Los autores desean agradecer al laboratorio del profesor Anthony Windebank por compartir su experiencia en la disección de DRG y la cultura, así como el profesor Chen Shaochen útil para los debates sobre la instalación de DMD. Esta investigación fue financiada en parte por la Universidad de Tulane y subvenciones de la Junta de Regentes de Louisiana (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) y el NIH (NS065374).

1. DMD de configuración <ol><li> La junta DMD, guía de luz UV (con colimador) y lente objetivo de 4x, están todos montados verticalmente sobre una mesa de aislamiento de vibración. </li><li> La guía de luz UV debe ajustarse de modo que la luz incide en la serie del espejo en un ángulo de 45 º respecto al plano de los espejos, y 24 ° por debajo del plano de los espejos (Figura 1). </li><li> La lente del objetivo está montado de modo que la distancia de la DMD en la lente del objetivo se corresponde con la longitud focal asociada a la lente. </li><li> Un microscopio invertido se coloca por debajo de la lente del objetivo, de tal manera que la luz enfocada reflejada por la DMD pueden ser visualizados a través del microscopio. La distancia desde la lente del objetivo a la superficie de la polimerización de aproximadamente debe corresponder a la distancia de trabajo de la lente. La etapa en el microscopio se puede utilizar para ajustar la distancia de enfoque fino de la imagen. Esta distancia puede variar dependiendo de la superficie de polimerización elegido. </li></ol> 2. Construcciones de doble hidrogel para cultivos de explantes de tejidos A. DRG adhesión explante <ol><li> Recubrir las paredes de los 6 y colágeno recubiertas insertos de cultivo celular (Corning) con Rain-X, teniendo cuidado de evitar la propia membrana. (Por otra parte, una pluma barrera hidrofóbica puede ser utilizado.) </li><li> Inserta hidratar durante la noche con 1,5 ml de medio de adherencia en una incubadora a 37 ° C y 5% CO 2. Medio de la adhesión es de tamaño medio neurobasal con suero fetal bovino al 10%, 1% penicilina / estreptomicina, 0,5 mM L-glutamina, y 20 mg / ml de NGF. </li><li> La cosecha de embriones ganglios de la raíz dorsal (GRD) de los cachorros E-15 de rata. DRG debe ser chapada en colágeno recubiertas de 6 y se inserta, hasta cuatro por cada inserción. </li><li> Incubar inserta durante 2 horas para permitir la DRG adhesión a la membrana. </li></ol> B. Dinámica fotopolimerización máscara Un dispositivo digital de microespejos (DMD) es una resolución de 1024 x 768 matriz de espejos individuales, similar a la de los televisores de proyección, lo que refleja la luz de forma selectiva sobre la base de la posición del espejo. Para nuestros propósitos, la DMD se utiliza a los rayos ultravioleta del patrón (UV) en hidrogeles photocrosslinkable, la creación de geometrías especificable hidrogel de una manera sencilla y rápida. La Figura 1 muestra la configuración de la trayectoria de la luz UV y la DMD. A pesar de nuestra DMD es una unidad independiente, el dispositivo también puede ser integrado para su uso con muchos microscopios existentes. <ol><li> Eliminar todo el líquido sobrante de insertar y añadir 500 l de medio de polimerización en el interior del inserto. Medio de polimerización contiene 10% de PEG (1000 MW) y el 0,5% Irgacure 2959 disuelto en medio neurobasal suplementado con 20 mg / ml de NGF y el 1% penicilina / estreptomicina. </li><li> Colocar la parte inferior del equipo DMD en un portaobjetos de vidrio de lluvia X tratados. </li><li> Cargar la imagen en blanco y negro adecuado para ser utilizado como una &quot;fotomáscara&quot; en la DMD, a través del uso de la interfaz gráfica de usuario incluye el programa ALP-3 básicos. Para nuestros propósitos, una forma de bifurcación fue elegido para permitir la aplicación de sistemas de guía de las neuritas. </li><li> Utilizando un microscopio invertido para la visualización, alinear los explantes de tejido con la ubicación adecuada en la fotomáscara una fuente de luz visible se refleja en el DMD. </li><li> Cambiar la fuente de luz visible de la fuente de luz UV, e iluminar la solución de PEG hasta reticulación es suficiente. (Para las condiciones dadas y 5,0 vatios / cm 2 de incidentes en la DMD, la reticulación se puede completar en tan sólo 55 segundos.) Repita para todos los GRD cuatro en la inserción. </li><li> Lave cada insertar tres veces con DPBS estéril y 1% Pen-Strep. </li><li> Añadir medio de cultivo 1,5 ml por debajo de los insertos de cultivo celular, y hasta que se estabilice en una incubadora durante 30 minutos. Medio de crecimiento es de medio neurobasal contiene 2% de B-27, Pen 1% / estreptomicina, 0,5 mM L-glutamina, y 20 mg / ml de NGF. </li></ol> C. Secundaria hidrogel Puramatrix <ol><li> Para aplicaciones neuronal, el 1% Puramatrix se diluye de acuerdo con las instrucciones del fabricante a 0,15% en H 2 O estéril y se complementa con 1 mg / ml laminina soluble. </li><li> Todos los medios se debe quitar el exceso de los huecos de PEG, que contienen los explantes de DRG, utilizando un aplicador con punta de algodón estéril, Kimwipe o micropipeta. </li><li> Puramatrix se añade a los vacíos de PEG con una micropipeta con el fin de llenar el espacio vacío sin desbordarse. Dependiendo del volumen de vacío, por lo general ~ 1 l se utiliza por construir. </li><li> Puramatrix comienza el proceso de auto-ensamblaje de inmediato al entrar en contacto con una solución salina fisiológica, es decir, el PEG hinchada, pero 1,5 ml de medio de cultivo se agrega debajo de la inserción y se colocan en la incubadora durante una