Reconocemos el apoyo de subvenciones del NIH P30ES013508 y 5T32GM008076. También damos las gracias Thermo Scientific para acceder a SIEVE 2.0 y los Dres. Eugene Ciccimaro y Mark Sanders de Thermo Scientific útil para los debates.

1. Extracción de muestras a partir de células <ol><li> Para una placa de 10 cm de células: recolectar 1,5 ml de suspensión de células levantado en los medios de comunicación en un tubo de centrífuga de 10 ml de vidrio previamente etiquetado. Para las líneas de adherentes, las células deben ser levantadas con raspado suave en 1,5 ml de medio mantenido en hielo Opcional:. Si se utilizan las normas internas, añadir una alícuota adecuada en este paso. Comentario: enfriamiento del metabolismo celular es crucial para ciertos metabolitos. Para el análisis de los metabolitos sensibles al tiempo, se deben considerar los procedimientos tales como extracción con metanol frío. 17 </li><li> Añadir 6 ml de cloroformo (CHCl3) / metanol (CH3OH) (02:01, v / v) a cada uno de los tubos de vidrio de 10 ml que contienen las muestras. Establecer las muestras en una coctelera o multi-vórtice a baja velocidad durante 30 min. Después de agitar, se centrifugan las muestras con un nivel bajo de aceleración / desaceleración en 1935 xg durante 10 min a 4 ° C para separar completamente las fases. Opcional </em&gt;: Para evitar el uso de CHCl3, se pueden realizar extracciones con diclorometano (CH 2 Cl 2) 18,12. </li><li> El uso de un tallo largo pipeta Pasteur, transfiera la capa orgánica (inferior) a un nuevo pre-etiquetados 10 ml tubo de centrífuga de vidrio. Continúe 4.1. </li><li> Transferir la fase acuosa superior más tarde en un plástico de 2 ml tubo Eppendorf limpio. Se evapora la muestra en atmósfera de gas nitrógeno. Continuar 2.6.2 para desalación fase acuosa o continuar hasta el 4,1 para el análisis directo. </li></ol> 2. Extracción de muestras de suero <ol><li> Transferir 20 l de suero en un tubo Eppendorf de 2 ml de plástico Opcional:. Si se utilizan las normas internas, añadir una parte alícuota apropiada en este paso. </li><li> Añadir 190 l de CH 3 OH y agitar durante 10 segundos. </li><li> Añadir 380 l de CHCl3 y agitar durante 10 seg. </li><li> Añadir 120 l de H 2 O para inducir la separación de fases. Vortex las muestras durante 10 segundos y permitir que se equilibre a temperatura ambiente durante 10min. </li><li> Centrifugar las muestras a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C para separar las fases. </li><li> Pasar la fase orgánica inferior en un plástico de 2 ml tubo Eppendorf limpio. Continúe 4.1. </li><li> Transferir la fase acuosa superior más tarde en un plástico de 2 ml tubo Eppendorf limpio. Se evapora la muestra en atmósfera de gas nitrógeno. </li><li> Vuelva a suspender la muestra en 200 l H 2 O. Reactivos de ácido o base (0.1% de ácido acético, ácido fórmico o hidróxido de amonio al 0,1%) pueden ser utilizados para extraer preferentemente metabolitos sensibles al pH. Someter a ultrasonidos durante 20 min en hielo para volver a suspender la muestra completamente. </li><li> Active las columnas giratorias C18 con 500 l CH 3 OH. </li><li> Equilibrar la columna de centrifugación con dos lavados de 500 l H 2 O y luego cargar la muestra. Si se utilizan reactivos de ácido / base de mantener esta concentración en los pasos de lavado. </li><li> Lavar con 500 l H 2 O para desalar la muestra. Una vez más, si se utilizan reactivos de ácido / base de mantener esta concentración en el lavadopasos. </li><li> Eluir con dos volúmenes de 200 l 80% CH3OH en H 2 O en un 2 ml tubo Eppendorf limpio previamente etiquetado. Una vez más, si se utilizan reactivos de ácido / base de mantener esta concentración en los pasos de lavado. Continúe 4.1. </li></ol> 3. Extracción de muestras de tejido <ol><li> Dependiendo del tejido, utilizar entre 10-100 mg de tejido congelado. Añadir toda la pieza de tejido a un 2 ml bajo tubo Eppendorf de retención de pre-marcado con 1 ml de PBS (1 M, pH 6,8) en un baño de hielo Opcional:. Si se utilizan las normas internas, añadir en la memoria intermedia, antes de añadir el tejido. </li><li> Se homogeneiza el tejido en hielo con un triturador de tejidos eléctrico durante 30 segundos en cada Eppendorf. Entre las muestras, limpiar el triturador de tejidos en dos tubos separados que contienen CH 3 OH y H 2 O, respectivamente. </li><li> Transferir el homogeneizado de tejido con una pipeta