Agradecemos a L. Douay y MC Giarratana (Universidad de París VI, Francia) para el asesoramiento en la diferenciación eritroide ex vivo, D. Allan H. y Atkins (OHRI, Canadá) para proporcionar muestras de sangre (obtenida en el Hospital de Ottawa de Ética de Investigación de la Junta # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) para proporcionar a los vectores lentiviral y FJ Dilworth (OHRI, Canadá) para la lectura crítica del manuscrito. Este proyecto fue financiado por una subvención CIHR (MOP-82813) para MBCGP es un beneficiario de una investigación Ontario Fondo Computacional Becas de Formación Postdoctoral Regulomics. MB titular de la Cátedra de Investigación de Canadá en el Reglamento de la expresión génica.

<ol>
	<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis:+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology.">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li><li>Kim, S. I., Bresnick, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+erythropoiesis:+emerging+mechanisms+and+principles.">Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles.</a> Oncogene. 26, (2007).</li><li>Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocytic+maturation+in+vitro+of+murine+(Friend)+virus-induced+leukemic+cells.">Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).</li><li>Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid-cell-specific+properties+of+transcription+factor+GATA-1+revealed+by+phenotypic+rescue+of+a+gene-targeted+cell+line.">Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line.</a> Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).</li><li>Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipotential+leukemia+cell+line+(K-562)+of+human+origin.">A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).</li><li>Giarratana, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+generation+of+fully+mature+human+red+blood+cells+from+hematopoietic+stem+cells.">Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).</li><li>Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+normal+hematopoietic+and+leukemia+stem+cell+hierarchy.">Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).</li><li>Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+lentivirus-mediated+gene+transfer+and+sustained+transgene+expression+in+human+hematopoietic+primitive+cells+and+their+progeny.">Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny.</a> Mol Ther. 6, 673-677 (2002).</li><li>Laurenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+and+shRNA+expression+in+resident+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo.</a> Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).</li><li>Palii, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+genomic+targeting+of+the+transcription+factor+TAL1+in+alternate+haematopoietic+lineages.">Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages.</a> EMBO J. 30, 494-509 (2011).</li><li>Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+maturation+of+human+erythroid+progenitors+in+liquid+culture.">Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture.</a> Blood. 73, 100-103 (1989).</li><li>Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+major+blood+group+antigens+on+human+erythroid+cells+in+a+two+phase+liquid+culture+system.">Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system.</a> Blood. 75, 505-511 (1990).</li><li>Sui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin-independent+erythrocyte+production:+signals+through+gp130+and+c-kit+dramatically+promote+erythropoiesis+from+human+CD34++cells.">Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells.</a> J Exp Med. 183, 837-845 (1996).</li><li>Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+human+stem+cell+factor/erythropoietin-dependent+erythroid+progenitor+cells+in+vitro.">Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro.</a> Blood. 92, 3658-3668 (1998).</li><li>Lindern, M. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glucocorticoid+receptor+cooperates+with+the+erythropoietin+receptor+and+c-Kit+to+enhance+and+sustain+proliferation+of+erythroid+progenitors+in+vitro.">The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro.</a> Blood. 94, 550-559 (1999).</li><li>Freyssinier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=amplification+and+characterization+of+a+population+of+human+erythroid+progenitors.">amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors.</a> Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).</li><li>Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+human+red+blood+cell+production+from+hematopoietic+progenitor+cells.">An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 91, 2664-2671 (1998).</li><li>Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-3+has+a+nonapoptotic+function+in+erythroid+maturation.">Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation.</a> Blood. 103, 4310-4316 (2004).</li><li>Mazurier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+and+efficient+selection+of+human+transduced+primitive+hematopoietic+cells+using+the+humanized+S65T+green+fluorescent+protein.">Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein.</a> Gene Ther. 5, 556-562 (1998).</li><li>Salmon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+transgene+expression+in+human+hematopoietic+progenitors+and+differentiated+blood+lineages+after+transduction+with+improved+lentiviral+vectors.">High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors.</a> Blood. 96, 3392-3398 (2000).</li></ol>

