Damos las gracias a Bert Dibbits de asistencia técnica. La cría de animales y Grupo de Genómica, la Universidad de Wageningen, Países Bajos, generosamente nos acogió en su laboratorio. El personal del Observatorio Ottenby Bird, Suecia, se agradece trampeo y muestreo del ánade real, en particular, Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Magnusson y Christopher Andersson Stina. Damos las gracias a Sanne Svensson, Qvist Jonatan y Per-Axel Gjöres para el rodaje en Ottenby, y Camón Mano para la filmación en el laboratorio. Daniel siempre Bengtson bellas fotografías de pato para la parte de vídeo de esta publicación. Más material libre de la Biblioteca Pública de los CDC de la imagen de la Salud (PHIL; <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/</a> ) se utilizó: El microscopio electrónico (n º 280, por el Dr. Erskine Palmer) e ilustración (n º 11823; por Douglas Jordania) del virus de la influenza. El apoyo financiero fue dada por el KNJV (Royal Netherlands Hunters Association), el Ministerio holandés de Agricultura, Faunafonds y la Stichting de Fideicomisos Eik (tanto en los Países Bajos), el Consejo Sueco de Investigación (concesión no. 2.007-20.774) y la CE fundada Newflubird proyecto. Productos químicos de aislamiento de ARN fueron un generoso regalo de Ambion, Inc, la compañía de ARN. Esta es la contribución N º 245, del Observatorio de Aves Ottenby.