de plástico de 10 ml en un tubo de centrífuga de vidrio previamente etiquetado. Después de la transferencia, enjuague cada tubo Eppendorf2x con 1 ml de CH3OH y añadir los lavados a la homogeneizado de tejido en los tubos de vidrio. </li><li> Añadir 4 ml de CHCl3 para cada uno de los tubos de vidrio de 10 ml que contienen el homogeneizado de tejido y CH 3 lavados OH. Establecer las muestras en una coctelera o multi-vórtice a baja velocidad durante 30 min. </li><li> Después de agitar, centrifugar las muestras con un nivel bajo de aceleración / deceleración a 1935 xg durante 10 minutos para separar completamente las fases Opcional:. Para evitar el uso de cloroformo, extracciones se han desarrollado con CH 2 Cl 2. </li><li> El uso de un tallo largo pipeta Pasteur, transfiera la capa orgánica (inferior) a un nuevo pre-etiquetados 10 ml tubo de centrífuga de vidrio. Continúe 4.1. </li><li> El uso de un tallo largo pipeta Pasteur, transferir la fase acuosa a un nuevo pre-etiquetados 10 ml tubo de centrífuga de vidrio. Ir a la 2.6.2 de desalación o continuar 4.1. </li></ol> 4. Re-suspensión y filtración de las muestras para la UPLC <ol><li> Se evapora el samples bajo gas nitrógeno. </li><li> Reconstituir secó abajo muestras en un volumen apropiado de la solución de partida para el método UPLC deseada (véase la Tabla 1). 50-100 l es por lo general un volumen de re-suspensión deseable. Vórtice suavemente y / o una pipeta la muestra hacia arriba y hacia abajo para ayudar a disolver los analitos. </li><li> Transferir la muestra en un tubo de 0,22 micras filtro de nylon y giran a hasta 14.000 xg hasta que la muestra ha pasado completamente a través del filtro (~ 5 minutos). Asegúrese de que no hay precipitados visible que queda en la muestra. </li><li> Transferir el sobrenadante de la muestra filtrada en un vial de UPLC de pre-marcado con inserto. Tapa del vial, a continuación, chasquear el vial para eliminar las burbujas de la parte inferior del vial de muestra. Colocar la muestra en el inyector automático refrigerado (4-5 ° C). </li></ol> 5. Configuración UPLC <ol><li> Utilizando el software de control para el cromatógrafo de líquidos, crear una carrera por la muestra orgánica con sede fuera de las condiciones enumeradas en <strong&gt; Tabla 1. A continuación, crear un método para la fase acuosa fuera de las condiciones enumeradas en la Tabla 1 Opcional:. Si un conjunto conocido de los analitos de interés son de gran interés, optimizar las condiciones UPLC utilizando el pesado análogo marcado de estos compuestos, y generar un método que utiliza estas condiciones . </li><li> Deje que la UPLC se equilibre adecuadamente. Esto debe incluir un cebado completo de disolventes antes de colocar una columna, y siguiendo las instrucciones del fabricante para el volumen de equilibrio de una nueva columna (generalmente 3-5 volúmenes de columna). Mantener un registro de iniciar de nuevo la presión para ayudar a diagnosticar problemas en el futuro. </li></ol> 6. Configuración espectrómetro de masas <ol><li> Usando el software de control para el espectrómetro de masas de alta resolución, crear un método de modo positivo usando las condiciones que se indican en la Tabla 2. Luego, utilizando las mismas condiciones, crear un método de modo negativo Opcional:. Si un conjunto conocido de los analitos de interés son de alta interest, fuente de optimizar y condiciones óptica utilizando la pesada etiqueta analógica de estos compuestos, y generar un método que utiliza estas condiciones. </li><li> Limpiar y calibrar el instrumento, establecer un aerosol estable en el espectrómetro, y dar tiempo para la solución de calibración para disipar adecuadamente de la fuente y la óptica. Estabilidad aceptable de aerosol debe dar un 3-5% RSD de la intensidad sobre al menos 100 exploraciones con la inyección de solución de calibración a la misma velocidad de flujo como se utiliza el método de LC. </li><li> Establecer la secuencia de todas las muestras, ajustar el volumen de inyección adecuada y ejecute un espacio en blanco antes de la primera muestra. Si se sospecha de remanentes o matriz efectos entre las muestras, ejecute blancos / lavaderos adecuados. Las muestras deben ser configurado de una manera al azar utilizando un generador de números aleatorios y una clave para evitar los efectos introducidos por lotes por el análisis. Comentario: las muestras de control de calidad, incluidas