Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental [K22ES012264 a AJRB] y una Sociedad Americana del Cáncer InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] piloto projectaward [a AJRB]. También queremos agradecer a los miembros del laboratorio de obispo para la lectura crítica del manuscrito y comentarios sobre el vídeo y Brown Adán, en particular, por el ejemplo de qué no hacer. Agradecemos al Dr. Donald McEwen del Cáncer del Instituto de Investigación de Niños Greehey por permitirnos el uso de su microscopio de disección / cámara de video puesta a punto para el rodaje del vídeo de la disección. Damos las gracias a Daron Brown en Instrumentos Corte para el afilado y reparación de nuestras herramientas de microdisección.

1. Eliminar el tejido extraños desde el exterior del ojo <ol><li> Vierta 1X PBS en la tapa de un plato de 35 mm. El nivel debe estar justo debajo del labio de la tapa. </li><li> El uso de pinzas rectas, los ojos de transferencia (s) del tubo de almacenamiento para el plato de 35 mm. Los ojos se sumergen en PBS, por dos razones: 1. Los tejidos extraños &quot;flotan&quot; fuera del ojo para que pueda ver y quitar con facilidad, y 2. Durante la disección, los ojos, naturalmente, mantienen su forma esférica, mientras que en la suspensión, que le permite trabajar con esta forma en lugar de combatirla. </li><li> Utilizando los dos pares de pinzas en ángulo (45 ° y 15 °), retire suavemente tanto músculo y el tejido conectivo como sea posible, tirando del tejido contra la corriente (es decir, hacia la córnea). Parte del tejido conectivo se mantendrá. Debería hacerse lo posible para exprimir el globo ocular lo menos posible. </li><li> El comercio de su 15 ° para tijeras pinzas de resorte. Mientras mantiene los ojos estable con 45 pinzas °, utilice las tijeras para cortar la primavera del músculo restante y del tejido conjuntivo, así como el nervio óptico. * Consejo: Use el borde exterior de las tijeras para empujar el tejido contra la corriente (hacia la brecha corneo-escleral) y después del ajuste. Continúe hasta que todos los tejidos extraños se ha quitado de la vista. </li></ol> 2. Retire la córnea y el cristalino <ol><li> Con la córnea hacia arriba, use las pinzas de 45 ° a pellizcar un pequeño pliegue en el centro de la córnea. </li><li> Usando las tijeras de primavera, hace una pequeña incisión en la base de la aleta. Dejar de lado la solapa. </li><li> La celebración de los ojos y permanezca con los fórceps, introduzca el extremo inferior de tijera dentro y perpendicular a la incisión y hacer un corte hacia la brecha corneo-escleral. Trate de mantener su hoja inferior bajo el iris para la córnea y el iris se cortan. No corte todo el camino a la brecha corneo-escleral. Mantenga las tijeras inserta en el ojo. </li><li> Usando su pinza de 45 °, gire con cuidado los ojos de manera que las tijeras son paralelas a la línea divisoria corneo-escleral y hacer un pequeño corte. Gire lentamente el Este tiempo 360, haciendo pequeñas incisiones en todos los sentidos. Una vez más, trate de mantener la hoja inferior de la tijera de su primavera bajo el iris lo tanto el iris y la córnea se corta. Levante el iris y la córnea del resto del ojo y desecharlos. </li><li> Inclinación de los ojos de su lado y presione suavemente hacia abajo en la mitad posterior del ojo, lo que obligó a la lente. Deseche los lentes. El interior de la ojera restante está rodeada por la retina neural, lo que debería ser suave y opaca. </li></ol> 3. Trimestre el ocular como resultado, lo que resulta en un 4 - &quot;pétalos&quot;, la flor-como la estructura <ol><li> El ojo debe estar colocada de tal modo que la apertura de la ojera es perpendicular a su cuerpo. Utilizar su pinza de 45 ° para mantener el equilibrio y la posición del ocular. </li><li> La celebración de las tijeras de primavera frente a usted lo que son perpendiculares a su cuerpo, introduzca el extremo inferior de las tijeras de su resorte en el borde superior de la copa de los ojos abiertos. Usando su pinza de 45 °, alinee cuidadosamente la copa del ocular para que un solo corte, se puede