La influencia de los factores microambientales en el comportamiento celular a menudo se estudia utilizando plataformas in vitro demasiado simplificadas, que aíslan señales individuales. Nuestro enfoque crea sustratos de cultivo celular que combinan múltiples de estas señales. Este enfoque es muy versátil y permite un estudio sistemático utilizando una amplia variedad de materiales de cultivo celular, patrones de guía de contacto, lecturas celulares y proteínas.
El procedimiento será demostrado por dos candidatos de PSE de nuestro laboratorio. CAS VAN DER PUTTEN, y MIRKO D'URSO First, crean un molde de vidrio negativo utilizando una técnica directa derecha láser de femtosegundo que contiene todas las características de interés. Luego, coloque cuidadosamente el molde de vidrio negativo en el fondo de una placa de Petri y vierta el prepolímero de polidimetilsiloxano sobre el molde de vidrio negativo para cubrirlo por completo.
Coloque esta placa de Petri en el desecador de vacío y encienda la bomba de vacío. Una vez que se logra el vacío, espere 5 minutos para eliminar todas las burbujas presentes en la interfaz entre la superficie del molde y el prepolímero de polidimetilsiloxano. Curar el prepolímero PDMS durante la noche en el horno a 65 grados centígrados.
Después del curado, use una espátula para levantar los bordes del PDMS. Retire el chip PDMS positivo recién curado del molde de vidrio negativo, y si el chip PDMS positivo tiende a adherirse al molde de vidrio negativo, agregue etanol o agua a los bordes de la impresión mientras levanta. Luego, coloque el chip de polidimetilsiloxano positivo en un desecador junto a un pequeño vial con una gota de agente de silanización y deje el chip al vacío durante la noche.
Vierta el prepolímero PDMS en el molde PDMS negativo para producir múltiples chips de cultivo celular de 5 milímetros de espesor. A continuación, retire las burbujas con el desecador y cure durante tres horas a 65 grados centígrados. Use una cuchilla de afeitar para cortar el chip al tamaño final y almacene los chips a temperatura ambiente Para la pasivación del sustrato con pinzas, coloque el chip en la canasta del plasma Asher.
Luego, use plasma de oxígeno para activar los grupos hidroxilo en la superficie del chip y ventile la cámara de cenizas con nitrógeno. Saque el chip de la canasta y colóquelo en un recipiente pequeño de polidimetilsiloxano. Ahora, use una pipeta pasteur para agregar 500 microlitros de poli-L-lisina en la parte superior del chip, para sumergir completamente la superficie en la solución e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Luego, retire 450 microlitros de la poli-L-lisina del chip de cultivo celular con una pipeta. A continuación, enjuague el trío de superficie del chip con 500 microlitros de tampón HEPES 0.1 molar. Mantenga la calidad del patrón final dejando un pequeño volumen de líquido en el chip de polidimetilsiloxano, para evitar que la muestra se seque.
Justo antes de su uso, prepare 500 microlitros de 50 miligramos por mililitro de valerato de cianamida metoxi polietilenglico-glicosico en 0,1 pilas molares por chip de cultivo celular e incube la muestra en ella durante 60 minutos. Con una micropipeta, retire 450 microlitros de la solución de valerato cianamida metoxi polietileno glicolísico. Lave la superficie del chip cinco veces con PBS pipeteando dentro y fuera.
Para eliminar todos los mPEG-SVA independientes. Coloque el portaobjetos de vidrio con un resaltador fluorescente en la trayectoria óptica del microscopio. Cambie al modo fluorescente en el microscopio y enfoque cuidadosamente la imagen primo, asegurándose de que tanto el logotipo como el texto estén enfocados.
Haga clic en siguiente para ver los datos de calibración y el patrón para finalizar el procedimiento de calibración. Anote la ubicación Z del escenario al calibrar y use esta ubicación como referencia más adelante en el protocolo. Después de retirar el portaobjetos de calibración del escenario, coloque un portaobjetos de vidrio que contenga una gota del fotoiniciador en el escenario y coloque el sustrato de cultivo celular PDMS boca abajo, en la gota del fotoiniciador.
