Este trabajo está financiado por el NIH subvención P20 RR021905-01, CF RPD conceder STANTO07R0, y la NASA beca NNH09ZNE002C.

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquema de SESI-MS análisis de compuestos volátiles de bacterias. El espacio libre del cultivo bacteriano es desplazado por el CO 2 (1) en la cámara de reacción del SESI (2). Como los compuestos volátiles atravesar la cámara de reacción SESI pasan a través de la nube de electrospray y se ionizan (3). Una vez ionizados, los volátiles son introducidos en el espectrómetro de masas para el análisis (4). El exceso de gas portador y que no ha reaccionado volátiles bacterias se transmiten a través de un filtro de 0,22 micras (5), como una medida adicional de protección y ventilación a una campana química. Recuadro: La aguja electrospray SESI es un capilar de sílice (40 micras ID) con una punta de aguja afilada. Como una demostración de la utilización de SESI-MS para la caracterización de compuestos volátiles de bacterias, E. coli K12 y P. PAO1 aeruginosa son cultivadas aeróbicamente durante 24 horas en 50 ml de LB-Lennox a 37 ° C y los espectros de SESI-MS de los volátiles del espacio de cabeza se recogen en 2 minutos. El dióxido de carbono (99,99%) con un caudal de 2 l / min se usa como gas de transporte para la entrega de volátiles a la cámara de reacción. La cámara de reacción SESI fue construida y equipada a un API-3000 (Sciex), en sustitución de la fuente de electrospray ión original. Los espectros se recogen en el modo de iones positivos con 0,1% de ácido fórmico, el 5,0% de metanol, y el 94,9% de agua (v / v) como la solución electrospray, entregado en 5 nl / s a ​​través de un contenido de sílice no conductora capilar con una punta de aguja afilada (40 micras ID). El voltaje aplicado es de 2,5 kV. Analista de software 1.4.2 (Applied Biosystems) se utiliza para la recolección de datos con los siguientes parámetros: 20 - 500 Da, MCA modo, 40 escáneres, 3 s / escaneo, y 2 min de tiempo total de análisis. 1. Sistema de cultivo <ol><li> Elegir el recipiente adecuado para el crecimiento de sus cultivos, teniendo en cuenta las necesidades de crecimiento de la especie en el experimento (por ejemplo, la aireación, luz, temperatura, etc), así como la prestación eficiente de los volátiles que el espectrómetro de masas. Los frascos de cultivo que optar por utilizar son estándar de 100 ml Pyrex botellas de los medios de comunicación equipados con tapas de rosca que tienen al menos dos puertos luer. Una línea de entrada se inserta a través de un puerto luer para la entrega de gas portador de la botella de muestra y una línea de salida se inserta a través de otro puerto para la entrega de VOC en el instrumento (Figura 1). Cualquiera de los puertos adicionales están conectados. </li><li> Antes de que el cultivo de las muestras, presionar a los vasos y se sumergen en el agua para detectar fugas. Las fugas de gas son la principal causa de los resultados atípicos en forma de señales de iones débil o ausente volátiles. </li></ol> 2. Biológica experimento: puesta a punto y de seguridad consideraciones <ol><li> El crecimiento de su cultura en las condiciones adecuadas para su hipótesis. Se recomienda que al menos dos réplicas biológicas, cada uno con dos repeticiones técnica, se utilizan para cada variable. </li><li> Preparar un blanco de todas las condiciones de cultivo (medio, antibióticos, etc) e incubar el espacio en blanco en las mismas condiciones que sus muestras. </li><li> Emplear las medidas de seguridad que son apropiados para los agentes biológicos que está utilizando, teniendo en cuenta el nivel de bioseguridad (s) de la especie. </li><li> Para evitar la contaminación de su instrumento y las líneas de transferencia de gas con agentes biológicos viables, instalar filtros de tamaño de poro adecuado en la línea de gas portador. Los filtros no interfieren con la transferencia de compuestos volátiles de la cámara de reacción del SESI, pero poco puede afectar la eficiencia de la transferencia de aerosol. 