hora para asegurar la gelificación total. </li><li> Inicialmente, Puramatrix es ligeramente ácida, por lo que cambiar los medios de comunicación después de una hora para permitir que el pH se equilibre. </li><li> Cambios en los medios de comunicación se requiere aproximadamente cada 48 horas. Tenga cuidado de que todos los medios de comunicaciónañadido por debajo de la inserción, para proteger la integridad de Puramatrix mecánicamente débil. </li></ol> Agarosa <ol><li> Para aplicaciones neuronal, agarosa se diluye a una solución al 1% en medio de cultivo y se coloca en un baño de agua a 60 º C hasta que la agarosa se disuelva completamente (aproximadamente 1 hora). La solución se complementa con 1 mg / ml laminina soluble. </li><li> Todos los medios se debe quitar el exceso de los huecos PEG. </li><li> Agarosa se añade a los vacíos de PEG con el fin de llenar el espacio vacío sin desbordarse. Dependiendo del volumen de vacío, por lo general ~ 1 l se utiliza por construir. </li><li> 1,5 ml de medio de cultivo es pre-enfriado (8 ° C) en una placa de 6 pocillos, y los insertos de agarosa que contienen se transfieren a los medios de comunicación refrigerados y mantenidos en un refrigerador a una temperatura de 8 ° C durante al menos tres minutos para permitir a la agarosa gel. </li><li> Finalmente, los insertos son transferidos a 1,5 ml de medio de cultivo pre-calentado (37 ° C) y se mantienen en la incubadora a 37 ° C, con los cambios de los medios de comunicación necesarios cada 48 horas. </li></ol> 3. Hidrogel de doble encapsulación de células en 3D Encapsulación de hidrogel doble es adecuada cuando se utiliza el gel de auto-montaje. El gel photocrosslinkable, en este caso, PEG, sirve de soporte estructural para la presentación geométrica del gel de auto-montaje, por ejemplo Puramatrix o agarosa. Algunos de los métodos, en particular el tipo de gel y la elección de fotomáscaras, dependerá de la aplicación particular que desee. <ol><li> Cargar una máscara adecuada en la DMD. Para la supervivencia de aplicación de células, que simplemente optaron por una presentación cilíndrica de Puramatrix para ayudar en la obtención de imágenes de las células. Los investigadores que estudian la señalización celular podría estar interesado en una geometría compartimentos para permitir la difusión de las moléculas quimiotácticas. Además, una aproximación de una arteria se muestra para representar a su posible aplicación a la investigación de los vasos sanguíneos. </li><li> El tratamiento de las paredes de una inserción de poliéster de cultivo celular con Rain-X, y el lugar bajo la lluvia en la DMD-X diapositivas recubiertos. </li><li> Añadir 500 l de medio de polimerización de la inserción. Inducir reticulación PEG por la exposición a la luz UV durante 55 segundos. </li><li> Lavar tres veces con DPBS estéril y 1% de Pen-Strep. </li><li> Retire todos los medios el exceso de los huecos PEG. </li><li> Centrifugar las células a la densidad deseada en una pastilla. Se debe tener cuidado de eliminar todo el medio del pellet de células antes de la mezcla, como Puramatrix comienza auto-ensamblaje de inmediato al entrar en contacto con una solución salina. Suspender las células dentro de un 0,15% Puramatrix diluida en estéril H 2 O complementado con un 10% de sacarosa. </li><li> Inyectar el Puramatrix / celular / sacarosa mezcla dentro de los huecos en PEG. </li><li> Añadir 1,5 ml de medio de crecimiento por debajo de la inserción, y permitir que el gel dentro de la incubadora durante una hora. </li><li> Cambiar los medios de comunicación después de una hora, y cada ~ 48 horas después. </li></ol> 4. Hidrogel solo encapsulación de células en 3D A la encapsulación de hidrogel solo sería apropiado para cualquier situación en la que las células pueden ser examinados en el interior de un hidrogel photocrosslinkable. <ol><li> Cargar una máscara adecuada en la DMD. Para los estudios de supervivencia de las células, una vez más eligió una máscara circular básica para representar a un cilindro. Máscaras similares a los mostrados en el método 4 de nuevo se podría aplicar para el campo de la investigación correspondiente. </li><li> El tratamiento de una célula de poliéster insertar la cultura con la lluvia-X, y de lugar en DMD en la lluvia-X diapositivas recubiertos. </li><li> Las células en cualquier concentración deseada se pueden añadir directamente a la solución de PEG al 10%, mezclando bien para asegurar una distribución homogénea. </li><li> Añadir 500 l de medio de polimerización de la inserción. Inducir reticulación PEG por la exposición a la luz UV durante 55 segundos. </li><li> Lavar tres veces con DPBS estéril y 1% de Pen-Strep. </li><li> Rellenar con medio de crecimiento por debajo y por encima de la inserción, el cambio de cada ~ 2 días. </li></ol> 5. De película delgada de polimerización de hidrogel <ol><li> Cargar una máscara adecuada en la DMD. </li><li> Tratar de colágeno recubiertas de células de poliéster insertar la cultura con la lluvia-X, y el lugar en el Rain-X diapositivas recubiertos. </li><li> Añadir medio de polimerización suficiente para cubrir sólo la parte inferior de la pieza (~ 250 a 300 l para las inserciones de placa de 6 pocillos). Permita que el medio para penetrar la membrana inserción durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Retire el exceso de medio de polimerización de la inserción con una micropipeta o Kimwipe. Agregue una cantidad suficiente de UV-transparente de aceite para cubrir totalmente la parte inferior de la inserción. Permitir la inserción de sentarse por 15-30 