עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה [K22ES012264 כדי AJRB] ו אמריקאי האגודה למלחמה בסרטן InstitutionalResearch גרנט [ACS-IRG-00-173-04] טייס projectaward [אל AJRB]. אנו מודים גם אנשי המעבדה הבישוף לקריאה ביקורתית של כתב היד והערות על וידאו ואדם בראון בפרט, למשל של מה לא לעשות. אנו מודים ד&quot;ר דונלד מקיואן לחקר הסרטן Greehey ילדים המכון מאפשר לנו להשתמש היקף הניתוחים שלו / וידאו מצלמה הגדרת לצילום הווידאו לנתיחה. אנו מודים Daron בראון מכשירים Corte עבור חידוד ותיקון של כלי microdissection שלנו.

1. הסרה של רקמה חיצוניים מבחוץ של העין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 1X PBS לתוך המכסה של צלחת 35mm. הרמה צריכה להיות ממש מתחת שפת המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים ישר, להעביר עין (ים) מהצינור אחסון המנה 35mm. עיניים שקועות PBS משתי סיבות: 1. הרקמות החיצוניות יהיה &quot;לצוף&quot; הרחק מן העין, כך שתוכל לראות ולהסיר אותם בקלות, 2. במהלך הניתוח, העין באופן טבעי לשמור על הצורה הכדורית שלו בעוד ההשעיה, ומאפשר לך לעבוד עם הצורה הזו ולא נגדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני זוגות של מלקחיים זווית (45 ° ו 15 °), להסיר בעדינות רבה כמו שריר ורקמת חיבור ככל האפשר, מושך את רקמת נגד הזרם (כלומר לכיוון הקרנית). יש רקמת חיבור יישאר. מאמץ צריך להיעשות כדי לסחוט את גלגל העין מעט ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המסחר מלקחיים שלך 15 מעלות במשך מספריים האביב. בעוד מחזיק את העין יציב עם מלקחיים 45 °, להשתמש במספריים באביב כדי לחתוך שריר הנותרים רקמת חיבור, כמו גם את עצב הראייה. * טיפ: השתמש בקצה החיצוני של המספריים לדחוף את רקמת נגד הזרם (לכיוון לחלק corneo-scleral) ולאחר מכן לקצץ. המשך עד שכל הרקמות החיצוניות הוסר מן העין. </li></ol> 2. הסר את הקרנית ואת העדשה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הקרנית פונה כלפי מעלה, יש להשתמש במלקחיים 45 מעלות לצבוט את קפל קטן במרכז הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים האביב, לעשות חתך קטן בבסיס של דש. עזוב דש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק את העיניים עדיין עם מלקחיים, הכנס את להב מספריים נמוך לתוך בניצב החתך ולעשות חתך לכיוון לחלק corneo-scleral. נסו לשמור על הלהב התחתונה תחת הקשתית כך גם קרנית איריס נחתכים. אין לחתוך את כל הדרך לחלק corneo-scleral. שמור מספריים מוכנס בעיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים שלך 45 °, בזהירות לסובב את העיניים כך מספריים שלך מקבילות לחלק corneo-scleral ולעשות חתך קטן. לאט לאט לסובב את העין ° 360, מה שהופך חתכים קטנים כל הדרך מסביב. שוב, מנסה לשמור את הלהב התחתון של המספריים האביב שלך לפי קשתית כך גם את איריס הקרנית נחתכים. הרם את איריס הקרנית רחוק משאר העין וזורקים אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את העין על צידו ולחצו בעדינות על החצי האחורי של העין, מה שאילץ את העדשה החוצה. מחק את העדשה. החלק הפנימי של עיינית הנותר הוא בשורה של הרשתית העצבית, אשר צריך להיראות חלקות אטום. </li></ol> 3. הרובע עיינית וכתוצאה מכך, וכתוצאה מכך 4 - &quot;עטורת פרחים&quot;, פרח דמוי מבנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העין צריכה להיות ממוקמת כך פתיחת עיינית היא בניצב לגוף שלך. שימוש במלקחיים 45 ° עד עיינית שלך יציב ואת המיקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת מספריים האביב שלך מולך אז הם ניצבים הגוף שלך, להכניס את הלהב התחתון של המספריים האביב שלך לתוך הקצה העליון של גביע לפתוח את העין. בעזרת מלקחיים