6 </li><li> Utilícese un envase secundario o un gabinete de bioseguridad cuando se conecta la tapa de transferencia de gas a su botella de la cultura de asegurar la contención adecuada en el caso de derrame de agentes biológicos. </li><li> Iniciar y terminar el flujo de gas portador a su botella de muestra de una manera que no va a construir la presión dentro de la botella. </li></ol> 3. Instrumento de optimización NOTA: SESI-MS está diseñado específicamente para los volátiles de la muestra, por lo que limitar el uso de fragantes artículos de cuidado personal (por ejemplo, colonias, enjuagues bucales, lociones, suavizante de telas), goma de mascar, cigarrillos, etc antes de usar el instrumento. Bien colmo productos químicos volátiles en el laboratorio y de control de los borradores tanto como sea posible durante la prueba. Los siguientes parámetros instrumentales, que afectan a la intensidad de la señal y la estabilidad, tendrá que ser optimizado para su instrumento y la experimentación. <ol><li> Solución de electrospray y el caudal: Elegir la solución electrospray apropiado para la clase de moléculas que desea dirigirse, teniendo en cuenta la polaridad instrumento operativo (modo positivo o negativo de iones) y el carácter molecular de los compuestos de interés. En este experimento la solución electrospray es del 0,1% ácido fórmico, el 5,0% de metanol, el 94,9% de agua (v / v), lo que aumenta la intensidad de la señal de menos moléculas polares noce dar estabilidad buena señal. La solución se entrega con un caudal de 5 nL / s. </li><li> Velocidad del gas portador: El caudal del gas portador puede afectar la estabilidad de electrospray y la intensidad de la señal. CO 2 (≥ 99,99%) con un caudal de 2 l / min se utiliza aquí. </li><li> Forma de aguja y posición: La forma de punta de la aguja y la posición afectan en gran medida la intensidad de la señal y la estabilidad. Al instalar una nueva aguja, la posición de la aguja debe ser optimizado para crear un equilibrio entre el fondo de baja y alta intensidad de la señal del analito, y la estabilidad de la señal. Con el fin de reproducir los espectros SESI después de un cambio de agujas, es necesario recoger periódicamente los espectros a medida que ajusta la posición de la aguja hasta que pueda para que coincida con el espectro observado a sus registros. La distancia desde la punta de la aguja a la masa electrospray orificio de especificaciones será de 1 - 5 mm. </li><li> Tensión aplicada: La tensión que se aplica en el sistema afecta a la intensidad de la señal de iones y la estabilidad del cono electrospray Taylor. Además, el voltaje óptimo depende de la solución de electrospray y la forma de punta de la aguja. Al inicio de su serie de experimentos, determine la tensión que produce el espectro óptimo y estabilidad de la señal para el sistema, y ​​luego utilizar esta tensión para todos los experimentos posteriores. Para nuestro sistema, voltajes aplicados de 2,0 a 5,0 kV proporcionar una intensidad de señal óptima y la estabilidad de electrospray. Para este experimento se utiliza 2,5 kV. </li></ol> 4. Encendido y puesta a punto del SESI-MS para el análisis <ol><li> Comenzar por asegurar que la tensión de alimentación está apagado y que el sistema está cargado de electricidad. Para ello, 1) asegurar que las luces indicadoras de la tensión de alimentación están apagados, 2) asegurar la tensión en el multímetro es cero, y 3) a tierra los cables eléctricos. </li><li> Instalar la solución de electrospray apropiado para su experimento. </li><li> Encienda el gas portador y establecer el flujo a la velocidad adecuada para su experimento. </li><li> Aplicar presión en el depósito de electrospray para iniciar la entrega de la solución de electrospray a la cámara de reacción. </li><li> Abra el suministro de tensión y ajustar el voltaje a un valor apropiado para sus experimentos. </li></ol> NOTA: En este punto, las superficies metálicas de la fuente de ionización son capaces de entregar un choque peligroso. Tener mucho cuidado cuando se trabaja alrededor del instrumento una vez que la tensión de alimentación se ha activado. <ol start="6"><li> Configuración de un método de ajuste para el monitoreo del espectro SESI-MS al tiempo que afinar los ajustes de la tensión aplicada. Use los parámetros de adquisición que se ha optimizado para su sistema y su experimento. Autorizar la