por lo tanto, el vértice se cierra cuando una abeja entra en el vial. </li></ol> 3. Las abejas en el aprovechamiento de los tubos <ol><li> Las abejas son inmovilizados por el enfriamiento en los viales de vidrio en el hielo de 2,5 a 3,5 min. Es recomendable ver la abeja y retírela del hielo tan pronto como se detiene el movimiento. </li><li> Una sola abeja inmovilizado se aprovecha en un pequeño tubo de plástico con cinta adhesiva, de tal forma que es capaz de mover su probóscide libremente, pero no su cabeza, el tórax o piernas. Es importante que el cuello no está comprimido. </li><li> Cada abeja fija en un tubo de plástico se coloca en un pozo numerados en una rejilla para un mejor manejo e identificación. Después de haber sido eliminado para la recuperación de la memoria acondicionado o el tubo siempre se devuelve a la perforación misma. </li></ol> 4. Las abejas de alimentación <ol><li> En la primera noche (04.06 horas), después de ser capturado, las abejas se alimentan hasta la saciedad con una solución de sacarosa (0,88 M, el azúcar blanco refinado hogar disuelto en el agua del grifo). Para alimentar a una abeja, su PER se produce al tocar sus antenas con una solución de sacarosa y el animal se le permite consumir una gota (4 l) de solución de sacarosa. Las abejas se alimentan una tras otra varias veces hasta que ya no muestran un PER rápido y fiable cuando las antenas se tocan con una solución de sacarosa. </li><li> En todas las noches posteriores (4-6 horas) de las abejas se alimentan experimento, uno tras otro cuatro veces con una gota de solución de sacarosa (4 l, 0,88 M, azúcar blanco refinado resuelto en el agua del grifo). Es importante que la solución de sacarosa no se unta en las antenas de las abejas o la trompa durante la alimentación y que los tubos no están contaminadas con solución de sacarosa. Las abejas no deben ser alimentados en o cerca del lugar acondicionado para excluir la posibilidad de asociar un contexto de formación con el estímulo de la sacarosa. </li></ol> 5. Apicultura aprovechó la noche <ol><li> Las abejas se mantienen durante la noche en un recipiente de plástico a temperatura ambiente. El agua del grifo se introduce en el recipiente (aproximadamente 0,5-1 cm de alto). Los bastidores con las abejas aprovechada se colocan en el recipiente por encima de la línea de flotación con placas de ELISA como una plataforma. Finalmente, el recipiente está cubierto con cartón. </li></ol> 6. Acondicionamiento olfativo En la primera mañana (10 am) del experimento de condicionamiento olfativo se lleva a cabo. El estímulo condicionado (EC) es un olor, el estímulo no condicionado (EE.UU.) es una solución de sacarosa. <ol><li> 4 l de los olores (por ejemplo, el aceite de clavo) se pipeta en un papel filtro redondo (1,3 cm de diámetro) que se inserta en una jeringa de 20 ml. El olor es una pipeta bajo una campana y puntas con filtro se utilizan para evitar la contaminación de la pipeta. </li><li> El bastidor con las abejas aprovechado se encuentra cerca del lugar acondicionado 30 minutos antes del procedimiento de acondicionamiento se inicia, pero a una distancia al lugar en el frente de un tubo de escape, donde las abejas individuales están condicionados. </li><li> Acondicionamiento consiste en tres pares de olores (el estímulo condicionado, CS) y la solución de sacarosa (el estímulo incondicionado, EE.UU., 1,25 M) con un intervalo entre ensayos (ITI) de 10 min. Una señal acústica entregado al investigador a través de un reproductor de audio garantiza la sincronización exacta de inicio del estímulo, el estímulo de desplazamiento, la duración del estímulo y de colocación. Un ensayo de adquisición se inicia con la colocación de 10 segundos del animal frente a un tubo de escape. Poco antes del final de la 10 segundos de la jeringa que contiene el olor es 3 cm en la parte delantera de la abeja dirigida a las antenas de las abejas. Posteriormente, el olor se presenta durante 5 segundos, al empujar a 20 ml de aire a través de la jeringa. Después de los primeros 3 segundos los flagelos distal de ambas antenas se tocan con una solución de sacarosa-humedecido palillo de dientes y los animales se les permite lamer el palillo moistend durante 4 segundos. 13 segundos después de que el CS termina la estimulación, las abejas se toman fuera del contexto de la formación y la vuelve a colocar en el estante. En total, un ensayo de formación dura 28 segundos. Es importante que ni las antenas de las abejas, ni trompa están cubiertos con sacarosa después del acondicionamiento. Por lo tanto, hay que asegurarse de que el palillo de dientes es sólo humedecido con solución de sacarosa y que no se forman gotas de sacarosa solución en el palillo de dientes. </li><li> Después del acondicionamiento los bastidores se colocan de nuevo en el bol. </li><li> Comportamiento de los animales durante el experimento, es decir, la aparición del PER durante la colocación y el CS y la presentación de EE.UU., es monitoreado y observado por el experimentador. </li></ol> 7. Retención de la memoria <ol><li> Pruebas de retención se puede realizar en cualquier intervalo (min a día). El estante de las abejas se coloca cerca del lugar acondicionado 30 minutos antes de la prueba de memoria comienza. </li><li> Una prueba de la memoria consta de 5 segundos presentación CS sin presentación en EE.UU.. La prueba dará comienzo con la colocación de 10 segundos de los animales frente a los gases de escape. Posteriormente, el olor se presenta durante 5 segundos como se describió anteriormente. El comportamiento de los animales, es decir, la aparición del PER durante la colocación y la presentación CS es anotado durante el experimento. </li><li> Al final del experimento, la respuesta de extensión trompa vuelve a tocar provocada por las antenas con una solución de sacarosa para asegurarse de que el