minutos a temperatura ambiente, tiempo suficiente para que el aceite para formar una capa distinta por encima de la saturación medio de polimerización de la membrana de inserción. </li><li> Coloque el inserto y se deslizan bajo la DMD. Inducir reticulación PEG por la exposición a los rayos UV. Debido a la delgadez de la capa de PEG, la reticulación se puede completar en tan sólo 15 segundos a 5,0 W / cm 2 en el incidente de la DMD. </li><li&gt; Lave la inserción de tres veces con DPBS estéril y 1% de Pen-Strep. (Si la persistencia de un residuo aceitoso es una preocupación, un detergente suave, como Tween 20 (1%) puede ser añadido a la solución de lavado). </li><li> Tienda de la inserción en una placa de tejido de 6 pocillos. Añadir medio de cultivo de células en suspensión, en la concentración deseada, y una pipeta un volumen suficiente de la suspensión de células dentro de la inserción de cultivo celular para obtener la densidad celular deseada. A continuación, agregue un medio de crecimiento bastante por debajo de la inserción a mantener totalmente la viabilidad celular (~ 1,5 ml). </li><li> Después de 48 horas han transcurrido, lave la pieza tres veces con DPBS estéril y 1% de la pluma Strep-para desalojar a cualquier célula no adherida. Cambiar los medios de comunicación, aproximadamente una vez cada 48 horas. </li></ol> 6. Resultados representante Ejemplos de hidrogel de doble construcciones que contengan explantes DRG se muestran en la Figura 2. Tenga en cuenta que la migración celular y la extensión de las neuritas se limita a la región de células permisivas del hidrogel de doble construcción. La Figura 3 muestra las células disociadas encapsulado de manera similar en el interior de las construcciones de hidrogel dual. Debido a la naturaleza dinámica de la fotomáscara DMD, la geometría para la encapsulación sólo está limitado por las dimensiones y la resolución de la óptica. Encapsulación de células también era posible dentro de un hidrogel solo fotopolimerizable, PEG, y una prueba de viabilidad en vivo / muerto se llevó a cabo como se evidencia en la Figura 4. Encapsulación de PEG se entiende sólo como un ejemplo, como PEG no representa un ambiente ideal para las células nerviosas. Por lo tanto, se dio cuenta de la viabilidad celular en las construcciones de nuestra PEG es comprensiblemente baja. Finalmente, los ejemplos de la utilización de películas delgadas de PEG como una capa de modelado restrictivas para la adhesión celular en las inserciones de cultivo celular se muestra en la Figura 5. Además, los ejemplos de posibles &quot;malos&quot; los resultados se ofrecen en la Figura 6. Los resultados representan sólo una pequeña fracción de los posibles usos de los métodos desarrollados en nuestro laboratorio. Tienen el propósito de demostrar la facilidad, versatilidad y la viabilidad de nuestro enfoque, y podría ser tratado como &quot;prueba de principio&quot; para que los investigadores desarrollen sus posibles adaptaciones propias. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquema de la trayectoria de la luz utilizada para la fotolitografía. Recuadro: La luz UV se enciende la DMD en un ángulo de 45 ° y 24 ° por debajo del plano de la serie del espejo. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Etiquetada crecimiento y la proliferación en el GRD que contienen construcciones de doble hidrogel. AD) Las imágenes retratan polimerizado construye PEG (gris) con neuritas etiquetados con beta tubulina III (verde), los núcleos de células teñidas con DAPI (azul). Los explantes de DRG se encuentran en Puramatrix y ubicados en las regiones del patrón circular, con neuritas cada vez mayor hacia la bifurcación (s). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Construcciones de doble hidrogel que contiene las células marcadas con calceína AM, un marcador de células vivas, después de 48 horas en medio de crecimiento. AD) Diversas formas de PEG, lleno de Puramatrix contiene neuronas disociadas DRG (~ 5x10 3 células / ml). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Hidrogel única construcción que contiene células vivas marcadas con calceína AM (verde) y las células muertas de la etiqueta con el homodímero de etidio-1 (roja) a las 24 horas en medio de cultivo (5x10 3 células / ml). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Figura 5" /> PEG Figura 5. Celular restrictivas polimerizada como una película delgada con un &quot;patrón de prueba&quot; a que se adhieran de forma selectiva las células disociadas de la membrana de colágeno recubiertas de soporte permeable. A, B) Las células vivas se etiquetan a las 48 horas con calceína AM (verde), mientras que las células muertas se etiquetan con homodímero de etidio-1 (roja). La adhesión celular mínima ocurre en el área que contiene la película delgada PEG. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Imágenes representativas de resultados no deseados. A) la polimerización parcial de PEG, dando lugar a una PEG inutilizable construir. Polimerización inadecuada puede ocurrir debido a la presencia de un menisco en el medio pre-polímero, una cantidad insuficiente de medio de polimerización, la exposición UV insuficiente o inadecuado enfoque de la óptica. B) Imagen de retratar polimerizado construye PEG (gris) con neuritas etiquetados con beta tubulina III (verde), los núcleos de células teñidas con DAPI (azul). Las neuritas fueron capaces de crecer fuera de los canales de dibujos PEG. Esto ocurre a menudo en la condición de que se desborda Puramatrix en la parte superior de la porción de PEG durante la inyección.