hacer directamente desde la línea divisoria corneo-escleral hacia la cabeza del nervio óptico. Todos los cortes deben ser perpendiculares a la línea divisoria corneo-escleral y menos que se especifique, debe ir lo más cerca de la cabeza del nervio óptico como sea posible sin cortar en ella. </li><li> Gire el ocular de 180 °, manteniendo la perpendicularidad con su cuerpo. Use la técnica en el paso 3.2 para hacer un corte perpendicular segundo. </li><li> Gire el ocular y repetir la técnica descrita en el apartado 3.2 para hacer dos cortes más. Los cuatro cortes deben ser lo más cercano a 90 º como sea posible. Tenga en cuenta que el ojo no es perfectamente esférica por lo que habrá una cierta variabilidad. </li></ol> 4. Corte cada uno de los cuatro &quot;pétalos&quot; en la mitad, resultando en un niño de ocho pétalos de flores-como la estructura <ol><li> La transferencia de la ojera en cuartos de la antena de 35 mm de una lámina limpia. Con el ocular hacia arriba, en primicia con la pinza de 45 °. Con cuidado, sacarlo del líquido y lo coloca en un portaobjetos limpio. </li><li> Utilizando los dos pares de pinzas en ángulo, abra suavemente el ojo, la retina neural hacia arriba. NO QUITE LA RETINA NEURAL-que ayuda a mantener la vista algunos de su forma esférica por lo que no están trabajando en contra de ella. También protege el EPR de ser dañado accidentalmente en los siguientes procedimientos. </li><li> Mover la tarjeta hasta que uno de los pétalos es perpendicular a su cuerpo. </li><li> Utilice su 15 pinzas °, agarrar suavemente la esquina de los pétalos. La esquina de los pétalos se debe córnea, retina neural o no del EPR. Levante suavemente la esquina, lo que le permite mantener su curvatura. </li><li> Inserte la hoja inferior de las tijeras de muelle entre los pétalos y la corredera. Alinear sus tijeras de tal manera que una sola recta, perpendicular corte puede hacerse desde la línea divisoria corneo-escleral hacia la cabeza del nervio óptico. Cortar tan cerca de la cabeza del nervio óptico como withou posiblet reducción en el mismo. Dejar de lado el pétalo, lo que le permite estar en la diapositiva. </li><li> Mover la tarjeta de 90 °, de modo que el pétalo siguiente es perpendicular a su cuerpo. Repita el paso 4.5. </li><li> Repita los pasos 4.5 y 4.6 veces más. La estructura resultante debe ser similar a una flor de ocho pétalos. </li></ol> 5. Retire la retina neural <ol><li> Pipeta de 100 a 200 l de PBS 1X a la muestra. Esto evitará que la retina neural se pegue a medida que despegarlo de la RPE. </li><li> Normalmente, la retina neural se unen libremente a la RPE. Sin embargo, se necesita práctica y habilidad para eliminar sólo la retina neural y no del EPR. Pellizque suavemente un pétalo de la retina neural con un par de pinzas en ángulo, mientras que la estabilización (manteniendo pulsado) el resto del ojo con el otro par de pinzas de ángulo. Tire de la retina neural del resto del ojo. Repita este procedimiento hasta que la retina neural todo ha sido eliminado. * Consejo: pegar la punta de la pinza de 15 ° en la cabeza del nervio óptico para anclar el ojo. A continuación, utilice las pinzas de 45 ° para barrer debajo de la retina neural y lo despega y lejos. Por lo general, la mejor manera de levantar la retina neural de la cabeza del nervio óptico hacia la brecha corneo-escleral. Asegúrese de tirar a la basura cualquier restos sueltos del iris. El iris es muy pegajosa y de lo contrario pueden quedar atrapados en el RPE. </li><li> Enjuagar la muestra con PBS 1X. Pipeta de 100 a 200 l de PBS 1X en la muestra y chupar una copia de seguridad. Deseche la PBS. Repita según sea necesario para eliminar el polvo y los escombros. </li></ol> 6. Montaje que muestra (s) en una diapositiva <ol><li> Pipeta de 80 a 90 l de 90% de glicerol en una nueva diapositiva en una forma rectangular. Use el lado de la punta de la pipeta para hacer un frotis, incluso, rectangular de glicerol. (Este es el procedimiento para el montaje de dos EPR en una diapositiva.) </li><li> Inserte el brazo inferior de 15 ° bajo unas pinzas de la muestra. Levante suavemente la