animal todavía es capaz de extender su probóscide. </li></ol> 8. Inyección sistémica El punto en el tiempo de inyección sistémica depende del diseño experimental. <ol><li> Un pequeño agujero se hace en la cutícula de la parte posterior del escudo al lado de la fisura scutal por encima de los 17 músculos de vuelo mediante el uso de una aguja hipodérmica desechable (21 G). </li><li> El uso de un tubo capilar de vidrio, una solución de l se inyecta a través del agujero en la cutícula en el músculo de vuelo. Experimentadores capacitados son capaces de inyectar una abeja cada 30 segundos, lo que permite una sincronización precisa de la inyección y el acondicionamiento. </li></ol> 9. Las abejas alimentación durante el experimento <ol><li> En la tarde (4-6 pm), después del acondicionamiento, las abejas se alimentan uno tras otro cuatro veces con una gota de solución de sacarosa (4 l, 0,88 M, el azúcar blanca refinada disuelta en el agua del grifo). Es importante que la solución de sacarosa no se unta en las antenas de las abejas o la trompa durante la alimentación y que los tubos no están contaminadas con solución de sacarosa. Las abejas no deben ser alimentados en o cerca del lugar acondicionado para excluir la posibilidad de asociar un contexto de formación con el estímulo de la sacarosa. </li></ol> 10. Recopilación y análisis de datos <ol><li> La aparición de la respuesta de extensión probóscide durante el experimento se controla. Una abeja se obtuvo resultados positivos si se extiende su trompa entre la aparición de la CS y la presentación de los EE.UU. (en formación) o durante la presentación del CS (durante la fase de prueba), cruzando una línea virtual entre las mandíbulas abiertas. </li><li> Para ser incluido en el análisis de los animales debe cumplir dos criterios: deben sobrevivir al experimento, y deben mostrar la respuesta incondicionada extensión probóscide (PER) a la solución de sacarosa al final del experimento. El porcentaje de las abejas que muestra el PER durante la adquisición y retención de pruebas se ha trazado para cada presentación CS. </li></ol> 11. Los resultados representativos: Dos experimentos se presentan aquí. En el primer experimento nos fijamos en el impacto de la inyección sistémica de tampón fosfato salino (PBS, en mM: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) en el aprendizaje y largo plazo la formación de recuerdos. Tres grupos de abejas fueron entrenados con tres pares de CS-Estados Unidos, con un intervalo entre ensayos de 10 minutos: un grupo no tratado, un grupo que fue inyectado con una l PBS 30 minutos antes del entrenamiento, y un grupo de simulación de inyección de tratados de la misma forma que el grupo PBS-inyectado, pero sin inyectar PBS. 24 horas después de entrenamiento de la memoria se ha probado con una presentación de CS en los tres grupos. El porcentaje de animales con la respuesta condicionada durante el acondicionamiento se incrementa significativamente en los tres ensayos de entrenamiento (Fig. 1, ANOVA para medidas repetidas en el factor tiempo F 2378 = 340,456, p &lt;0,05). No hay diferencia en PER se pudo observar entre los tres grupos durante el condicionamiento (ANOVA para medidas repetidas en el factor de los grupos F2, 189 = 1,299, p&gt; 0,05). Esto es válido para una prueba de retención de 24 horas (F2, 187 = 0,752, p&gt; 0,05) al comparar los animales no tratados con PBS-animales inyectados con la simulada inyectado. En el segundo experimento se demuestra la inhibición de la retención de la memoria de tres y cuatro días después del entrenamiento, cuando el inhibidor de la síntesis de proteínas anisomicina (10 mM) se inyectados sistémicamente 30 minutos después de tres parejas EC-EI. Comparación de un grupo de anisomicina-inyectados con un grupo de PBS-inyectado revela una diferencia significativa entre los grupos durante la t de retenciónest (Fig. 2, ANOVA para medidas repetidas en el factor grupo de F1, 94 = 8,86, p &lt;0,05). Una diferencia importante se observa en la prueba de memoria en los días 3 y 4. Esto se asemeja a los resultados de Wüstenberg et al. 18, que también condicionó las abejas, con tres pares de CS-Estados Unidos, aunque con un protocolo diferente. <img src="/files/ftp_upload/2282/2282fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Lesión de la cutícula o la inyección de PBS no altera la adquisición y retención de la memoria. Los animales fueron entrenados con tres parejas EC-EI (la adquisición). Después de 24 h, se puso a prueba la memoria (memoria de retención). Treinta minutos antes del entrenamiento, un agujero se hizo en la cutícula de los dos grupos (lesión, PBS) y uno de estos grupos se les inyectó una l PBS (PBS). Un tercer grupo fue dejado intacto (sin tratamiento). Que se presenta es el porcentaje de animales de cada grupo responde a la presentación de olor con un PER. Un ANOVA no reveló diferencias significativas entre los grupos en la fase de adquisición (F2, 189 = 1,299, p&gt; 0,05) o en la retención de la memoria (F2, 187 = 0,752, p&gt; 0,05). <img src="/files/ftp_upload/2282/2282fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La inyección de anisomicina 40 minutos después del último emparejamiento EC-EI reduce la retención de memoria de tres días y cuatro días después del entrenamiento. Los animales fueron entrenados con tres parejas EC-EI (adquisición) y se inyecta con una l mM anisomicina 10 (Aniso) o 1 l de PBS 1 h después de la prueba de entrenamiento. Se puso a prueba la memoria (memoria de retención) 24 h, 48 h, 72 y 96 h después. Que se presenta es el porcentaje de animales de cada grupo responde a la presentación de olor con un PER. La inyección de anisomicina conduce a una reducción significativa de la memoria de retención de 72 y 96 h después del entrenamiento (F1, 94 = 8.86, p &lt;0,05) como lo revela un análisis de varianza.

