Bu çalışma, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenen [K22ES012264 AJRB] ve Amerikan Kanser Derneği InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] Pilot projectaward [AJRB]. Biz yapmak için değil ne, örneğin, el yazması ve özellikle de video ve Adam Brown hakkında yorum eleştirel okuma Bishop laboratuar üyeleri de teşekkür ederim. Biz Greehey Çocuk Kanser Araştırmaları Enstitüsü&#39;nden Dr Donald McEwen diseksiyon video film çekimi için kamera set-up onun diseksiyon kapsam / video kullanımına izin verdiği için teşekkür ederim. Biz netlik ve mikrodiseksiyon araçları tamir Corte Aletleri Daron Brown teşekkür ederim.

1. Gözün dışında fazladan doku çıkarın <ol><li> 1X PBS 35mm çanak kapağı içine dökün. Seviyesi sadece kapağın dudak altında olmalıdır. </li><li> 35mm çanak depolama tüpü düz forseps, transfer göz (ler) kullanarak. 1: Gözler iki nedenden ötürü PBS batmış. Görmek ve onları kolayca kaldırmak ve 2, böylece gereksiz dokular göz &quot;float&quot;. Diseksiyon sırasında asılı kalırken, gözün doğal olarak buna karşı ziyade bu şekli ile çalışmak için izin, küre şeklini koruyacaktır. </li><li> Açılı forseps (45 ° ve 15 °) her iki çifti kullanarak, hafifçe (kornea doğru yani) tahıl karşı doku çekerek, mümkün olduğu kadar çok kas ve bağ dokusu gibi çıkarın. Bazı bağ dokusu kalacaktır. Çaba mümkün olduğunca az göz küresinin sıkmak için yapılmalıdır. </li><li> Yaylı makas için 15 ° forseps Tic. 45 ° forseps ile göz sabit tutarken, kalan kas ve bağ dokusunun yanı sıra optik sinir kesip yaylı makas kullanın. * İpucu: Döşeme sonra tahıl karşı doku itmek için makas dış kenarına kullanın (corneo skleral bölmek doğru). Tüm yabancı doku, göz çıkarıldı kadar devam edin. </li></ol> 2. Kornea ve lens çıkarın <ol><li> Kornea yukarı bakacak şekilde, kornea merkezinde kat küçük bir çimdik 45 ° forseps kullanabilir. </li><li> Yaylı makas kullanılarak, flep tabanında küçük bir kesi yapmak. Flep gidelim. </li><li> Holding gözleri hala forseps düşük makas bıçak yerleştirin ve kesi dik ve corneo skleral bölmek doğru bir kesim yapmak. Alt bıçak, hem kornea ve iris kesilir, böylece, iris altında tutmak için çalışın. Corneo-skleral bölmek için tüm yol kesmeyin. Göz takılı makas tutun. </li><li> 45 ° forseps kullanarak, dikkatli bir makas corneo-skleral bölmek için paralel böylece göz döndürmek ve küçük bir kesim yapmak. Yavaş yavaş, etrafında küçük kesiler tüm yol, göz 360 ° döndürün. Yine, yaylı makas alt bıçak, iris ve kornea kesilir, böylece, iris altında tutmaya çalışın. Iris ve kornea gözün geri kalanı uzakta kaldırın ve atın. </li><li> Göz yan yatırın ve lens zorlayarak, gözün arka yarısında hafifçe bastırın. Lens atın. Kalan Göz yuvası içinde nöral retina, pürüzsüz ve mat görünmelidir kaplı olduğu. </li></ol> 3. Çeyrek 4 sonucu ortaya çıkan göz kapağı &quot;petaled&quot; çiçek gibi yapı <ol><li> Göz Göz yuvası açılması vücudunuza dik olacak şekilde yerleştirilmiş olmalıdır. 45 ° forseps, kararlı ve pozisyon Vizör adaptör kullanın. </li><li> Önünde yaylı makas Holding bu yüzden vücudunuza dik yaylı makas alt bıçak, açık göz fincan üst kenarına yerleştirin. 