las normas de isótopos estables o estándares analíticos de posibles objetivos pueden serextremadamente valioso en la solución de problemas y asegurar resultados fiables y reproducibles y válidos. Una técnica de reproducir de una única muestra estándar seguido por un blanco de disolvente se puede utilizar para accesos de desviación de intensidad de la señal y tiempo de retención, así como el arrastre en el ensayo en blanco. </li><li> Comienza la secuencia y seguimiento periódico de problemas, incluyendo las fluctuaciones de presión o pérdida de intensidad de la señal a través de la ejecución. Si se detectan problemas graves, detener la carrera, y repetir de 6.2. </li></ol> 7. Análisis diferencial <ol><li> Dos flujos de trabajo se presentan en este protocolo. La primera es a través del tamiz 2.0, el software de análisis diferencial libre de marca patentada vendido por Thermo Fisher. El segundo flujo de trabajo es a través de XCMS Online, una plataforma gratuita a través del Instituto de Investigación Scripps. 11 Antes de comenzar el análisis diferencial, comprobar manualmente las TICs o mirar cromatogramas filtrados para cualquier compuesto conocido en la muestra para asegurar la reproducibilidad de las carrerasy la inyección / estabilidad UPLC / aerosol a través de todas las muestras. </li><li> CRIBA <ol><li> Transfiera los archivos de datos brutos. Desde el espectrómetro de masas en el disco duro de la estación de trabajo donde está instalado tamiz. (Nota: correr tamiz con los datos almacenados en una unidad conectada en red o el puerto USB no es recomendable, ya que puede limitar la velocidad de análisis.) </li><li> Abrir TAMIZ, y comenzar un nuevo experimento. </li><li> Cargue los archivos correspondientes en tamiz. </li><li> Asignar los grupos de comparación y seleccionar un archivo de referencia único para permitir tamiz para generar los parámetros para el análisis. </li><li> Siga las instrucciones y ajustar los parámetros según los requisitos de cualquier experimento individual. A menudo es aconsejable comenzar con parámetros estrictos, y luego ir hacia atrás y afloje los parámetros de configuración a medida que más generosos pueden alargar el tiempo de análisis. </li><li> Cargue la lista aducto correcta para el modo positivo o negativo en los parámetros. </li></ol></li><li> XCMS Online <ol><li> Convertir archivosen un formato aceptable para XCMS línea. En nuestro caso, nos convertimos al formato mzXML. 19 </li><li> XCMS abiertas en línea, y crear empleo. </li><li> Subir y nombrar los conjuntos de datos. Sólo dos conjuntos de datos (por ejemplo, control vs tratamiento) se pueden cargar como XCMS independientes se limita a comparaciones cara a cara. </li><li> Seleccione los ajustes que desee de la lista desplegable. Parámetros pre-pobladas están disponibles para diferentes configuraciones de instrumentación, y estos pueden ser modificados aún más para las necesidades experimentales. En nuestro caso, utilizamos la configuración HPLC-Orbi2. </li><li> Enviar y confirme trabajo. </li></ol></li><li> Análisis de Datos <ol><li> Para colador y XCMS una lista de marcos y características, respectivamente, se llenará una vez finalizado el análisis. Asegúrese de que la alineación LC superpone los picos emblemáticos. Si cualquiera de las carreras no alineados LC muestran gran desviación en los picos de señal esto puede indicar un problema con la muestra. Opcional: Para tamiz, si se utilizan las normas internas, busqueel grupo pico correspondiente y normalizar el marco seleccionado. Para XCMS On-line, la normalización puede realizarse en una hoja de cálculo después de la exportación. </li><li> Representar gráficamente los datos por el coeficiente de variación (CV) dentro de una población de la muestra como (por ejemplo, muestras de control). Los grandes valores de CV pueden indicar un problema con uno o más de la muestra. Ordenar la lista en función de las características deseadas (por ejemplo, valor de p &lt;0,05, doble cambio&gt; 1,5, baja desviación estándar dentro de un grupo, etc.) </li><li> Examine cada pico para una alineación apropiada pico entre los grupos, la integración de picos, pico gaussiano forma, intensidad de la señal, los isótopos y la asignación aducto. </li><li> Exportar datos como se desee para su posterior análisis o para generar listas masivas dirigidas para confirmación y MS n experimentos. </li></ol></li></ol>