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	<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+biology's+new+dimension.">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li><li>Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+three+dimensions:+3D+nanostructured+environments+for+cell+culture+and+regenerative+medicine.">Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine.</a> Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).</li><li>Maltman, D. J., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+three-dimensional+cell+culture+technology+aimed+at+improving+the+accuracy+of+in+vitro+analyses.">Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).</li><li>Irons, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+neural+constructs:+a+novel+platform+for+neurophysiological+investigation.">Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation.</a> Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).</li><li>Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+in+rotating+bioreactors+promotes+maintenance+of+cardiac+myocyte+electrophysiology+and+molecular+properties.">Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties.</a> Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Cushing, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+science.+Hydrogel+cell+cultures.">Materials science. Hydrogel cell cultures.</a> Science. 316, 1133-1134 (2007).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties.">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324, 59-63 (2009).</li><li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics.">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).</li><li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photolabile+hydrogel+for+guided+three-dimensional+cell+growth+and+migration.">A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration.</a> Nature Materials. 3, 249-253 (2004).</li><li>Wylie, R. G., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+micropatterning+of+amines+within+an+agarose+hydrogel.">Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel.</a> Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).</li><li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+three-dimensional+hyaluronic+acid+nanofibrous+scaffolds.">Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).</li><li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture.">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li><li>Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+and+electrophysiology+of+neural+cell+structures+generated+by+the+inkjet+printing+method.">Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method.</a> Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).</li><li>Liu Tsang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+hepatic+tissues+by+additive+photopatterning+of+cellular+hydrogels.">Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels.</a> FASEB J. 21, 790-801 (2007).</li><li>Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+tectonics:+A+comprehensive+construction+platform+for+microfluidic+systems.">Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).</li><li>Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+micro-mirror+device-based+system+for+the+microfabrication+of+complex,+spatially+patterned+tissue+engineering+scaffolds.">A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).</li><li>Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+maskless+microscope+projection+photolithography+system+and+its+application+in+light-directed+fabrication+of+DNA+microarrays.">Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays.</a> Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).</li></ol>