1. Pato trampas y Frotar la cloaca <ol><li> Trampa escarceos patos del género Anas (u otras aves) en una jaula por atraerlos con patos señuelo o alimentos, y ponerlos en cajas individuales de cartón. El tiempo de transporte en la caja debe ser reducido al mínimo, por ejemplo, mediante la instalación de una estación de campo a corta distancia a la trampa. Circunstancias logística puede variar en cada estudio. El consejo y la aprobación del correspondiente comité de ética de los animales debe ser buscada por cada nuevo set-up. Por otra parte, también cazador de aves cazadas pueden ser degustados. </li><li> Saque el pato de la caja mediante la celebración de sus alas apretado a su cuerpo. Muestra una caída fresco, que estará presente en la mayoría de los casos, directamente desde la parte inferior de la caja. Recogerlos con una gasa estéril y aplique el líquido a una tarjeta de Whatman FTA. Si no es así, lleve a cabo hisopado cloacal. </li><li> A su vez el pato en la espalda. Esto permite el acceso a la cloaca y facilita la toma de muestras. La cloaca es una estructura que sobresale situado por debajo del abdomen, cerca de la base de la cola. Una persona con experiencia podía contener y la muestra de aves, al mismo tiempo, o bien una segunda persona puede ayudar. </li><li> Inserte cuidadosamente el hisopo estéril de plástico rayón (Copan, Italia), aproximadamente 1 cm y hacer un remolino suave de la cloaca. Rodar el hisopo con los fluidos de la cloaca en la superficie de una tarjeta de Whatman FTA. Después del muestreo se ha realizado liberación inmediata de los animales es deseable. </li><li> Seca las tarjetas de FTA a temperatura ambiente durante al menos 1 hora, a continuación, almacenar cada muestra individual en bolsas de papel (sobres, por ejemplo). El almacenamiento es posible a temperatura ambiente, posiblemente con perlas de sílice en climas húmedos. El envío y recepción de los oficiales instituciones de bioseguridad puede permitir enviar tarjetas de TLC por correo ordinario, ya que los patógenos se vuelven inactivos al entrar en contacto con la superficie de la tarjeta FTA. </li></ol> 2. El aislamiento de ARN viral <ol><li> Extraer el material de la tarjeta FTA incluidas las heces / líquido cloacal. Perfore tres discos con un golpeador mm Harris 2 y el lugar a todos aquellos dentro de un pozo de una placa de RNasa libre 96well. Entre cada muestra nueva, limpia cuidadosamente el golpeador con el alcohol y una precisión Kim limpiar (KIMTECH). Siempre use los controles positivos y negativos. Un control positivo puede consistir en una cepa de laboratorio recién aplicado a una tarjeta de libre comercio, o una muestra natural que se sabe que un resultado positivo. Como control negativo, ponche a cabo los discos de un acuerdo de libre comercio para tarjetas vacía. Además, dejar a otro, así libre para un control PCR después de su experiencia (con el agua como plantilla). </li><li> Añadir 70μl de solución de extracción rápida del ARN (Ambion) y el calor de sellado de la placa (AbGene Thermo-Sellador). Incubar 5 minutos en un agitador de placas a temperatura ambiente con la velocidad determinada que no causa desbordamiento (esto depende de la placa, que modelo de agitador; prueba de antemano). </li><li> Realizar aislamiento viral ARN de acuerdo con los protocolos del fabricante con el MagMAX-96 aislamiento de ARN viral kit (Ambion). En resumen: Agregar 130μl preparado lisis / vinculante solución (del kit) a cada pocillo. Transferencia de material extraído 50μl TLC tarjeta a cada pocillo. Agitar la placa durante 1 minuto. </li><li> Añadir 20μl mezcla preparada de cuentas (del kit) a cada muestra y mezclar pipeteando arriba y hacia abajo. Agitar en velocidad determinada durante 5 minutos. Las moléculas de ARN se unirá a las perlas magnéticas. </li><li> Mover la placa de un campo magnético de 96 pozos de pie para capturar las bolas. Dependiendo del modelo de soporte magnético utilizado, esto puede tomar más de 5 minutos. Cuando la solución se ha vuelto completamente claro, retirar y desechar el sobrenadante. A continuación, retire la placa del soporte magnético. </li><li> Lave