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Los autores tienen nada que revelar.

Untargeted metabolómica ofrece una poderosa herramienta para la investigación de biotransformaciones endógenas o xenobióticos, o la captura de un perfil metabólico de una muestra de interés. La salida de las escalas técnica con la resolución y la sensibilidad de la tecnología utilizada para separar y analizar la muestra, la capacidad para hacer frente a los grandes conjuntos de datos generados, y la capacidad de extraer el conjunto de datos para obtener información útil (por ejemplo, precisa la búsq...

Debido a los recientes avances tecnológicos en el campo de HRMS, no focalizados, generador de hipótesis metabolómica enfoques se han convertido en un enfoque viable para el análisis de muestras complejas. 1 espectrómetros de masas capaces de facilitar la resolución 100000 de rutina bajo parte por millón (ppm) de masa de precisión han sido ampliamente disponible de varios proveedores. 2,3 Esta masa de precisión permite una mayor especificidad y la confianza en una asignación preliminar de la identidad del analito, reconocimiento de patrones isotópicos, y la identificación aducto. 4 Cuando se combina con un procedimiento de extracción adecuado y de alto rendimiento LC o UPLC, mezclas complejas puede ser analizado con especificidad adicional derivada de los datos de tiempo de retención. 5 UPLC posee una mayor eficiencia cromatográfica y permite tiempo mayor sensibilidad, resolución y análisis que expresa una mayor cobertura de la metaboloma posible. 6 Los grandes conjuntos de datos resultantes se pueden integrar en cualquierde software de análisis diferencial múltiple y extraídos de los patrones de útiles individuales o analitos de interés. 7,8,9,10,11 impacta putativos se pueden identificar inicialmente utilizando una combinación de algoritmos de detección de picos, basada en la predicción exacta fórmula química masa, la predicción de la fragmentación, y químico búsqueda de base de datos. Este enfoque permite la priorización de los objetivos de tiempo de identificación estructural completo o para el desarrollo de la dilución del isótopo estable más sensible y más específica UPLC / seleccionado o múltiples reacción monitoreo / estudios de MS, que son los actuales métodos estándar de oro para la cuantificación. 12 La naturaleza variable de las muestras biológicas ha conducido a la optimización de protocolos de extracción de orina 13, 14 células, suero de 15, 16 o tejido. Este protocolo de extracción de características para las células, el suero, y el tejido. En su caso, las observaciones y referencias adicionales se han incluido modificacionesción del procedimiento para abordar la inclusión de los isótopos estables, o la inclusión de metabolitos especialmente inestables.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W7-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (CH3CN)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A996-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (CH3OH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CH3Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td>Hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (CH2Cl2)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>61030-1000</td>
			<td>To replace chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl Ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>346136</td>
			<td>To replace chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid (FA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate (HCOONH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78314</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSpin C18 Columns</td>
			<td>Nest Group Inc</td>
			<td>SS18V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Centrifuge Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>73785-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>CLS-4301-015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Vials (glass)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>60000751CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Inserts (glass)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT094171</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Vials (plastic)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002640</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &mu;m Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8169</td>
			<td>nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf Tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3229-1</td>
			<td>Low Retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ XL-Orbitrap</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC/UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>nanoACQUITY UPLC</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source</td>
			<td>Michrom</td>
			<td>Thermo Advance Source</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Analysis Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SIEVE 2.0</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoACQUITY C18 BEH130</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003546</td>
			<td>1.7 &mu;m particle size, 150 mm x 100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acentis Express C8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54262</td>
			<td>2.7 &mu;m particle size, 15 cm x 200 &mu;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms)