adquisición de canales múltiples (MCA) casilla (si corresponde) a fin de que cada ciclo produce un espectro independiente, establecer el tiempo de adquisición de 10 - 15 min, y comenzar la adquisición. Espectros de los antecedentes del gas portador ahora deben ser observados. </li><li> Hacer ajustes ajustado a la tensión aplicada para obtener un cromatograma total de iones estables (TIC) y las exploraciones reproducible que coinciden con el CO 2 analiza en busca de sus experimentos anteriores. Una vez que los ajustes de voltaje se han hecho, continuar recogiendo los espectros y un TIC durante cinco minutos para asegurar que el instrumento se estabilice. </li><li> Una vez que se garantiza la estabilidad fundamental, establecer el método de adquisición según sea apropiado para sus muestras, ajustar el tiempo de adquisición, el rango de datos, y la selección de MCA, según sea necesario. Recoger el gas portador del espectro de fondo para sus registros. </li></ol> 5. La obtención de una huella digital volátil de su cultivo bacteriano <ol><li> Para recoger un espectro blanco, dirigir el flujo de gas portador a través de las líneas de derivación, y luego coloque la muestra en blanco (válvulas cerradas) a las líneas de transferencia de gas del instrumento. </li><li> Abrir las válvulas de la botella de muestra, y cerrar las válvulas de las líneas de derivación. </li><li> Deje que el sistema se equilibre durante 30 segundos, tiempo durante el cual la humedad en la cámara de reacción se está estabilizando. Este período de equilibrio es esencial para obtener espectros reproducibles. Para asegurar que el sistema está equilibrado, es posible que desee monitorear las TIC, que va a cambiar durante el período de equilibrio, y estabilizar a partir de entonces. </li><li> Una vez que el sistema está equilibrado, iniciar la recogida de espectro. </li><li> Después de que el espectro se recoge, retire la botella de muestra, en primer lugar la apertura de las líneas de gas portador de bypass, luego cerrar las válvulas de la muestra, y por último la eliminación de la botella de muestra. Lave el sistema con el gas portador de 2 a 4 min, la eliminación de la humedad y volátiles adsorbidos en las líneas de transferencia, la prevención de la muestra de la muestra de arrastre. </li><li> Repita los pasos 5,2 a 5,5 por cada muestra de bacterias, de forma intermitente recogida de espectros en blanco adicionales para asegurar una buena blanco resta. Incompleta en blanco resta dará lugar a laaparición de picos de fondo químico en el espectro de procesados ​​que son comunes a técnicas de presión atmosférica de ionización (por ejemplo, los ftalatos, siliconas, etc.) 9 </li><li> Al recoger su espectro, asegúrese de que las señales de iones no son superiores a los límites de detección lineal de su instrumento, según lo determinado por las TIC y la máxima intensidad de los diferentes picos. Iones rebasen los límites superiores del detector de su instrumento puede generar picos de artefactos que no son representativos de la muestra. </li></ol> 6. Resultados representante Como ejemplo de los espectros de SESI-MS que se pueden obtener de los volátiles de bacterias, las huellas dactilares de iones positivos modo volátil para E. coli y P. aeruginosa crecido en condiciones aeróbicas LB-Lennox durante 24 horas a 37 ° C se muestran (Fig. 2). La E. espectro coli volátiles está dominado por indol en m / z = 118, que ofrece E. culturas coli su olor característico, mientras que el espectro de la P. aeruginosa contiene una mayor variedad de picos protonatable. Tenga en cuenta que las intensidades relativas de los picos en el espectro de volatilidad dependen de los parámetros instrumentales se describe en la Sección 3. Estos parámetros deben ser estrictamente controlados de experimento en experimento con el fin de obtener espectros reproducibles. <img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 en blanco sustracción de iones positivos modo SESI-MS espectros (20 - 150 m / z). De E. coli K12 y P. aeruginosa PAO1 volátiles después de 24 h de crecimiento aeróbico en LB-Lennox a 37 ° C. Para más detalles sobre los picos observados en el espectro de SESI, por favor refiérase a Zhu, et al. 8.

