Este protocolo permite la creación consistente de micro patrones de proteínas de alta fidelidad de cualquier forma que se desee, especialmente islas aisladas de patrones para el estudio de grupos celulares. Esta técnica se puede utilizar para hacer micro patrones aislados de islas de cualquier forma y tamaño en un solo paso, mientras que anteriormente hacer tales patrones requería dos pasos separados. Comience mezclando PDMS en la relación correcta de agente de curado a base como se describe en las instrucciones del fabricante.
Incubar a temperatura ambiente y presión durante 15 minutos, luego desgasificar la mezcla al vacío durante 15 minutos. Vierta el PDMS en el molde maestro y transfiéralo a una incubadora a 37 grados Centígrados para curar durante la noche. Retire el molde maestro de la incubadora y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
Mientras el molde maestro se está enfriando, sonice las cubiertas de 25 milímetros en etanol durante 10 minutos. Utilice tantas fundas como el número de sellos que se estén preparando. Enjuague bien las fundas con agua DI y séquelas con una pistola de aire filtrado.
Trate las fundas con plasma durante un minuto utilizando el limpiador de plasma bajo un alto vacío. Suelte lentamente el vacío después del tratamiento para evitar que las cubiertas se muevan dentro de la cámara. Cubra cada funda con 100 microlitros de la solución de proteína marcada con fluorescentes en una habitación desprovista de luz solar directa o iluminación cenital.
Cubra las muestras para una protección adicional contra la luz e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Enjuague bien cada funda con agua DI. Elimine el exceso de agua de la superficie golpeando suavemente los lados de cada funda sobre una toalla de papel o un material absorbente similar.
Deje que las fundas se sequen completamente dejándolas descubiertas en la oscuridad durante al menos 30 minutos. Mientras las fundas recubiertas de proteína se secan, retire el sello PDMS del molde maestro cortándolo con un bisturí o cualquier cuchilla afilada. Trate los sellos PDMS con plasma durante dos minutos bajo un alto vacío.
Coloque los sellos en un recipiente con una tapa debajo de la campana de humos, luego cubra cada sello con una capa delgada de 10% 3-APTMS diluido en 100% etanol. Cubra el recipiente con los sellos e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Enjuague bien cada sello en ambos lados con agua DI.
Coloque los sellos en un recipiente limpio y cúbralos con glutaraldehído al 2,5% preparado en agua DI. Cubra los sellos e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Enjuague bien los sellos con agua DI.
Retire el exceso de agua de la superficie como se describió anteriormente y deje que los sellos se sequen sin tapa durante 30 minutos. Si después de 30 minutos las fundas recubiertas de proteínas o los sellos no están completamente secos, use una pistola de aire filtrado para secarlos por completo. Empuje el lado del patrón de los sellos sobre las cubiertas con suficiente presión para que hagan contacto completo.
Déjelo sin molestar durante 15 minutos. A continuación, despegue cuidadosamente los sellos PDMS de las fundas. Usando un microscopio fluorescente con el filtro apropiado, verifique la fidelidad de las cubiertas estampadas.
Use los cubrehojas estampados inmediatamente o guárdelos lejos de la luz directa hasta su uso posterior. Antes de preparar el precursor de hidrogel PAA, retire el éster de ácido acrílico NHS del refrigerador para alcanzar la temperatura ambiente antes de abrirlo. Prepare un juego de placas intercambiables esterilizando con etanol al 70%, luego incube bajo luz UV en un gabinete de bioseguridad durante al menos 30 minutos antes de su uso.
Debajo de la campana de humos, agregue 1.25 mililitros de acrilamida al 40% preparada en agua DI a un tubo cónico de 15 mililitros. Al mismo tubo, agregue 175 microlitros de solución de bis-acrilamida preparada en agua DI. Luego agregue 500 microlitros de 10X PBS, seguido de 2.915 mililitros de agua DI.
Pipetee 969 microlitros de este precursor en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y almacene el resto a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos semanas. Mida de 50 a 100 miligramos de APS en un tubo de microcentrífuga fresco y diluya a 100 miligramos por mililitro en agua DI. Abra el éster NHS en la campana y mida cuidadosamente hasta tres miligramos de NHS en un tubo de microcentrífuga.
Diluya el éster NHS a un miligramo por mililitro en 1X PBS. Debajo de la campana de humos, agregue dos microlitros de TEMED al tubo de la microcentrífuga que contiene la alícuota de 969 microlitros del precursor de PAA. Agregue 15 microlitros de un HCL molar para disminuir el pH de la solución de hidrogel y evitar la hidrólisis del éster NHS.
Agregue 10 microlitros de la solución de éster NHS al tubo. Realice los siguientes pasos en un gabinete de bioseguridad. Coloque cuidadosamente la cubierta de 30 milímetros dentro de la parte media del juego de platos de cubierta con el lado 3-APTMS y glutaraldehído tratado hacia arriba y atornille el anillo de plástico en la parte superior.
Configure el cubrebocas estampado con una exposición mínima a la luz para prepararse para el siguiente paso. Pipetear cinco microlitros de solución APS en el tubo alícuota precursor de PAA, luego invertir y mezclar. Pipetee inmediatamente 35 microlitros de esta solución en la cubierta de 30 milímetros.
Coloque el cubrehojas estampadas en la solución con el lado de la proteína hacia abajo. Tenga cuidado de no crear burbujas de aire en el hidrogel. Proteja el hidrogel de la luz y deje que polimerice durante 90 minutos.
Una vez que el hidrogel se haya polimerizado, use una cuchilla de afeitar o un bisturí para quitar la funda superior, asegúrese de que la funda no se caiga hacia atrás o se deslice del gel una vez retirado para evitar arruinar el patrón en la superficie del gel. Para pasivar cualquier éster NHS restante en el hidrogel, agregue dos mililitros de PBS estéril al gel e incube a 37 grados Celsius durante 45 minutos. Prepare inmediatamente los geles para experimentos o guárdelos durante la noche en PBS estéril a cuatro grados centígrados hasta su uso posterior.
Los hidrogeles fueron modelados indirectamente con fibronectina fluorescente para visualizar y medir las fuerzas de tracción celular dentro de los grupos y crear patrones de isla de tamaño y forma predeterminados. La calidad del patrón estaba directamente relacionada con la fidelidad del molde maestro a partir del cual se fundió el sello PDMS. Este método podría fabricar patrones de isla aislados y bien definidos de forma predeterminada.
Los puntos de adhesión de fibronectina estaban presentes solo dentro del área deseada de la isla. Estas islas aisladas de puntos de adhesión permitieron además un mejor control de la forma del racimo. El recubrimiento de sellos PDMS con dos pequeños 3-APTMS es crítico porque limitará la efectividad del método de eliminación, mientras que demasiado creará un residuo naranja en la superficie del sello.
Los patrones creados aquí se pueden usar para determinar las fuerzas de tracción celular tanto en células individuales como en grupos, lo que da una idea de su capacidad para mantener la homeostasis mecánica.