שלך 45 °, בזהירות ליישר את כוס העין כך חתך בודד, ישר יכול להיות עשוי מחלקים corneo-scleral כלפי ראש עצב הראייה. כל הקיצוצים צריכה להיות בניצב לחלק corneo-scleral ו אלא אם כן צוין, צריך ללכת קרוב לראש עצב הראייה ככל האפשר מבלי לחתוך אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב 180 ° עיינית, שמירה נצבות עם הגוף שלך. השתמש בטכניקה בשלב 3.2 לעשות חתך בניצב השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את עיינית וחזור על הטכניקה המתוארת 3.2 לבצע שני חתכים נוספים. כל ארבעת קיצוצים צריך להיות קרוב עד 90 ° בנפרד האפשרי. יש לזכור כי העין אינה כדורית מושלמת כך יהיו כמה השתנות. </li></ol> 4. חותכים כל אחד מארבעת &quot;עלי כותרת&quot; במחצית, והתוצאה היא מבנה הפרח דמוי שמונה עלה כותרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את עיינית לרבעים מצלחת 35mm לשקופית נקי. עם עיינית פונה כלפי מעלה, סקופ תחת אותה עם מלקחיים 45 מעלות. הרם בזהירות את זה של הנוזל ומניחים אותו בשקופית נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני זוגות של מלקחיים זוויתי, בעדינות לפתוח את העיניים, עם הרשתית העצבית פונה כלפי מעלה. אין להסיר העצבית ברשתית העין, זה עוזר לשמור על כמה צורה כדורית שלה אז אתה לא פועלים נגד זה. הוא גם מגן על הרשתית מפני נזק בטעות בהליכים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את השקף עד שאחד עלי הכותרת הוא בניצב לגוף שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים 15 שלך מעלות, בעדינות לתפוס את הפינה של עלי כותרת. הפינה של עלה כותרת יש הקרנית, לא הרשתית הרשתית העצבית או. הרם את בפינה בעדינות, שמאפשר לו לשמור על העקמומיות שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הלהב התחתון של המספריים האביב שלך בין כותרת לבין שקופיות. הקו עד מספריים שלך כזה אחד, ישר, בניצב לחתוך יכול להיות עשוי מחלקים corneo-scleral כלפי ראש עצב הראייה. גזור קרוב לראש עצב הראייה כפי withou אפשרילא לחתוך אותו. עזוב עלה כותרת, המאפשר זה לשכב על השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את השקופית 90 °, כך עלה כותרת הבא הוא בניצב לגוף שלך. חזור על שלב 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.5 ו 4.6 פעמיים נוספות. המבנה וכתוצאה מכך צריך להיראות כמו פרח שמונה עלה כותרת. </li></ol> 5. הסר את הרשתית העצבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 100-200 μL של 1X PBS על הדגימה. זה ימנע את הרשתית העצבית יידבקו כפי שאתה לקלף אותו על הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל הרשתית העצבית מחובר באופן רופף על הרשתית. לעומת זאת, לקחת תרגול ומיומנות כדי להסיר רק את הרשתית העצבית ולא הרשתית. בעדינות לתפוס עלה כותרת של הרשתית העצבית עם זוג אחד מלקחיים זווית תוך ייצוב (החזקת) את שאר בעין עם זוג השני של מלקחיים זווית. משוך את הרשתית העצבית רחוק משאר של העין. המשך הליך זה עד הרשתית העצבית כולה הוסרה. * טיפ: מקל קצה מלקחיים 15 שלך · אל ראש עצב הראייה לעגן את העין. ואז להשתמש במלקחיים 45 מעלות לטאטא מתחת הרשתית העצבית והרם אותו משם. זה בדרך כלל הטובה ביותר להרים את הרשתית העצבית מהראש עצב הראייה לכיוון לחלק corneo-scleral. הקפידו להתרחק מכל שאריות רופפת של איריס. הקשתית דביק למדי, אחרת יכול להיתקע על הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הדגימה עם 1X PBS. פיפטה 100-200 μL של 1X PBS לתוך הדגימה ולמצוץ אותו בחזרה. בטל PBS. חזור על הצורך להסיר אבק ופסולת. </li></ol> 6. הר את הדגימה (ים) בשקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 80-90 μL של גליצרול 90% לשקופית חדשה צורה מלבנית. השתמש בצד של קצה פיפטה לעשות למרוח אפילו, מלבני של גליצרול. (זהו הליך פיחלץ שני הרשתית בשקופית אחת.