las cuentas dos veces con solución de lavado 1 y dos veces con solución de lavado 2 (del kit). Para cada uno de los cuatro pasos de lavado añadir 150μl solución de lavado preparado para cada muestra, agitar durante 1 minuto a velocidad determinada, mover la placa en el soporte magnético, la captura de cuentas por unos 5 minutos (o hasta que la solución está del todo claro), y eliminar descartar el sobrenadante. A continuación, retire la placa del soporte magnético, añadir la solución de limpieza que viene, y llevar a cabo los pasos de lavado como antes. Después de la etapa de lavado último, eliminar la solución de lavado tanto como sea posible y deje secar los granos a temperatura ambiente en el agitador de placas durante 2 minutos. </li><li> Añadir 50μl de tampón de elución (del kit) para liberar el ARN de las cuentas y agitar durante 4 minutos en el agitador de placas. Captura de cuentas como se describió anteriormente. El sobrenadante contiene ahora el ARN aislado que está listo para aplicaciones posteriores. </li></ol> 3. RT-PCR del gen de la AIV Matrix Llevar a cabo la PCR con transcripción inversa (RT-PCR) con el acceso de un solo paso RT-PCR System (Promega) en 25 reacciones l (adaptado de Kraus et al 18 y Fouchier et al 22..): <table border="1"><tbody><tr><td> Nucleasa agua libre </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 buffer </td&gt; <td> 5μl </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> imprimación M52C 22 (10 M) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> imprimación M253R 22 (10 M) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 mM) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV de la transcriptasa inversa (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Tfl polimerasa (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> ARN de la muestra </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> Las condiciones de PCR en un termociclador Biometra T1 son: la transcripción inversa inicial de 45 minutos a 45 ° C, seguido de 2 minutos de desnaturalización a 94 ° C y 40 ciclos de: 94 ° C durante 1 minuto, 56 ° C durante 1 minuto, y 68 ° C durante 2 minutos. Una elongación adicional de 7 minutos a 68 ° C llega a la conclusión de la amplificación. 4. La detección de muestras positivas a influenza aviar y la purificación de fragmentos orientado de Gel <ol><li> Carga 2μl del producto de PCR se mezcla con tinte 2μl carga 5x (BioRad) y agua 6μl en un 1% en gel de agarosa (Roche) teñido con bromuro de etidio al 1% (2.5μl por cada 100 ml de gel) para una pre-evaluación. </li><li> Dejar correr el gel durante 1 hora a 120, junto con un tamaño estándar de ADN (BioRad carga EZ escalera de 100 pb), visualizar con un sistema de documentación de geles. Vea un ejemplo en la Figura 1. </li><li> Seleccionar las muestras con los fragmentos amplificados en el rango de tamaño esperado (entre 200 pb y 300 pb (fragmento diana es de 244 pb). Cargue el volumen total de reacción de PCR (de los cuales se dejan ~ 23μl) de estos candidatos con el tinte 6μl carga 5x en un 2 bromuro de etidio manchadas% en gel de agarosa y una duración de 2 horas. </li><li> Colocar el gel en un transiluminador UV (Bioblock Científicas) y una inspección visual. Vea un ejemplo en la figura 2. Las bandas de los impuestos especiales de la talla correcta de gel con un bisturí y se coloca en tubos de 1,5 ml cada reacción. Purificar fragmentos de gel, por ejemplo, con la recuperación Zymoclean Gel de ADN Kit (Zymo de Investigación). </li></ol> 5. Secuenciación e Identificación de los productos PCR <ol><li> Llevar a cabo la secuenciación de Sanger de los fragmentos de destino, por ejemplo en un ABI 3730 secuenciador capilar ABI Big Dye con 3,1 química (Applied Biosystems). Preparar la secuencia de reacciones en los volúmenes de 10μl conteniendo 10-20 ng gel purificado plantilla de cDNA de amortiguamiento, 1.75μl dilución de 5x, gran 0.5μl premezcla tinte V3.1, una imprimación l hacia delante (M52C 20, 10 mM), y ddH2O. Ciclismo condiciones son: 1 min de desnaturalización inicial, seguido por 25 ciclos de: 10 s a 96 ° C, 5 s a 45 ° C y 4 minutos a 60 