45 ° forseps kullanarak dikkatli bir şekilde, bir tek, düz kesim optik sinir başı doğru corneo-skleral ayrımı yapılabilir böylece göz fincan hizalayın. Tüm kesimler corneo-skleral bölmek için dik olmalı ve belirtilmediği sürece, içine kesmeden optik sinir başı olarak mümkün olduğunca yakın gitmek gerekir. </li><li> Vücudunuzun dikliğini koruyarak, Göz yuvası 180 ° döndürün. Ikinci bir dik kesim yapmak için 3.2 adımı tekniği kullanın. </li><li> Göz yuvası çevirin ve iki tane daha kesimler yapmak için 3.2 &#39;de açıklanan tekniği tekrarlayın. Tüm dört kesimler dışında 90 ° mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Bazı farklılıklar bulunmaktadır olacak kadar gözü mükemmel bir küre olmadığını aklınızdan çıkarmayın. </li></ol> 4. Sekiz yapraklı bir çiçek gibi bir yapı içinde, yarım her dört &quot;yaprakları&quot; Kes <ol><li> 35mm çanak temiz bir slayt dörde Göz yuvası aktarın. Göz yuvası yukarı bakacak şekilde, 45 ° forseps ile altında kepçe. Sıvı dikkatlice dışarı çıkarın ve temiz bir slayt üzerine yerleştirin. </li><li> Açılı forseps iki çifti kullanarak, yavaşça yukarı bakacak şekilde nöral retina ile göz açmak. ÇIKARMAYIN SİNİR Retina-buna karşı değildir bu yüzden göz küre şeklini bazı korumak yardımcı olur. Ayrıca, aşağıdaki yordamları kazara zarar görmesini RPE korur. </li><li> Slayt yaprakları bir vücudunuzun dik olana kadar çevirin. </li><li> 15 ° forseps yavaşça petal köşe kapmak. Petal köşesinde değil, nöral retina veya RPE kornea olmalıdır. Onun eğrilik korumak için izin köşesinde hafifçe yukarı kaldırın. </li><li> Petal ve slayt arasında yaylı makas alt bıçak yerleştirin. Makas kadar satır, bir tek, düz, dik kesme, optik sinir başı doğru corneo-skleral bölmek yapılabilir. Içine kesmeden optik sinir başı olarak mümkün olduğunca yakın kesin. Gidelimslaytta yalan sağlayan taç yaprağı. </li><li> Slayt 90 ° döndür, sonraki petal vücudunuza dik olacak şekilde. 4,5 adımı tekrarlayın. </li><li> Bunu iki kez daha adım 4.5 ve 4.6 tekrarlayın. Ortaya çıkan yapı, sekiz yapraklı bir çiçek gibi görünmelidir. </li></ol> 5. Nöral retina çıkarın <ol><li> Pipet 100-200 mcL numune üzerine 1X PBS. Bu nöral retinanın RPE soyulması gibi yapışmasını önleyecektir. </li><li> Genellikle nöral retina gevşek RPE eklenir. Ancak, sadece nöral retina ve RPE kaldırmak için uygulama ve beceri sürer. Açılı forseps diğer çift göz (basılı tutarak) geri kalanı stabilize bir çift açılı forseps ile yavaşça nöral retinanın bir taç yaprağı kavramak. Nöral retina gözün geri kalanı uzakta çekin. Tüm nöral retina kaldırıldı kadar bu işleme devam edin. * İpucu: göz çapa optik sinir başı 15 ° forseps ucu sopa. Sonra nöral retina altına süpürüyor 45 ° forseps kullanımı ve kapalı asansör ve. Nöral retina, corneo skleral bölmek doğru optik sinir başı kaldırmak için en iyi genellikle. Iris herhangi bir gevşek kalıntıları çekmeye emin olun. Iris oldukça yapışkan ve aksi RPE sıkışmış alabilirsiniz. </li><li> 1X PBS ile örnek durulayın. Pipet 100-200 numune içine 1X PBS mcL ve yedekleme emmek. PBS atın. Toz ve enkaz kaldırmak için gerekli tekrarlayın. </li></ol> 6. Bir slayt Mount numune (ler) <ol><li> Pipet 80-90 mcL dikdörtgen şeklinde yeni bir slayt üzerine% 90 gliserol. Gliserol, hatta bir dikdörtgen karalama yapmak için pipet ucu tarafında kullanın. (Bu bir slayt iki RPE montaj için bir işlemdir.) </li><li> , Örnek altında 15 ° forseps alt kolu takın. Diseksiyon slayt