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הזרוע התחתונה של 15 ° מלקחיים תחת הדגימה. הרם בעדינות את הדגימה את השקופית הניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוריד את הדגימה לתוך גליצרול. בעדינות לכשכש מלקחיים כמו שאתה מושך אותם מתחת הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6.1-6.3 עבור הדגימה אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את השקופית כך שהצד הארוך בניצב לגוף שלך. החזק זכוכית לכסות שלך 45 ° זווית לשקופית, כך שהוא נוגע שקופיות. הזז אותו לכיוון למרוח את גליצרול עד שהם נוגעים. שמירה על קשר בין הזכוכית המכסה והחלק, לאט להזיז את זכוכית לכסות הרחק למרוח, לעבר קצה המגלשה. בשורה ארוכה של שקופיות הצדדים ואת מכסה זכוכית, כך הם מקבילים. החזק את קצוות הזכוכית המכסה בין האגודל לאצבע המורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את 15 מלקחיים · ב היד השנייה. עריסת את הקצה העליון (חינם) של זכוכית המכסה בכיפוף של היד. לאט לאט, להוריד את מכסה זכוכית. כאשר הקשר הוא בין הזכוכית המכסה את גליצרול, לעצור ולחכות גליצרול כדי להגר. חזור על הפחתת ומחכה עד mounts כל הרשתית מכוסים במלואם. זה כדי למנוע את גליצרול צמיגה מאוד ללכוד בועות אוויר. אל תלחץ על COVERGLASS - גליצרול יהיה לסחוט אותו מתחת, מה שהופך הידבקות עניים מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברור עם לק, צבע מסביב למתחם שבו הזכוכית המכסה והחלק להיפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את השקף על גבי מדף ריק לייבוש. </li></ol> 7. נציג תוצאות: התוצאה של הליך זה יש מבנה שנראה כמו פרח צריך להיות סימטרי למדי. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. שלמות הרשתית הר מן העכבר wildtype C67Bl/6J. הרשתית משחור או חיות agouti צריך להיות חום כהה בצבע צריך משטח חלק. זה נורמלי לשים לב הגליות בתוך הטופוגרפיה של עלי הכותרת. פיגמנטציה על כל דגימה לתת יכול להיות משתנה במקצת, עקב צפיפות משתנה של פיגמנטציה של הרשתית והן דמית העין הבסיסית. חיצים הצבע הלבן &quot;ערוצי&quot; hypopigmented - זה נורמלי נובע vasculature הבסיסית של העין. החץ הכחול מצביע על נזק פיזי הרשתית והן דמית העין הבסיסית. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. שלמות הרשתית הר מן העכבר לדלל. דוגמאות שנקטפו מן החי ניתן לדלל טווח צבע כמעט שקוף לבית קפה בחלב וכל דגימה אחת היא רוצה השתנות בתוך זה, המצוין עיגולים שחורים כאן. באופן כללי, הרשתית שנקטפו מן החי הצעיר קלים אלה שנקטפו מן החי הם ישנים יותר כהה. החצים מצביעים שחור חלק vasculature הבסיסי, המופיע hypopigmented. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. מכתים Phalloidin יכול לשמש כדי לזהות נזק פיזי הרשתית. מכתים Phalloidin בבירור מתאר את קרום התא, מראה את צורת משושה של האפיתל. (א) דוגמה של עכבר שחור. (ב) דוגמה מתוך עכבר לדלל. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הרשתית גזור גרוע מכל עכבר לדלל. (א) בסוגריים מצביעים בשולי הקרנית כי הם רחבים מדי, דבר שיכול לגרום קריסה ו / או קיפול. בתוך העיגול השחור אתה יכול לראות כמויות עודפות של רקמות זרים שלא הוסרו מהחלק האחורי של העין. הם בולטים במיוחד כי המדגם הוא מבעל חיים לדלל. עלה כותרת בצד שמאל למטה הוא מקופל חלקית מעל. (ב) זה הר כולו מראה של שבשבת. החצים מצביעים שחור חלק הקיצוצים שנעשו. רבים חתכים לחלק corneo-scleral כלפי ראש עצב הראייה אינם בקנה אחד עם קוטר. (ג) חיצים שחורים לציין כיצד הקיצוץ צריך להיות עשוי, בהתאם לקוטר ו בניצב המשיק.

