Biz Bert Dibbits teknik yardım için teşekkür ederim. Hayvancılık ve Genomik Grubu, Wageningen Üniversitesi, Hollanda, laboratuvar cömertçe bize ev sahipliği yaptı. Ottenby Kuş Gözlemevi, İsveç, personel, özellikle Magnus Hellström, Marcus Danielsson, Kristof Magnusson ve Stina Andersson, yeşilbaş yakalama ve örnekleme için teşekkür. Biz laboratuarda film Sanne Svensson, Jonatan Qvist ve Ottenby az film başına Axel Gjöres ve Mano Camon teşekkür ederim. Daniel Bengtson bu yayının video bölümü için güzel ördek fotoğrafları sağladı. CDC Halk Sağlığı Görüntü Kütüphanesi (PHIL; daha fazla <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">malzeme</a> http://phil.cdc.gov/phil/) kullanıldı: elektron mikrografı (no. 280, Dr. Erskine Palmer) ve illüstrasyon (no. 11823; Douglas Ürdün) grip virüsü. Mali destek KNJV (Hollanda Kraliyet Avcıları Derneği), Hollanda Tarım Bakanlığı, Faunafonds ve Stichting de Eik Ortaklıkları (Hollanda) tarafından verildi, İsveç Araştırma Konseyi (hibe yok. 2.007-20.774) ve AT Newflubird proje kurdu. RNA izolasyonu kimyasallar Ambion, Inc, RNA şirket cömert bir hediye edildi. Bu Ottenby Kuş Gözlemevi katkısı No 245.

1. Ördek Yakalama ve kloakal Swab <ol><li> Tuzak cazibesi ördek veya gıda ile çekerek bir kafes cinsi Enes (ya da diğer kuşlar) ördekler dabbling ve bireysel karton kutular içine koydu. Ulaştırma kutusu zamanı yakalamak için kısa bir mesafe içinde bir alan istasyonu kurarak, örneğin, minimum düzeyde tutulmalıdır. Lojistik durumlarda her çalışma değişebilir. Tavsiye ve her yeni set-up için ilgili hayvan etik kurul onayı aranmalıdır gerekiyor. Alternatif olarak, avcı vurdu kuşlar da tadılabilir. </li><li> Kanatlarını onun vücut için sıkı tutarak kutunun ördek dışarı atın. Örnek taze bırakarak, doğrudan kutunun altındaki olguların çoğunda mevcut olacaktır. Steril bir çubukla Pick up ve whatman FTA kartı sıvı uygulamak. Aksi takdirde, kloakal sürüntü gerçekleştirin. </li><li> Sırtında ördek açın. Bu lağım ve örnekleme erişime izin kolaylaştırır. Lağım kuyruk tabanına yakın karın altında yer çıkıntılı bir yapı. Deneyimli bir kişi kuş tutun ve örnek aynı zamanda, ya da başka bir ikinci kişi yardımcı olabilir. </li><li> Dikkatlice yerleştirin ve steril plastik rayon çubukla (Copan, İtalya), yaklaşık 1 cm lağım nazik bir girdap yapmak. Whatman FTA kartı yüzey üzerinde lağım sıvıları ile çubukla döndürün. Hayvan örnekleme yapıldıktan sonra derhal serbest bırakılmasını arzu edilir. </li><li> En az 1 saat oda sıcaklığında FTA kartları Kuru, daha sonra kağıt torba (örneğin zarf) Her bir numune ayrı ayrı saklayın. Depolama muhtemelen nemli iklimlerde silika boncuk, oda sıcaklığında mümkündür. Gönderme ve kurumların biyogüvenlik memurları alan patojenler FTA kart yüzeyi ile temas halinde aktif hale gelir bu yana, normal posta yoluyla FTA kartları göndermek için izin verebilir. </li></ol> 2. Viral RNA İzolasyonu <ol><li> Dışkı / kloakal sıvı da dahil olmak üzere STA kartı malzeme ayıklayın. Punch üç Harris 2 mm zımba ve yeri bir RNaz ücretsiz 96well plaka bir kuyuya bu diskler. Her yeni örnek arasında, alkol ve Kim hassasiyet (Kimtech) silin zımba dikkatle temizleyin. Her zaman pozitif ve negatif denetimlerini kullanın. Pozitif kontrol