kapalı örnek yavaşça kaldırın. </li><li> Gliserol içine yavaşça örnek daha düşüktür. Yavaşça numune altından onları çekin forseps wiggle. </li><li> Diğer örnek için 6,1-6,3 adımları tekrarlayın. </li><li> Uzun kenarı vücudunuzun dik böylece slayt döndürün. Kapak cam tutun 45 ° slayt dokunmadan böylece slayt açı. Dokunmak kadar gliserol smear doğru hareket ettirin. Kapak cam ve slayt arasındaki temas sağlanması, slayt kenarına doğru yavaş yavaş, smear uzak kapak cam taşımak. Slayt, uzun kenarlarında ve kapak cam hizaya böylece paralel. Başparmak ve işaret parmağı arasındaki kapak cam köşelerinden tutun. </li><li> Diğer taraftan 15 ° forseps Pick up. Üst (ücretsiz) kol Crook kapak cam kenarına Cradle. Çok yavaş, kapağı cam düşüktür. Kapak cam ve gliserol arasındaki temas yapıldığında, durdurma ve gliserol geçirmek için bekleyin. Bu düşürücü ve RPE bütün bağlar tamamen kaplıdır kadar bekleyen tekrarlayın. Bu hava kabarcıkları yakalamak oldukça viskoz gliserol önlemek için. COVERGLASS aşağı doğru itin VERMEYİN - gliserol yapışma çok zayıf altında sıkmak. </li><li> Açık oje, kapak cam ve slayt karşılamak çevresinde boya. </li><li> Kuruması için boş bir raf üstünde slayt yerleştirin. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Bu prosedürün sonucu, bir çiçek gibi görünüyor ve oldukça simetrik olmalıdır bir yapı olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Tüm montaj RPE wild tip C67Bl/6J fare, siyah veya agouti hayvanların gelen RPE koyu kahverengi renkli olmalı ve pürüzsüz bir yüzeye sahip olmalıdır . Bu yaprakları topografya dalgalı fark normaldir. Verecek herhangi bir numune üzerinde pigmentasyon RPE ve altta yatan koroid hem değişken pigmentasyon yoğunluğu nedeniyle biraz değişken olabilir. Beyaz oklar hipopigmente &quot;kanallar&quot; noktası - Bu normal bir durumdur ve göz altında yatan damarsal nedeniyle. RPE ve altta yatan koroid hem fiziksel hasar Mavi ok puan. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Seyreltilmiş fare Tüm montaj RPE. Seyreltik hayvanlardan elde edilen hasat Örnekler café au lait neredeyse saydam renk değişebilir ve herhangi bir örnek siyah daireler burada belirtilen, içinde değişkenlik olması gibi. Genel olarak, genç hayvanlardan elde edilen hasat RPE, daha hafif ve yaşlı hayvanlarda hasat koyu. Siyah oklar hipopigmente görünen altta yatan damarsal bazı göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Phalloidin boyama RPE fiziksel hasar tespit etmek için kullanılabilir. Phalloidin boyama hücre açıkça özetliyorepitelin altıgen şekil gösteren membranlar. (A) siyah bir fare örneği. (B) seyreltilmiş fare örneği. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Seyreltilmiş fare kötü disseke RPE (A) Parantezler ve / veya katlama burkulma neden olabilir korneanın çok geniş marjları gösterir. Siyah bir daire içinde gözün arka kaldırıldı gereksiz doku aşırı miktarda görebilirsiniz. Örnek seyreltik bir hayvan çünkü özellikle açıktır. Sol alt taç yaprağı kısmen katlanmış. (B) Tüm bu montaj bir fırıldak bir görünüme sahiptir. Siyah oklar yapılmış olan bazı kesim göstermektedir. Birçok optik sinir başı doğru corneo-skleral bölmek kesim çapı ile uyumlu değildir. (C) Siyah oklar keser teğet çapı ve dik doğrultusunda yapılmış olmalıdır nasıl göstermektedir.