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Las bacterias producen diferentes combinaciones de sustancias volátiles, que pueden ser utilizados para la identificación bacteriana 10-12 y la evaluación del estado metabólico. El método de SESI-MS descrito aquí proporciona un medio rápido de caracterización de compuestos volátiles de bacterias (en dos minutos o menos) sin ningún tipo de preparación de la muestra, lo que genera una infección bacteriana &quot;huella digital&quot; para la identificación de la especie. 8 En las últimas décadas ionización otros la presión atmosférica técnicas de MS se han aplicado a la caracterización de los compuestos volátiles, incluyendo el tubo de flujo de iones selectivos (SIFT) y la reacción de transferencia de protones (PTR) de espectrometría de masas. La ventaja diferencial que ofrece SESI sobre estos métodos de ionización es que esto es posible a los picos fragmento específico (siempre que el tipo apropiado de espectrómetro de masas se ha adaptado para SESI), que es una herramienta importante para la identificación de compuestos. No se refirió a la fragmentación de pico en el protocolo mencionado anteriormente, pero hay ejemplos de cómo la información de fragmentación se puede utilizar en la caracterización de los compuestos volátiles de bacterias, por favor refiérase a Zhu, et al 8. SESI-MS tiene aplicación directa en la detección in situ de las infecciones pulmonares bacterianas mediante análisis de aliento, pero también puede aplicarse a cualquier entorno en el que muestra volátil es posible. Por ejemplo, el análisis de compuestos volátiles en la orina, la sangre y la respiración, que son relevantes para el diagnóstico de trastornos metabólicos, enfermedades gastrointestinales, cáncer, y la exposición del medio ambiente, se adapta bien a SESI-MS. 13,14 SESI-MS también ha una amplia gama de aplicaciones no clínicas huellas de COV, incluyendo un análisis rápido de los alimentos para los volátiles característicos asociados con la maduración, envejecimiento, o echar a perder 15-18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> API-3000 triple cuadrupolo </td><td> Instrumento </td><td> Sciex </td><td></td><td> Adquiridos con el analista 1.4.2 (Applied Biosystems) </td></tr><tr><td> SESI fuente de iones </td><td> Instrumento </td><td></td><td></td><td> Hechos a medida; véase la referencia 6 </td></tr><tr><td> Medidor de flujo de gas </td><td> Equipo </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-03217-74 </td><td></td></tr><tr><td> Dióxido de carbono </td><td> Equipo </td><td> Airgas </td><td> CD I300 </td><td> ≥ 99,99% de pureza </td></tr><tr><td> Nitrógeno </td><td> Equipo </td><td> Airgas </td><td> NI UHP300 </td><td> Pureza ultra alta </td></tr><tr><td> 100 ml de vidrio de los medios de botellas </td><td> Equipo </td><td> VWR </td><td> 89012-114 </td><td> GL45 roscas </td></tr><tr><td> Tapas de las botellas con los puertos luer </td><td> Equipo </td><td> Bio Chem Fluidics </td><td> 00945T-3 </td><td> Cap de montaje </td></tr><tr><td> Luer del puerto se conecta </td><td> Equipo </td><td> Bio Chem Fluidics </td><td> 009LP </td><td> Cap de montaje </td></tr><tr><td> Tubería de 1 / 4 &quot;(OD) x 8.1&quot; (ID) </td><td> Equipo </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-95875-02 </td><td> Cap montaje y líneas de transferencia de gas </td></tr><tr><td> Tubería de 1 / 8 &quot;(OD) x 1 / 16&quot; (ID) </td><td> Equipo </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-06605-27 </td><td> Cap de montaje </td></tr><tr><td> Válvulas de dos vías </td><td> Equipo </td><td> Cole-Parmer </td><td> 07391-04 </td><td> Cap de montaje </td></tr><tr><td> Filtro, Grado AAQ </td><td> Equipo </td><td> Balston Filtros </td><td> 9922-05 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido fórmico, LC / MS de grado </td><td> Reactivo </td><td> Pescador </td><td> A117-05AMP </td><td> Electrospray solución </td></tr><tr><td> Metanol, LC / MS de grado </td><td> Reactivo </td><td> Pescador </td><td> A456-500 </td><td> Electrospray solución </td></tr><tr><td> Agua, LC / MS de grado </td><td> Reactivo </td><td> Pescador </td><td> W6-500 </td><td> Electrospray solución </td></tr></tbody></table>