º C. Purificar y preparar la reacción de secuenciación de acuerdo a sus protocolos internos. </li><li> Identificar las secuencias de ADNc resultante con bases de datos de nucleótidos, como GenBank23, por ejemplo, de las herramientas con tales como BLAST en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. Los resultados representativos: Ánade real (Anas platyrhynchos) fueron muestreados a Ottenby Observatorio de Aves en diciembre de 2007. De cada uno de ánade real de una muestra en la tarjeta FTA fue tomada como se describe en este protocolo. Después del envío, las tarjetas de FTA se mantuvieron en un congelador a -20 ° C durante dos años. La misma muestra TLC tarjeta del laboratorio examinado de manera aislada en Kraus et al. 18 se incluyó como control positivo, así como nueve diluciones seriadas diez veces de la misma. Dos controles negativos fueron i) la extracción de una tarjeta vacía de libre comercio, para comprobar si hubo traspaso de la perforadora, y ii) RT-PCR reacción en la que se utilizó agua libre de nucleasa como plantilla, para poner a prueba si la contaminación se produjo durante o en la preparación de la reacción de PCR. 84 muestras fueron analizadas. Una imagen del gel de los productos PCR de estas 84 muestras se pueden encontrar en la figura 1. A partir de muestras naturales de una multitud de bandas inespecíficas se pueden observar debido a la presencia de contaminaciones microbianas diversas en las heces. Sin embargo, el fragmento diana del primer par es de 244 pb. Toda la reacción PCR volumen de un subconjunto de las muestras que produjeron fragmentos de aproximadamente el rango de tamaño adecuado (entre 200 pb y 300 pb) fue cargado en gel (Figura 1). Un ejemplo de que una de las bandas se cortaron del gel se puede encontrar en la figura de apoyo 1. Además de los controles positivos, dos de estas muestras (69.899 y 69.912) fueron positivas por el nuevo protocolo. Una explosión de búsqueda contra la base de datos NCBI de nucleótidos reveló su identidad como AI matriz de genes (Figura 3), mientras que todas las otras bandas parecía secuencias bacterianas más de cerca, o no producir una secuencia legible en todo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" /> Figura 1. Gel imagen de una selección preliminar de los productos de PCR. 2 l producto de PCR del control positivo, sdiluciones erial del control positivo, dos controles negativos y 84 muestras cloacales fueron cargados. 48 muestras se muestran en el panel de gel superior, y las muestras de 48 en el panel inferior. Las flechas rojas indican carriles de gel que se utiliza para 100 pares de bases del ADN de tamaño estándar. A título de ejemplo, los círculos rojos indican las bandas en el rango de tamaño esperado. Los círculos azules indican una amplificación inespecífica (arriba a la izquierda) o un artefacto dímero imprimación debajo de 100 pb de tamaño (inferior derecha). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" /> Figura 2. Las muestras de selección de muestras con los fragmentos en el rango de tamaño correcto. Con bandas de 200 pb y 300 pb (244 pb objetivo fragmento) fueron elegidos. La flecha verde indica que el control positivo, las dos flechas rojas indican las muestras que fueron confirmados como positivos AIV mediante la comparación de sus secuencias de cDNA de la base de datos NCBI de nucleótidos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" /> Figura 3. Captura de pantalla de una búsqueda BLAST en el NCBI representante. Una de las secuencias de ADNc obtenidas a partir de los fragmentos extirpados fue consultada la base de datos de nucleótidos en el sitio web de NCBI. La muestra está correctamente identificado como fragmento de gen AI Matrix. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">Para ver la versión completa de esta imagen, haga clic aquí.</a> <img alt="Complementaria la figura 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" /> Figura S1. Bandas de muestras seleccionadas extirpados de gel. Esta foto fue tomada a partir del gel se muestra en la Figura 1, después de bandas candidatas entre los 200 pb y 300 pb fueron cortadas.