El método descrito en este documento podría ser utilizado por cualquier investigador que buscan sistemas de celdas de simple y reproducible la cultura. En teoría, debido a la amplia variedad de hidrogeles fotopolimerizables disponibles, el medio ambiente podrían ser adaptados para permitir su uso con cualquier tipo de célula, incluyendo explantes de todo el tejido. Además, el sistema dual de hidrogel permite un mejor control espacial en la presentación de la auto-polimerización de los hidrogeles, que tiende a crear formas amorfas por su cuenta. El resultado de &quot;2,5 D&quot; construye hidrogel micropatterned proporcionar una matriz 3D para el crecimiento neuronal se presenta en una configuración 2D que permite la evaluación microscópica conveniente. El sustrato sobre el que los geles son polimerizados también se puede variar, lo que permite un mayor control en el diseño experimental. Nuestros métodos están optimizados para su uso con soportes de cultivo celular permeable, como se ha visto una mejor viabilidad (Figura 4), en comparación con la polimerización en portaobjetos de vidrio (datos no mostrados). Sin embargo, otras superficies de polimerización pueden ser más aplicables para diferentes aplicaciones: fabricación de placas de vidrio utilizados en los experimentos de microfluidos o formaciones de células agregado, por ejemplo. Nuestra experiencia con estos sistemas de cultivo ha llevado a la identificación de posibles áreas de dificultad. En primer lugar, las técnicas de cuidado es necesario para mantener la esterilidad de las construcciones. Debido a la naturaleza voluminosa de la configuración de DMD, es difícil de realizar los pasos de polimerización bajo condiciones estériles. Para combatir este problema, el paso de enjuague se describe en los métodos es útil, y los antibióticos deben ser utilizados en todos los medios de comunicación. Además, el espesor final y la forma de la construcción polimerizado depende en gran medida el comportamiento de los fluidos de la pre-mezcla de polímeros, y la presencia de un menisco puede dar lugar a construcciones de gel que son demasiado delgados o polimerizado incompleta (Figura 6). A dos pasos se pueden tomar para minimizar la formación de un menisco en el interior se inserta el cultivo de células. Para los hidrogeles de espesor (&gt; 200 m), una simple capa de lluvia-X alrededor de la pared interior de la pieza es suficiente. Sin embargo, como se describe brevemente más arriba, para las construcciones finas (&lt;200 micras), una capa de aceite se requiere tanto para minimizar el menisco y negar bloqueo del oxígeno de la polimerización por radicales libres. Resolución se encontró que depende del espesor, con una disminución de tamaño de la característica realiza con geles cada vez más grueso. La resolución también variaba dependiendo de si la función representa un alivio positivo o negativo en el hidrogel. Sin embargo, hemos logrado una resolución suficiente para las construcciones con tamaños mínimos de la escala de aproximadamente 100 micras con los objetivos de centrarse sólo microscopio óptico. Nuestros experimentos han demostrado que las construcciones de hidrogel de doble descritas aquí representan una excelente base para la formación básica de los modelos in vitro del crecimiento de las neuritas y la orientación. La técnica empleada micropatterning es una adaptación de los métodos existentes 18,19, pero nuestra puesta a punto hizo hincapié en un diseño fácil de implementar y se ha optimizado para la producción de construcciones de hidrogel de doble en las inserciones de cultivo celular, insertos de cultivo celular fueron vitales para la mejora de la viabilidad celular y como reticulación alrededor de explantes de tejido previamente adherentes. El alcance de los resultados mostrados se ve limitada por los intereses de nuestro laboratorio, sin embargo, creemos que los métodos descritos en esta publicación sea de utilidad para los investigadores en busca de un relativamente barato, método rápido y fácil de usar para la fabricación de cultivo de células en 3D modelos.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Digital Micromirror Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Texas Instruments</td>
<td>DLPD4X00KIT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen Coated Transwell Permeable Support </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3491</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyester Transwell Permable Support</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3412</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-164</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nerve Growth Factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13257-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puramatrix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEG 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>15178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Irgacure 2959</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>0298913AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Have used both canola oil and silicon oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation</td>
</tr>
<tr>
<td>OmniCure Series 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Exfo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of micropatterned hydrogels for neural culture systems using dynamic mask projection photolithography