Aquí se presenta un flujo de trabajo para analizar los perfiles metabólicos en muestras biológicas de interés, incluyendo: células, suero o tejido. La muestra se separa primero en fracciones polares y no polares por una extracción en fase líquido-líquido, y se purificó parcialmente para facilitar el análisis aguas abajo. Ambas fases acuosas (metabolitos polares) y metabolitos orgánicos (no polares) de la extracción inicial se procesan para medir un amplio rango de metabolitos. Los metabolitos se separaron mediante diferentes métodos de cromatografía de líquidos en base a sus propiedades de la partición. En este método, presentamos microflow ultra-desempeño (UP) los métodos de LC, pero el protocolo es escalable a los flujos más elevados y presiones más bajas. La introducción en el espectrómetro de masas puede ser a través de cualquiera de las condiciones generales de origen optimizadas o compuesto. La detección de una amplia gama de iones se lleva a cabo en el modo de barrido completo tanto en modo positivo y negativo en un amplio rango de m / z usando alta resolución en una recientemente calibrated instrumento. Etiqueta libre de análisis diferencial se lleva a cabo en las plataformas bioinformáticas. Las aplicaciones de este enfoque incluyen la detección vía metabólica, el descubrimiento de biomarcadores y el desarrollo de fármacos.

Los resultados presentados muestran los datos seleccionados de un tratamiento de 6 h de células de glioblastoma SH-SY5Y con el pesticida y complejo mitocondrial I rotenona inhibidor. Por razones de brevedad, se presenta sólo los datos en modo de fase positivos orgánicos. Las muestras se procesaron y se analizaron como se ha descrito anteriormente (Figura 1, Tabla 1, Tabla 2) y se cargaron en dos plataformas de análisis diferencial de la etiqueta libre de cuantificación, colador y XCMS línea. Aunqu...

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Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.

Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

untargeted-metabolomics-from-biological-sources-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

22.2K vistas.  University of Pennsylvania. Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.

Video: Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

A gran escala que no son objeto de perfiles metabolómicos de Serum Ultra Performance Liquid Chromatography-espectrometría de masas (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Investigación

Química

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

Rápida de alto rendimiento Identificación de Especies de material botánico Uso del análisis directo en tiempo real de alta resolución Espectrometría de Masas

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Análisis de la respiración en tiempo real mediante el uso de ionización secundaria Nanoelectrospray acoplada a espectrometría de masas de alta resolución

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Alto rendimiento y amplio farmacovigilancia mediante espectrometría de masas siguientes electroforesis capilar de inyección

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

Corrosión por imágenes en la interfaz metal-Paint usando espectrometría de masas de iones secundarios de tiempo de vuelo

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial resolution (~1 &#181;m). Furthermore, it describes how to obtain realistic three-dimensional (3D) distributions of segregated impurities/dopants in solid state materials. Direct 3D depth profile reconstruction is often difficult to achieve due to SIMS-related measurement artifacts. Presented here is a method to identify and solve this challenge. Three major issues are discussed, including the i) nonuniformity of the detector being compensated by flat-field correction; ii) vacuum background contribution (parasitic oxygen counts from residual gases present in the analysis chamber) being estimated and subtracted; and iii)&#160;performance of all steps within a stable timespan of the primary ion source. Wet chemical etching is used to reveal the position and types of dislocation in a material, then the SIMS result is superimposed on images obtained via scanning electron microscopy (SEM). Thus, the position of agglomerated impurities can be related to the position of certain defects. The method is fast and does not require sophisticated sample preparation stage; however, it requires a high-quality, stable ion source, and the entire measurement must be performed quickly to avoid deterioration of the primary beam parameters.

The presented method describes how to identify and solve measurement artifacts related to secondary ion mass spectrometry as well as obtain realistic 3D distributions of impurities/dopants in solid state materials.

Reconstrucción 3D del perfil de profundidad de las impurezas segregadas mediante espectrometría de masas de iones secundarios

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Caracterización de modificaciones de ARN en neuronas individuales mediante espectrometría de masas

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Extracción de aminoácidos no proteicos de cianobacterias para cromatografía líquida-análisis de espectrometría de masas en tándem

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...