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Neurosci. 25, 11614-11618 (2005).</li><li>Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+recovery+from+extinction+depends+on+the+reconsolidation+of+the+acquisition+memory+in+an+appetitive+learning+paradigm+in+the+honeybee+(Apis+mellifera.">Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera.</a> J. Neurosci. 25, 4485-4492 (2005).</li><li>Stollhoff, N., Eisenhardt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consolidation+of+an+extinction+memory+depends+on+the+unconditioned+stimulus+magnitude+previously+experienced+during+training.">Consolidation of an extinction memory depends on the unconditioned stimulus magnitude previously experienced during training.</a> J. Neurosci. 29, 9644-9650 (2009).</li><li>Snodgrass, R. 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<ol><li> La captura de abejas: Para recoger las abejas libando con experiencia, las abejas están cayendo en la mañana o por la tarde, evitando el momento en que las abejas jóvenes son el 19 de vuelos de orientación. Recolectoras recopile polen o néctar. Las diferencias entre el polen y el néctar de forraje se han observado de acuerdo a su capacidad de respuesta de azúcar y su capacidad de aprendizaje 20. Con el fin de atrapar recolectores sólo néctar, una fuente de alimento artificial llena de una solución de sacarosa se pueden instalar cerca de la colmena y los animales pueden ser recogidos allí. Recolectoras de polen de regresar a la colmena pueden ser identificados por las canastas de polen en sus patas traseras 20. </li><li> La fijación y manipulación: enfriamiento extendido de las abejas en el hielo se debe evitar porque podría afectar su capacidad para aprender y sobrevivir hasta el final del experimento. Tarsos tienen que fijarse cuidadosamente dentro del tubo para evitar la estimulación accidental con una solución de sacarosa. Esto es importante, porque las abejas se ha demostrado que aprender por la estimulación del tarso con una solución de succrose 3,21. </li><li> Condicionamiento olfativo: el número de ensayos de condicionamiento, el intervalo entre ensayos, y el punto de prueba de tiempo puede variar dependiendo del enfoque del estudio 3,22. </li><li> Alimentación: El nivel de saciedad de las abejas se sabe que afectan a su rendimiento en el aprendizaje y la retención de la memoria 3,23. Esto tiene que ser tenido en cuenta en la planificación de los experimentos. </li><li> Inyección: sacos de aire se encuentran en el tórax de abejas 17. Estas partes vitales del sistema respiratorio son necesarios para la supervivencia. Por lo tanto se debe tener cuidado de no dañar los sacos de aire durante la inyección. La liberación de las burbujas de aire indica daños a los sacos de aire. </li></ol>