Cada vez más, con dibujos ambientes de cultivo celular se están convirtiendo en una técnica relevante para estudiar las características celulares, y muchos investigadores creen en la necesidad de entornos 3D para representar los experimentos in vitro que imitan mejor en calidades 3.1 vivo. Los estudios en campos como la investigación sobre el cáncer 4, 5 neural ingeniería, la fisiología cardíaca 6, y la interacción célula-matriz 7,8 han demostrado el comportamiento celular difiere sustancialmente entre los cultivos en monocapa tradicional y construye en 3D. Los hidrogeles son utilizados como escenarios en 3D, debido a su variedad, versatilidad y capacidad de adaptar la composición molecular a través de funcionalización 9.12. Existen numerosas técnicas para la creación de estructuras como las células de apoyo matrices, incluyendo electrospinning 13, sellos de elastómero 14, la impresión de inyección de tinta 15, 16 photopatterning aditivo, fotomáscara estática proyección litografía 17, y microstereolithography máscara dinámica 18. Por desgracia, estos métodos implican varios pasos de producción y / o equipos no son fácilmente adaptables a las células convencionales y los métodos de cultivo de tejidos. La técnica empleada en este protocolo se adapta los dos últimos métodos, utilizando un dispositivo digital de microespejos (DMD) para crear dinámicas de máscaras para la reticulación geométrica específica poli-(etilenglicol) (PEG) hidrogeles, inducida por UV inició polimerización por radicales libres. El resultado de &quot;2,5 D&quot; estructuras de proporcionar un entorno limitado en 3D para el crecimiento neuronal. Contamos con un enfoque de doble hidrogel, donde PEG sirve como una estructura celular región de restricción el suministro de un informe de lo contrario, pero la célula permisiva-auto-montaje de gel hecho a partir de cualquiera de Puramatrix o agarosa. El proceso es rápido simple fabricación de paso, que es altamente reproducible y adaptado fácilmente para su uso con los métodos convencionales de cultivo de células y sustratos. Explantes de todo el tejido, como los ganglios de la raíz dorsal de embriones (GRD), se pueden incorporar en las construcciones de hidrogel doble para los ensayos experimentales, tales como crecimiento de las neuritas. Además, las células disociadas se puede encapsular en el hidrogel photocrosslinkable o auto polimerización, o de forma selectiva adheridos a la membrana permeable con el apoyo de células restrictivas photopatterning. Uso de la DMD, hemos creado hidrogel construcciones de hasta ~ 1 mm de grosor, pero de película delgada (&lt;200 micras) las estructuras de PEG se vieron limitadas por bloqueo del oxígeno de la reacción de polimerización por radicales libres. Estamos posteriormente desarrolló una técnica que utiliza una capa de aceite por encima del líquido de polimerización que permite la polimerización fina estructura PEG. En este protocolo, se describe la creación rápida de sistemas de hidrogel en 3D para la producción de células neuronales microfabricated y cultivos de tejidos. Las construcciones de hidrogel de doble demostrado en este comunicado representan versátil en modelos in vitro que pueden resultar útiles para los estudios de la neurociencia participación de la supervivencia celular, la migración, y / o el crecimiento de las neuritas y la orientación. Por otra parte, como el protocolo puede trabajar para muchos tipos de hidrogeles y las células, las posibles aplicaciones son variadas y extensas.