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+FTA+cards+as+a+laboratory+and+field+sampling+device+for+the+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus+and+serotyping+by+RT-PCR+and+real-time+RT-PCR.">Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR.</a> J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).</li><li>Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FTA+filter+paper+for+the+molecular+detection+of+Newcastle+disease+virus.">Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus.</a> Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).</li></ol>

Captura, manejo y toma de muestras de aves se realiza siguiendo la legislación nacional y fueron aprobados por el Consejo de Agricultura de Suecia y el comité de ética de la investigación de los animales.

El protocolo descrito aquí proporciona un método complementario a la pantalla de muestras fecales o similar para la presencia de VIA. Fue diseñado especialmente para la recogida de muestras rápido y fácil. Esto hace posible que las personas menos entrenadas, como cazadores o gestores de la vida silvestre, para contribuir a la vigilancia de la AI. Nada de cadenas de frío se deben aplicar, a pesar de la congelación de las muestras, se recomienda siempre que sea posible. A los pocos días de la temperatura ambiente, por ejemplo durante el transporte al laboratorio, no fueron un problema para las moléculas de ARN en las tarjetas de TLC, siempre y cuando las tarjetas se mantuvo seco. Otros no refrigerados los sistemas de almacenamiento que se están evaluando por la comunidad científica, como el alcohol de 15 o 16 de guanidina, requieren un régimen especial de envío debido a su naturaleza peligrosa. En contraste, el método de la tarjeta TLC no requieren el envío de materiales peligrosos. Sin embargo, otro medio de almacenamiento interesante a este respecto es RNAlater ™ que no es peligroso, ya sea 17. Análisis de la muestra se puede realizar en cualquier laboratorio molecular estándar. No requiere equipo especial que no sea para siempre las reacciones de PCR y secuenciación capilar que se necesitaba. Todas las medidas que podrían llevarse a cabo sin un nivel de bioseguridad, porque ya en la recogida de muestras, los agentes patógenos potenciales fueron desactivados por la actividad antibacteriana y antiviral de la tarjeta FTA. La contaminación cruzada de muestras y posterior de falsos positivos no se han observado en nuestras pruebas con muestras de aves silvestres. Sin embargo, cuando se trabaja con RNA y PCR siempre es recomendable prestar especial atención a los lugares de trabajo limpios y las habitaciones separadas para los pasos de pre-y post-PCR. Trabajar en una campana de extracción, disminuye el riesgo de contaminación de aerosoles en el laboratorio. Pipeteo debe llevarse a cabo con puntas con filtro. De un estudio previo de las muestras tomadas al mismo tiempo de los patos mismo sabemos que seis de las 84 muestras fueron positivas por el tiempo real tradicional método RT-PCR 24 y los valores de Ct de tiempo real RT-PCR se conocen. Las dos muestras positivas detectadas por nuestro método de madre de los patos que tenían valores de Ct &lt;30 (que indica una alta concentración de ARN viral). Las otras cuatro muestras que dieron positivo con el protocolo tradicional tenían valores de Ct&gt; 30 (menor concentración) y no pudo ser detectada por el protocolo. Sólo las muestras con títulos de virus relativamente altos fueron positivos en nuestro ensayo, y es probable que la sensibilidad del método fue el origen de la imposibilidad de detectar todas las muestras positivas. Además, el tamaño de la muestra en el estudio era muy baja y el método puede ser completamente desarrollado y evaluado si los experimentos más controlada y rigurosa se llevan a cabo. Sin embargo, si estas muestras se han recogido de una zona remota, el análisis tradicional no habría sido posible en absoluto. Además, estos primeros resultados se derivan de las experiencias piloto que se necesita una mayor optimización. Un período de dos años de almacenamiento en un congelador a -20 ° regulares C después de la toma de muestras, probablemente también se ve afectada la calidad del ARN viral. Que esto sea posible la degradación del ARN es un tema importante cuando se trata de guardar a temperatura ambiente de virus inactivados. Las muestras almacenadas en los líquidos alternativos como se mencionó anteriormente sufren de una degradación significativa que afecta el análisis de los tramos más largos del genoma viral 16. Aunque no han sido evaluados en nuestro estudio, las tarjetas de FTA han demostrado ser muy adecuado para conservar intactas las moléculas de ARN en otros sistemas de ARN que son muy similares a los virus de la gripe aviar 25, 26.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo o instrumento </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Plástico rayón hisopo seco </td><td> Copán, Italia </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> TLC tarjeta </td><td> Whatman </td><td></td><td> varias opciones </td></tr><tr><td> Harris micro punch de 2 mm con estera </td><td> Whatman </td><td> 1154409 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa libre 96well placa </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 652290 </td><td> o comparables </td></tr><tr><td> Kim precisión toallitas </td><td> KIMTECH </td><td> 75512 </td><td></td></tr><tr><td> ARN rápida solución de extracción </td><td> Ambion </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMAX-96 Kit de aislamiento viral </td><td> Ambion </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> One-Step RT-PCR de acceso del sistema </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> o comparables </td></tr><tr><td> Agarosa MP </td><td> Roche </td><td> 1388991001 </td><td> de usos múltiples de agarosa </td></tr><tr><td> Tampón de carga 5x </td><td> BioRad </td><td></td><td> entregado con escalera de ADN </td></tr><tr><td> EZ carga de 100 pb escalera </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> o comparables </td></tr><tr><td> El bromuro de etidio 1% </td><td> Fluka </td><td> 46067 </td><td> o comparables </td></tr><tr><td> Tubos de 1,5 ml de reacción </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> o comparables </td></tr><tr><td> Zymoclean Gel de ADN kit de recuperación </td><td> Zymo Investigación </td><td> D4001 </td><td> o comparables </td></tr><tr><td> ABI Big Dye 3,1 química </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td> o comparables </td></tr></tbody></table>

avian influenza surveillance with fta  cards: field methods, biosafety, and transportation issues solved