<ol>
	<li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzo(a)pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice.">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li><li>Reliene, R. H. l. a. v. a. c. o. v. e., Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice.">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li><li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice.">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li><li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion.">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li><li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo.">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2010).</li><li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-,+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development.">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li><li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity.">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li><li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+and+the+RPE:+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt?.">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?.</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הרשתית היא אתר של האו&quot;ם p assay, ב assay-vivo של תיקון הומולוגיה מכוונת. Assay בלתי p נעשה שימוש כדי לחקור את ההשפעות של נזקי דנ&quot;א שונה 1,2 ו נזק לדנ&quot;א איתות גנים לתקן 3,4,5 על תדר של תיקון, הומולוגיה מכוונת. Assay זה רגיש במיוחד, גילוי תא בודד...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>straight forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4903</td>
<td>tip: .08 x .04 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>45&deg; forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5005</td>
<td>tip: .05 x.01 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>15&deg; "up" forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5045A</td>
<td>tip: .1 x.06 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5604</td>
<td>comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel</td>
</tr>
<tr>
<td>binocular dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ziess</td>
<td>Discovery V.8</td>
<td>use reflected light source</td>
</tr>
<tr>
<td>phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22283</td>
<td>Alexa Fluor 546</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium

אפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית) שוכנת בחלק האחורי של העין של יונקים, ממש מתחת לרשתית עצביים, אשר מכיל את photoreceptors (מוטות קונוסים). הרשתית היא monolayer של תאים cuboidal וחבריו בשיתוף פעולה הדוק עם פיגמנט הרשתית העצבית בדיוק מעל אותה. אגודה זו הופכת את הרשתית עניין רב החוקרים ללמוד מחלות רשתית. הרשתית היא גם באתר של assay ב-vivo של תיקון הומולוגיה ביים DNA, assay בלתי p. העין עכבר קשה במיוחד לנתח בשל גודלו הקטן (כ 3.5 מ&quot;מ קוטר) ואת הצורה הכדורית שלו. מאמר זה מדגים בפירוט הליך לנתיחה של העין וכתוצאה מכך הר שלם של הרשתית. בהליך זה, אנו מראים כיצד לעבוד עם, ולא נגד, במבנה הכדורית של העין. בקצרה, ברקמת השריר החיבור, ואת עצב הראייה יוסרו מהחלק האחורי של העין. ואז, הקרנית ואת העדשה יוסרו. בשלב הבא, חתכים אסטרטגי נעשים כי התוצאה משטחת משמעותי של הרקמה הנותרת. לבסוף, הרשתית העצבית היא הרימה בעדינות את וחשף הרשתית שלם, אשר מחוברת עדיין דמית העין הבסיס והלחמית. הר זה כל שניתן להשתמש בהם כדי לבצע את assay בלתי p או הערכה או אימונוהיסטוכימיה immunofluorescent של רקמת הרשתית.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

הפגנה רשמית של דיסקציה של העין עכבר, וכתוצאה מכך הר שלם של אפיתל הפיגמנט ברשתית.

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

49.0K Views.  Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology. הפגנה רשמית של דיסקציה של העין עכבר, וכתוצאה מכך הר שלם של אפיתל הפיגמנט ברשתית.

Video: Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

הר הכנה שלמים של המבוגר תסיסנית עצבי חוט הגחון עבור הזרקת סיבים ענק דיי

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

טווח ארוך, טיפוח ללא סרום של אורגנוטיפי עכבר רשתית explants עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

בידוד רשתית עכבר וטיפול במתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

מחבר זרקור: הכנה מלאה מבוססת מתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

תכשיר שלם על בסיס מתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...