muestra fuera de la diapositiva de disección. </li><li> Baje lentamente la muestra en el glicerol. Suavemente mueva la pinza a medida que los saca de debajo de la muestra. </li><li> Repita los pasos 6.1-6.3 para el otro espécimen. </li><li> Mover la tarjeta a fin de que el lado más largo es perpendicular a su cuerpo. Mantenga la cubierta de vidrio a un ángulo de 45 ° a la diapositiva de modo que está en contacto con la diapositiva. Se mueven hacia el frotis de glicerina hasta que se toquen. Mantener el contacto entre la cubierta de vidrio y de diapositivas, mueva lentamente la tapa de vidrio lejos de la mancha, hacia el borde de la diapositiva. Alinee los lados largos de la diapositiva y la cubierta de vidrio para que sean paralelas. Mantenga las esquinas de la cubierta de vidrio entre los dedos pulgar e índice. </li><li> Recoge el 15 ° en fórceps la otra mano. Cuna de la parte superior (gratuito) borde de la cubierta de cristal en la parte interior del brazo. Muy lentamente, baje la tapa de vidrio. Cuando se hace el contacto entre la cubierta de vidrio y el glicerol, parar y esperar a que el glicerol a emigrar. Repita este descenso y esperar hasta que el conjunto se monta RPE están completamente cubiertos. Esto es para prevenir el glicerol de alta viscosidad de la captura de burbujas de aire. NO empuje hacia abajo en el cubre - el glicerol se exprima debajo de él, haciendo una adherencia muy pobre. </li><li> Con esmalte transparente de uñas, pintura de todo el perímetro donde el cristal de la cubierta y deslice cumplir. </li><li> Colocar la placa en la parte superior de un estante vacío que se seque. </li></ol> 7. Los resultados representativos: El resultado de este procedimiento debe ser una estructura que se parece a una flor y debe ser bastante simétricas. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Todo RPE montaje de un ratón de tipo salvaje C67Bl/6J. RPE de color negro o agouti animales debe ser de color marrón oscuro y debe tener una superficie lisa. Es normal observar ondulaciones en la topografía de los pétalos. La pigmentación en cualquier muestra de dar puede ser algo variable, debido a la densidad variable de pigmentación tanto de la EPR y la coroides subyacente. Las flechas blancas señalan hipopigmentadas &quot;canales&quot; - esto es normal y es debido a la vascularización subyacente del ojo. Puntos de flecha azul a los daños físicos tanto a la EPR y la coroides subyacente. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Todo RPE montaje de un ratón diluido. Muestras recolectadas de animales diluidos puede variar en color de casi transparente a café con leche y cualquier espécimen es como tener la variabilidad dentro de ella, se indica en los círculos negro aquí. En general, RPE cosecha de los animales más jóvenes son más ligeros y los cosechados de los animales más viejos son más oscuras. Flechas de color negro indican algunos de los vasos subyacentes, que aparece hipopigmentadas. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Tinción phalloidin se puede utilizar para detectar daños físicos a la RPE. Tinción faloidina define claramente las membranas celulares, mostrando la forma hexagonal del epitelio. (A) Ejemplo de un ratón negro. (B) Ejemplo de un ratón diluido. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Un RPE mal disecado de un ratón diluido. (A) Los corchetes indican los márgenes de la córnea que son demasiado grandes, que pueden causar la deformación y / o plegables. Dentro del círculo negro se puede ver una cantidad excesiva de tejido extraño que no se han retirado de la parte posterior del ojo. Son particularmente evidente, porque la muestra es de un animal diluido. El pétalo de abajo a la izquierda está parcialmente doblada. (B) Este monte se tiene la apariencia de un molinillo de viento. Flechas de color negro indican algunos de los cortes que se hicieron. Muchos de los cortes de la brecha corneo-escleral hacia la cabeza del nervio óptico no están en línea con el diámetro. (C) flechas Negro indican cómo los recortes que se han hecho, de acuerdo con el diámetro y la perpendicular a la tangente.