Virus de influenza aviar (AIVs) infectan a muchos mamíferos, incluyendo seres humanos 1. Estos AIVs son diversos en sus huéspedes naturales, albergando casi todos los posibles subtipos virales 2. Pandemias de gripe humana originalmente provienen de AIVs 3. Muchos de los casos fatales humanos durante los brotes de H5N1 en los últimos años se registraron. Últimamente, una nueva cepa relacionada con AIV se extendió por la población humana, causando cuatro de la &#39;epidemia de gripe porcina &quot;. Aunque el comercio y la actividad humana de transporte parece ser responsable de la propagación de cepas de alta patogenicidad 5, la dispersión puede ser atribuida en parte a las aves silvestres 6, 7. Sin embargo, el depósito real de todas las cepas de VIA son las aves silvestres. En reacción a esto y frente a graves pérdidas comerciales en la industria de aves de corral, los grandes programas de vigilancia se han aplicado a nivel mundial para reunir información sobre la ecología de AIVs, y la instalación de sistemas de alerta temprana para detectar ciertas cepas altamente patógenas 08.12. Los métodos tradicionales requieren virológica virus que está intacta y cultivadas antes del análisis. Para ello se requiere estricta cadena de frío con congeladores y pesados ​​procedimientos de bioseguridad para estar en su lugar durante el transporte. Vigilancia a largo plazo es por lo tanto, generalmente se limita a una pocas estaciones de campo cerca de laboratorios bien equipados. Zonas remotas que no pueden ser degustados a menos que los procedimientos de logística complicado su aplicación. Estos problemas han sido reconocidos 13, 14 y el uso de almacenamiento y estrategias alternativas de transporte investigado (alcoholes o guanidina) 15-17. Recientemente, Kraus et al. 18 introdujo un método para recopilar, almacenar y transportar las muestras de VIA, basada en un papel filtro especial. 19 tarjetas FTA preservar el ARN en una base de almacenamiento en seco 20 y hacer que los agentes patógenos inactiva al entrar en contacto 21. Este estudio mostró que las tarjetas de FTA puede ser utilizado para detectar AIV ARN en la PCR con transcripción inversa y que el ADNc resultante podría ser secuenciado los genes del virus y determina. En el estudio de Kraus et al. 18 un laboratorio aislado del AIV se utilizó, y las muestras fueron manejadas de forma individual. En la extensión que aquí se presenta, muestras de heces de las aves silvestres de la trampa de pato en el Observatorio de Aves Ottenby (SE Suecia) se pusieron a prueba directamente para ilustrar la utilidad de los métodos en condiciones de campo. La captura de los patos y la recogida de muestras de hisopos cloacales se demuestra. El protocolo actual incluye aumento de escala del flujo de trabajo de la manipulación de un solo tubo con un diseño de 96 pozos. Aunque es menos sensible que los métodos tradicionales, el método de tarjetas FTA proporciona un excelente complemento a los sistemas de vigilancia de gran tamaño. Se permite la recolección y análisis de muestras de cualquier parte del mundo, sin la necesidad de mantener una cadena de frío o de las normas de seguridad con respecto al envío de reactivos peligrosos, como el alcohol o guanidina.

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Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Un método para preservar, detectar y secuencia de ARN del virus de la gripe aviar fue confirmada y ampliada usando colorantes naturales como muestras de heces de las aves. Esta técnica elimina la necesidad de mantener una cadena de frío y la manipulación de virus infecciosos y puede ser aplicado en un 96-así de alto rendimiento de la instalación.

Vigilancia de la Gripe Aviar, con tarjetas FTA: Métodos de Campo, la bioseguridad y los problemas de transporte resueltos

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

avian-influenza-surveillance-with-fta-cards-field-methods-biosafety

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K vistas.  Wageningen University. Un método para preservar, detectar y secuencia de ARN del virus de la gripe aviar fue confirmada y ampliada usando colorantes naturales como muestras de heces de las aves. Esta técnica elimina la necesidad de mantener una cadena de frío y la manipulación de virus infecciosos y puede ser aplicado en un 96-así de alto rendimiento de la instalación.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Investigación

Inmunología e Infección

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

El diagnóstico rápido del virus de la influenza aviar en aves silvestres: El uso de un portátil de RT-PCR y reactivos liofilizados en el campo

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Modelado El ciclo de vida de Ebola Virus Bajo Nivel de Bioseguridad 2 Condiciones Con-Virus como partículas que contienen Tetracistronic minigenomas

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-inmunoprecipitación de la proteína de ratón Mx1 con la Influenza A nucleoproteína del virus

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Medición de Influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (H3N2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.