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Syringe Omnifix 20 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>B.Braun, Melsungen, Germany </td>
<td>4616200 V</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>White refined household sugar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kaisers Supermarket, Berlin, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clove oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bombastus, Freital, Germany </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multipette plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
<td>4981 000.019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rack for 30 bee tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Self-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Self-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UV light-permeable plexiglass pyramid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Self-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>height = 30cm, 
apex 3.5 x 3.5cm, 
base 18x18cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Sticky tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tesa, Hamburg, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillator sticks 1-5&mu;l</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Selzer, Driedorf-Roth, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillator tips 1-5&mu;l</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Selzer, Driedorf-Roth, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter paper 0.16-0.2 mm thick</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Macherey-Nagel, D&uuml;ren, Germany</td>
<td>MN 616 or MN615</td>
<td>Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter</td>
</tr>
<tr>
<td>Disposable hypodermic needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>B. Braun, Melsungen, Germany</td>
<td>4657683</td>
<td>0.45 mm diameter</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
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behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (apis mellifera)

Las abejas melíferas (Apis mellifera) son bien conocidos por sus habilidades de comunicación y orientación y por su impresionante capacidad de aprendizaje 1,2. Debido a que la supervivencia de una colonia de abejas depende de la explotación de fuentes de alimento, las abejas picadoras aprender y memorizar los sitios variable de flores, así como su rentabilidad. Forrajera abejas pueden ser entrenados fácilmente en un ambiente natural donde se alimentan en un sitio de alimentación y aprender las señales relacionadas, tales como el olor o color. Aprendizaje asociativo apetito también puede ser estudiada bajo condiciones controladas en el laboratorio por el condicionamiento de la respuesta de extensión probóscide (PER) de forma individual aprovechar las abejas 3,4. Este paradigma de aprendizaje permite el estudio de los mecanismos neuronales y moleculares que subyacen en el aprendizaje y la formación de la memoria de una manera sencilla y muy fiable 05.12. Un enfoque de la farmacología conductual se utiliza para estudiar los mecanismos moleculares. Los medicamentos son inyectados sistémicamente para interferir con la función de moléculas específicas durante o después del aprendizaje y la formación de la memoria 13-16. Aquí se demuestra cómo entrenar a las abejas aprovechada en el acondicionamiento de PER y la forma de aplicar los medicamentos sistémica por inyección en el músculo de vuelo de las abejas.

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Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

Se demuestra cómo implementar un método de farmacología del comportamiento en un paradigma de condicionamiento apetitivo olfativo de las abejas (Apis mellifera) mediante la aplicación sistémica de fármacos. Este método permite la investigación de los mecanismos de aprendizaje subyacente y formación de la memoria de una manera sencilla y fiable.

Farmacología del Comportamiento en el condicionamiento clásico de la respuesta de Extensión probóscide en abejas de la miel ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

19.2K vistas.  Freie Universität Berlin. Se demuestra cómo implementar un método de farmacología del comportamiento en un paradigma de condicionamiento apetitivo olfativo de las abejas (Apis mellifera) mediante la aplicación sistémica de fármacos. Este método permite la investigación de los mecanismos de aprendizaje subyacente y formación de la memoria de una manera sencilla y fiable.

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Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Grabación a gran escala conjuntos neuronales con sondas de silicona en la rata anestesiada

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Investigación

Neurociencias

Behavioral Determination of Stimulus Pair Discrimination of Auditory Acoustic and Electrical Stimuli Using a Classical Conditioning and Heart-rate Approach