Una serie de métodos se han utilizado previamente para diferenciar las células eritroides en la cultura, con grados variables de éxito. Por ejemplo, algunos protocolos, sin co-cultivo de MS-5 permite la expansión de las células eritroides, pero no son eficientes en la producción de células completamente maduros enucleados rojos 12-17. Mientras que otros métodos permiten la enucleación eficiente, es a expensas de la proliferación de 18,19. El método que hemos utilizado aquí, inicialmente...

lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells

La eritropoyesis es un sistema modelo utilizado para estudiar la diferenciación celular. Durante la eritropoyesis, pluripotentes humanas adultas células madre hematopoyéticas (HSC) se diferencian en células progenitoras oligopotent, precursores comprometidos y los glóbulos rojos maduros 1. Este proceso está regulado en gran parte a nivel de la expresión génica, en el que factores de transcripción específicos del linaje activar genes específicos, mientras que simultáneamente la represión de los genes que son específicos para otros tipos de células 2. Los estudios sobre factores de transcripción que regula la eritropoyesis se realizan a menudo con líneas celulares humanas y murinas que representan, en cierta medida, las células eritroides en las etapas de diferenciación dado 5.3. Sin embargo, líneas de células transformadas pueden imitar sólo parcialmente las células eritroides y lo más importante no permitir que un estudio de forma comprensible los cambios dinámicos que ocurren cuando las células de los avances a través de muchas etapas hacia su último destino eritroides. Por lo tanto, un reto actual sigue siendo el desarrollo de un protocolo para obtener una población relativamente homogénea de las CMH primario y las células eritroides en las diversas etapas de diferenciación en cantidades que sean suficientes para llevar a cabo la genómica y la proteómica experimentos. A continuación se describe una célula de ex vivo protocolo de cultivo para inducir la diferenciación eritroide de hematopoyéticas humanas células madre / progenitoras que han sido aislados de sangre del cordón umbilical o de médula ósea o sangre periférica movilizada para adultos con G-CSF (aféresis). Este sistema de cultivo, inicialmente desarrollado por el laboratorio de Douay 6, utiliza las citocinas y la cultura co-en las células mesenquimales para imitar el microambiente de la médula ósea. El uso de este protocolo de diferenciación in vivo ex, se observa una fuerte amplificación de los progenitores eritroides, la inducción de diferenciación exclusivamente hacia el linaje eritroide y una maduración completa a la etapa de enucleado los glóbulos rojos. Así, este sistema ofrece la oportunidad de estudiar el mecanismo molecular de la regulación transcripcional de las células madre hematopoyéticas progreso a lo largo del linaje eritroide. El estudio de la eritropoyesis en el nivel de la transcripción también se requiere la capacidad de los factores específicos de más de expresar o una caída en la enseñanza primaria las células eritroides. Para ello, se utiliza un sistema de genes lentivirus mediada por la entrega que permite que la infección eficiente de la división y que no se dividen las células 7. Aquí mostramos que somos capaces de caída de manera eficiente la TAL1 factor de transcripción en células primarias de eritroides humanos. Además, la expresión de GFP demuestra una eficiencia de la infección por lentivirus cerca del 90%. Por lo tanto, el protocolo ofrece un sistema muy útil para la caracterización de la red de regulación de factores de transcripción que la eritropoyesis control.

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells at JoVE.com

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Protocolo para generar células maduras de la sangre humana rojo de madre hematopoyéticas / progenitores se describe. Además se describe una eficiente entrega lentiviral método para derribar el TAL1 factor de transcripción en las células eritroides primaria. La eficiencia de la administración de genes mediada por lentivirus se demuestra el uso de virus que expresan GFP.

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

lentiviral-mediated-knockdown-during-ex-vivo-erythropoiesis-human

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

13.0K vistas.  Ottawa Hospital Research Institute. Un Ex vivo Protocolo para generar células maduras de la sangre humana rojo de madre hematopoyéticas / progenitores se describe. Además se describe una eficiente entrega lentiviral método para derribar el TAL1 factor de transcripción en las células eritroides primaria. La eficiencia de la administración de genes mediada por lentivirus se demuestra el uso de virus que expresan GFP.