Asegúrese de que las características 3D en la superficie del sustrato de cultivo celular miren hacia el portaobjetos de vidrio y estén completamente sumergidas en el iniciador fotográfico, para garantizar un patrón adecuado. Concéntrese en la parte superior o inferior de las estructuras convexas o cóncavas respectivamente y concéntrese en el área del chip en la ubicación correcta como se describe en el manuscrito. Ajuste la configuración de patrones de acuerdo con la función y seleccione una dosis de 1000 milijulios por mililitro.
Haga clic en el botón de reproducción en la parte inferior derecha de la pantalla para iniciar el patrón. Una vez terminado, observe el patrón que se muestra en verde. Usando una micropipeta, agregue dos mililitros de PBS a un vial de 20 microgramos de fibronectina marcada con rodamina, para obtener una concentración de 10 microgramos por mililitro.
Pipetear suavemente para evitar los grupos de proteínas y proteger de la luz. Usando una micropipeta, agregue de 200 a 500 microlitros de la solución de proteína al chip de cultivo celular. Ajuste el tiempo de incubación y la temperatura dependiendo de la proteína de elección, y asegúrese de cubrir la muestra.
Retire la solución de proteína y lave el chip cinco veces con 500 microlitros de PBS estéril. Asegúrese de pipetear el PBS hacia arriba y hacia abajo varias veces por encima de todas las características relevantes del chip de cultivo celular, para eliminar cualquier proteína no unida. Una vez que la suspensión celular esté preparada, retire PBS y agregue 1 mililitro de la suspensión celular al chip.
Luego, incubar durante 60 minutos a 37 grados centígrados. Verifique la adhesión de las células en el chip de cultivo celular patrón bajo un microscopio de campo brillante. Busque morfologías celulares alargadas en el caso de patrones de línea.
Y si las células han comenzado a adherirse fuera del área modelada, elimínelas pipeteando el medio hacia arriba y hacia abajo directamente sobre las células en el sustrato. Después de teñir, coloque la muestra teñida boca abajo en una gota de PBS en un portaobjetos de vidrio. Luego, dependiendo del nivel de detalle requerido, haga pilas Z con un objetivo adecuado y un espaciado Z para garantizar la adquisición adecuada de la imagen.
Cree un renderizado 3D de la pila Z con el software de renderizado 3D. Se modeló un hoyo cóncavo utilizando la absorción molecular inducida por la luz de las proteínas y se visualizaron la proyección de intensidad máxima y la vista ortogonal. El perfil de intensidad mostró transiciones agudas de alta resolución de patrones entre áreas con y sin patrón y una intensidad de proteína consistente.
El patrón utilizando el plano focal único, así como el método de dos y tres planos focales, mostró una alineación perfecta de los patrones en la parte superior de las características. Los semicilindros cóncavos, los semicilindros convexos, la superficie de la silla de montar y el PID se modelaron utilizando líneas o círculos concéntricos de varios anchos. El efecto dentro del esqueleto de los queratocitos humanos se tiñe usando foliden y se visualiza.
Los fibroblastos dérmicos se cultivaron en un semicilindro cóncavo modelado y se visualizaron. Las células detectaron y se adhirieron al sustrato de cultivo celular multicue y permanecieron viables con el tiempo según lo visualizado por F-actina, vinculina y núcleos. Además, las células formaron adherencias focales principalmente en las líneas de fibronectina.
Los fibroblastos dérmicos humanos cultivados en un cilindro cóncavo modelado en presencia de fibronectina rodamina adheridos al sustrato multicue y mostraron una respuesta de alineación, de acuerdo con el patrón de guía de contacto. La respuesta de alineación y la viabilidad celular se mantienen durante toda la duración del cultivo. Lo más importante al realizar este protocolo es evitar que la superficie del chip de cultivo celular se seque.
El uso de diferentes materiales de sustrato, recubrimientos de proteínas y tipos de células puede requerir una optimización adicional. Proporcionar múltiples señales ambientales en 3D puede abrir nuevas posibilidades para dirigir la organización celular en tejidos de ingeniería complejos.