Acute animal preparations have been used in research prospectively investigating electrode designs and stimulation techniques for integration into neural auditory prostheses, such as auditory brainstem implants1-3 and auditory midbrain implants4,5. While acute experiments can give initial insight to the effectiveness of the implant, testing the chronically implanted and awake animals provides the advantage of examining the psychophysical properties of the sensations induced using implanted devices6,7.
Several techniques such as reward-based operant conditioning6-8, conditioned avoidance9-11, or classical fear conditioning12 have been used to provide behavioral confirmation of detection of a relevant stimulus attribute. Selection of a technique involves balancing aspects including time efficiency (often poor in reward-based approaches), the ability to test a plurality of stimulus attributes simultaneously (limited in conditioned avoidance), and measure reliability of repeated stimuli (a potential constraint when physiological measures are employed).
Here, a classical fear conditioning behavioral method is presented which may be used to simultaneously test both detection of a stimulus, and discrimination between two stimuli. Heart-rate is used as a measure of fear response, which reduces or eliminates the requirement for time-consuming video coding for freeze behaviour or other such measures (although such measures could be included to provide convergent evidence). Animals were conditioned using these techniques in three 2-hour conditioning sessions, each providing 48 stimulus trials. Subsequent 48-trial testing sessions were then used to test for detection of each stimulus in presented pairs, and test discrimination between the member stimuli of each pair. 
This behavioral method is presented in the context of its utilisation in auditory prosthetic research. The implantation of electrocardiogram telemetry devices is shown. Subsequent implantation of brain electrodes into the Cochlear Nucleus, guided by the monitoring of neural responses to acoustic stimuli, and the fixation of the electrode into place for chronic use is likewise shown.

The application of a classical fear conditioning behavioral paradigm for auditory prosthetic research in rats is described. This paradigm provides a mechanism for identifying both detection of, and discrimination between, distinct acoustic and electrical stimuli using heart-rate as an outcome measure.

Determinación del comportamiento de discriminación de estímulos acústicos par de estímulos auditivos y de corriente mediante el condicionamiento clásico y el enfoque del ritmo cardíaco

Acute animal preparations have been used in research prospectively investigating electrode designs and stimulation techniques for integration into neural ...

The Mouse Forced Swim Test

The forced swim test is a rodent behavioral test used for evaluation of antidepressant drugs, antidepressant efficacy of new compounds, and experimental manipulations that are aimed at rendering or preventing depressive-like states. Mice are placed in an inescapable transparent tank that is filled with water and their escape related mobility behavior is measured. The forced swim test is straightforward to conduct reliably and it requires minimal specialized equipment. Successful implementation of the forced swim test requires adherence to certain procedural details and minimization of unwarranted stress to the mice. In the protocol description and the accompanying video, we explain how to conduct the mouse version of this test with emphasis on potential pitfalls that may be detrimental to interpretation of results and how to avoid them. Additionally, we explain how the behaviors manifested in the test are assessed.

The forced swim test is validated as an experimental approach to assess potential antidepressant efficacy in rodents. Experimental animals are placed in a tank of water and escape-related mobility behavior is quantified. The common procedures for the mouse version of this test are described.

El ratón de prueba de natación forzada

The forced swim test is a rodent behavioral test used for evaluation of antidepressant drugs, antidepressant efficacy of new compounds, and experimental ...

The Tail Suspension Test

The tail-suspension test is a mouse behavioral test useful in the screening of potential antidepressant drugs, and assessing of other manipulations that are expected to affect depression related behaviors. Mice are suspended by their tails with tape, in such a position that it cannot escape or hold on to nearby surfaces. During this test, typically six minutes in duration, the resulting escape oriented behaviors are quantified. The tail-suspension test is a valuable tool in drug discovery for high-throughput screening of prospective antidepressant compounds. Here, we describe the details required for implementation of this test with additional emphasis on potential problems that may occur and how to avoid them. We also offer a solution to the tail climbing behavior, a common problem that renders this test useless in some mouse strains, such as the widely used C57BL/6. Specifically, we prevent tail climbing behaviors by passing mouse tails through a small plastic cylinder prior to suspension. Finally, we detail how to manually score the behaviors that are manifested in this test.

The tail-suspension test is validated as an experimental procedure to assess antidepressant efficacy of drug treatments in mice. Mice are suspended by their tails for six minutes and escape-related behaviors are assessed. We describe procedures used in conducting the tail suspension test.

La prueba de la suspensión trasera

The tail-suspension test is a mouse behavioral test useful in the screening of potential antidepressant drugs, and assessing of other manipulations that ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Aire táctil y Análisis de Movimiento de estrategias de muestreo antenales de las abejas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Un Protocolo de Respuesta de probóscide Extensión para la Investigación de la plasticidad de comportamiento en Insectos: Aplicación a Basic, Biomédica y de Investigación Agrícola

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

Grabaciones simultáneas a largo plazo en dos etapas de procesamiento neuronal en Behaving abejas

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

La manipulación de neurofarmacológico restringida y de vuelo libre abejas de la miel,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...