<ol>
	<li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzo(a)pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice.">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li><li>Reliene, R. H. l. a. v. a. c. o. v. e., Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice.">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li><li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice.">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li><li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion.">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li><li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo.">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2010).</li><li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-,+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development.">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li><li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity.">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li><li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+and+the+RPE:+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt?.">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?.</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li></ol>

RPE bir homoloji yönettiği onarım in vivo tayininde, p un testin sitesidir. P un tahlil homoloji yönettiği onarım sıklığı üzerine etkileri farklı DNA zararların 1,2 ve DNA hasarı sinyalizasyon ve onarım genleri 3,4,5 incelemek için kullanılır olmuştur. Bu testte, RPE 1 tek hücreli olaylar tespit son derece duyarlıdır. Ayrıca homoloji yönettiği onarım olayların gelişimi 6 sırasında zamanlama farklılıkları ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>straight forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4903</td>
<td>tip: .08 x .04 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>45&deg; forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5005</td>
<td>tip: .05 x.01 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>15&deg; "up" forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5045A</td>
<td>tip: .1 x.06 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5604</td>
<td>comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel</td>
</tr>
<tr>
<td>binocular dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ziess</td>
<td>Discovery V.8</td>
<td>use reflected light source</td>
</tr>
<tr>
<td>phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22283</td>
<td>Alexa Fluor 546</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium

Memeli gözün arkasındaki retina pigment epitel (RPE), fotoreseptör (çubuklar ve koniler) içeren nöral retina altında yatıyor. RPE yakından sadece yukarıda nöral retina ile pigmentli küboid hücreleri ve iştiraklerin tek tabaka. Bu dernek, retina hastalıklarının çalışan araştırmacılar büyük ilgi RPE yapar. RPE homoloji yönettiği DNA onarımı, p un tahlil in vivo tayininde bir sitedir. Küçük boyutu nedeniyle teşrih (çapı 3.5mm hakkında) ve küresel şekli fare göz özellikle zordur. Bu makalede ayrıntılı olarak RPE bir bütün montaj ile sonuçlanan göz diseksiyon için bir prosedür ortaya koymaktadır. Bu prosedürde, küresel yapısı, karşı göz ile değil, nasıl çalıştığını gösteriyor. Kısaca, bağ dokusu, kas, ve optik sinir gözün arka kaldırılır. Sonra, kornea ve lens kaldırılır. Sonraki kalan doku önemli düzleşme, stratejik kesimler bu sonucu yapılır. Son olarak, nöral retina nazikçe, hala altta yatan koroid ve sklera bağlı bozulmamış bir RPE, ifşa, kapalı olduğunu kaldırdı. Bütün bu montaj p un tahlil veya RPE doku immünhistokimya veya immunofluorescent değerlendirilmesi için gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Bir fare göz diseksiyon resmi bir gösteri, retinal pigment epitel bir bütün montaj.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

49.0K Görüntüleme.  Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology. Bir fare göz diseksiyon resmi bir gösteri, retinal pigment epitel bir bütün montaj.

Video: Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Nörobilim

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Yetişkin Tüm Dağı Hazırlık Drosophila Dev Fiber Boya Enjeksiyon Ventral Sinir Kablosu

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Fareler Retina Pigment Epitel Gen Tedavisi için Viral Vektörler Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyon

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Sağlam Retina Pigment Epitel ile Organotipik Fare Retina Eksplantlarının Uzun Süreli, Serumsuz Ekimi

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Retinal Ganglion Hücrelerini İncelemek için Fare Retina İzolasyonu ve Metanol Tedavisi

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Yazar Spotlight: Retinal Ganglion Hücrelerinin İncelenmesi için Metanol Bazlı Tam Montajlı Hazırlık  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...