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Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Técnicas sencillas se describen para la producción rápida de microfabricated sistemas de cultivo neuronal mediante un dispositivo digital de microespejos para la litografía de proyección dinámica máscara regular de los sustratos de cultivo celular. Estos sistemas de cultivo pueden ser más representativos de la arquitectura biológica natural, y las técnicas descritas podrían ser adaptados para numerosas aplicaciones.

Fabricación de hidrogeles micropatterned para sistemas de cultivo neuronal usando fotolitografía dinámica de proyección Máscara

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.6K vistas.  Tulane University. Técnicas sencillas se describen para la producción rápida de microfabricated sistemas de cultivo neuronal mediante un dispositivo digital de microespejos para la litografía de proyección dinámica máscara regular de los sustratos de cultivo celular. Estos sistemas de cultivo pueden ser más representativos de la arquitectura biológica natural, y las técnicas descritas podrían ser adaptados para numerosas aplicaciones.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Investigación

Bioingeniería

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Los hidrogeles de alginato para la cultura del órgano en tres dimensiones de los ovarios y oviductos

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotación de sistemas de cultivos celulares de cultivo de células humanas: células humanas trofoblásticas como un modelo de

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Fabricación e Implantación de miniatura Galgas Extensiométricas Dual-elemento de medición<em&gt; En Vivo</em&gt; Gastrointestinal contracciones en los roedores.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

La transfección de genes hacia células Esferoide sobre placas micropatterned Cultura para el trasplante de células genéticamente modificadas

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Fabrication polimérico matriz de microagujas por fotolitografía

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Microfluidic genipina Deposición Técnica de Cultura extendido de micropatterned vasculares musculares Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...