characterizing bacterial volatiles using secondary electrospray ionization mass spectrometry (sesi-ms)

Secundaria ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS) es un método desarrollado para la rápida detección de compuestos volátiles, sin necesidad de pretratamiento de la muestra. El método fue descrito por primera vez por Fenn y colegas 1 y se ha aplicado a la detección de drogas ilícitas 2 y explosivos 3.4, la caracterización de los cinco compuestos volátiles de piel, y el análisis de aliento 6-7. Ionización SESI se produce por las reacciones de transferencia de protones entre la solución de electrospray y la sustancia volátil, y por tanto es adecuado para el análisis de los hetero-moléculas orgánicas, así como en la ionización por electrospray tradicionales (ESI). Sin embargo, a diferencia de ESI estándar, el proceso de transferencia de protones del SESI se produce en la fase de vapor en lugar de en la solución (Fig. 1), y por lo tanto, el SESI es el más adecuado para la detección de compuestos volátiles orgánicos y aerosoles. Estamos ampliando el uso de SESI-MS para la detección de compuestos volátiles de bacterias como un método para la identificación y caracterización bacteriana 8. Hemos demostrado que el SESI-MS huellas volátiles, combinado con un método de análisis estadístico, se puede utilizar para diferenciar los géneros de bacterias, especies y cultivos mixtos en una variedad de medios de cultivo. 8 A continuación presentamos los pasos para la obtención de huellas digitales si se usan bacterias SESI -MS, incluyendo los parámetros instrumentales que deben ser optimizados para asegurar la identificación y caracterización bacteriana resistente.

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Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secundaria ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS) permite la detección de compuestos orgánicos volátiles (COV), sin necesidad de ningún tratamiento previo de la muestra. Este protocolo proporciona instrucciones para la rápida (en minutos) caracterización de compuestos orgánicos volátiles bacteriana con el SESI-MS.

La caracterización de compuestos volátiles bacteriana secundaria con ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

characterizing-bacterial-volatiles-using-secondary-electrospray

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

17.8K vistas.  University of Vermont. Secundaria ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS) permite la detección de compuestos orgánicos volátiles (COV), sin necesidad de ningún tratamiento previo de la muestra. Este protocolo proporciona instrucciones para la rápida (en minutos) caracterización de compuestos orgánicos volátiles bacteriana con el SESI-MS.

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Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Investigación

Bioingeniería

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bacterial Detección e Identificación Usando sensores electroquímicos

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Obtención de imágenes de tejidos biológicos por desorción ionización electrospray espectrometría de masas

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Preparación de la muestra Estrategias para Espectrometría de Masas de imágenes de modelos de cultivo celular en 3D

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Caracterización cualitativa de la fracción acuosa de hidrotérmico Licuefacción de algas mediante 2D cromatografía de gases con espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Todo el cuerpo de Espectrometría de Masas de imágenes por infrarrojos asistida por matriz de desorción láser de ionización electrospray (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingeniería 'Oro' de la fluorescencia por presión selectiva incorporación de aminoácidos no canónica y análisis de proteínas por espectrometría de masas y la fluorescencia

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...