<ol>
	<li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzo(a)pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice.">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li><li>Reliene, R. H. l. a. v. a. c. o. v. e., Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice.">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li><li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice.">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li><li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion.">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li><li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo.">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2010).</li><li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-,+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development.">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li><li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity.">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li><li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+and+the+RPE:+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt?.">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?.</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li></ol>

El EPR es el sitio de la prueba de p de la ONU, un ensayo in vivo de la homología dirigida reparación. El ensayo de p de la ONU ha sido utilizado para estudiar los efectos de los daños del ADN diferentes 1,2 y señalización daño en el ADN y los genes de reparación 3,4,5 de la frecuencia de homología dirigida reparación. Este ensayo es muy sensible, la detección de una sola célula eventos en el RPE 1. También puede detectar difer...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>straight forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4903</td>
<td>tip: .08 x .04 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>45&deg; forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5005</td>
<td>tip: .05 x.01 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>15&deg; "up" forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5045A</td>
<td>tip: .1 x.06 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5604</td>
<td>comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel</td>
</tr>
<tr>
<td>binocular dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ziess</td>
<td>Discovery V.8</td>
<td>use reflected light source</td>
</tr>
<tr>
<td>phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22283</td>
<td>Alexa Fluor 546</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium

El epitelio pigmentario retiniano (EPR) se encuentra en la parte posterior del ojo de los mamíferos, justo debajo de la retina neural, que contiene los fotorreceptores (conos y bastones). El EPR es una monocapa de células pigmentadas cúbicas y asociados estrechamente con la retina neural justo encima de él. Esta asociación hace que el RPE de gran interés para los investigadores que estudian enfermedades de la retina. El EPR es también el sitio de un ensayo in vivo de la homología dirigida por la reparación del ADN, la prueba de p de la ONU. El ojo del ratón es particularmente difícil de analizar debido a su pequeño tamaño (alrededor de 3,5 mm de diámetro) y su forma esférica. En este artículo se demuestra con todo detalle un procedimiento para la disección del ojo que resulta en un montaje conjunto de la RPE. En este procedimiento, se muestra cómo trabajar con y no contra, la estructura esférica del ojo. En pocas palabras, el tejido conectivo, el músculo y el nervio óptico se eliminan de la parte posterior del ojo. Luego, la córnea y el cristalino se eliminan. A continuación, se hacen cortes estratégicos que dan lugar a aplanamiento significativo del tejido restante. Por último, la retina neural se levanta suavemente, dejando al descubierto un EPR intacto, que aún está unido a la coroides y la esclera subyacente. Este monte se puede utilizar para realizar el ensayo de la ONU o p para la evaluación de inmunohistoquímica o inmunofluorescencia el tejido de RPE.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Una demostración formal de la disección de un ojo del ratón, lo que resulta en un montaje de todo el epitelio pigmentario de la retina.

Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

49.0K vistas.  Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology. Una demostración formal de la disección de un ojo del ratón, lo que resulta en un montaje de todo el epitelio pigmentario de la retina.

Video: Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Investigación

Neurociencias

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Preparación Todo el montaje del Adulto Drosophila Cordón nervioso ventral para inyección gigante tinte de fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Disección Del Músculo Transverso Abdominis Para El Análisis De La Unión Neuromuscular De Montaje Completo

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbal Inyección-Enfoque Subretinal de vectores virales para terapia génica en ratones epitelio pigmentario de la retina

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

A largo plazo, Cultivo Sin Suero De Explantes Organotípicos De La Retina De Ratón Con Epitelio Pigmento Retiniano Intacto

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Inmunostaining De Retinas De Montaje Completo Con El Método De Claro De Tejido CLARITY

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Aislamiento de retina de ratón y tratamiento con metanol para el estudio de las células ganglionares de la retina

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Autor destacado: Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de las células ganglionares de la retina  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de células ganglionares de la retina

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...