taze bir STA kartına uygulanan bir laboratuvar suşu, ya da olumlu bir sonuç biliyorum doğal bir örnek oluşabilir. Negatif kontrol olarak, boş bir STA kart diskleri yumruk. Ayrıca, (şablon olarak su ile) daha sonra deney PCR kontrolü için başka bir de serbest bırakın. </li><li> 70μl RNA ekstraksiyon hızlı çözüm (Ambion) ve ısı-mühür plaka (AbGene Thermo-Sealer) ekleyin. , (Önceden test kullanılan plaka çalkalayıcı modele bağlıdır) taşma neden olmaz belirlenen hız ile bir tabak çalkalayıcı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> MagMAX-96 viral RNA izolasyon kiti (Ambion) ile üreticinin protokollere göre viral RNA izolasyonu taşıyın. Kısaca: Ekle 130μl hazırlanan lizis / her bir kuyu için bağlayıcı bir çözüm (kit). Transferi 50μl her iyi FTA kartı malzemesi ayıklanır. 1 dakika için plaka çalkalayınız. </li><li> 20μl hazırlanan boncuk karışımı (kit) yukarı ve aşağı pipetleme tarafından her bir örnek ve karışımı ekleyin. 5 dakika için belirlenen hız çalkalayınız. RNA molekülleri, manyetik boncuk bağlanacaktır. </li><li> Bir manyetik plaka Taşı 96-boncuk yakalamak stand. Kullanılan manyetik stand modeline bağlı olarak, bu 5 dakikadan daha fazla sürebilir. Çözümün tamamen açık haline geldiğinde, kaldırmak ve süpernatantı atın. Sonra manyetik stand plaka kaldırmak. </li><li> Boncuklar, yıkama solüsyonu 1 ile iki kez yıkama solüsyonu 2 (kit) ile iki kez yıkayın. 4 yıkama adımları her örnek 150μl hazırlanan yıkama solüsyonu için (ya da çözüm tamamen temizlenene kadar) belirlenen hızda 1 dakika, manyetik standı plaka taşımak yaklaşık 5 dakika için boncuk yakalamak sallamak, kaldırmak ve süpernatantı atın. Sonra, manyetik stand plaka kaldırmak sonraki yıkama solüsyonu ve yıkama adımları önceden yürütmek. Son yıkama adımdan sonra, plaka çalkalayıcı 2 dakika boyunca oda sıcaklığında ve kuru hava boncuk olduğunca yıkama solüsyonu çıkarın. </li><li> Boncuk RNA serbest ve plaka çalkalayıcı 4 dakika çalkalanır elüsyon tampon 50μl (kit) ekleyin. Daha önce açıklandığı gibi boncuklar Yakalama. Süpernatant şimdi aşağı uygulamalar için hazırdır izole RNA içerir. </li></ol> 3. AIV Matrix Gene RT-PCR One-Step Erişim RT-PCR sistemi ile ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) (Promega) 25 ul reaksiyonlarda yürütmek (Kraus ve ark ayarlanabilir 18 ve 22 Fouchier et al.) <table border="1"><tbody><tr><td> Nükleazlar ücretsiz su </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 tampon </td&gt; <td> 5μl </td></tr><tr><td> dNTP </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> astar M52C 22 (10 mcM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> astar M253R 22 (10 mcM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 mM) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV ters transkriptaz (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> TFL polimeraz (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> RNA örnek </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> Biometra T1 PCR PCR koşulları: 45 az 45 dakika ilk ters transkripsiyon ° C, 2 dakika ilk denatürasyon 94 ° C ve 40 döngü: 94 ° C 1 dakika, 1 dakika boyunca 56 ° C ve 2 dakika süreyle 68 ° C. 68 ek bir 7 dakika uzaması ° C amplifikasyon sonucuna varmaktadır. 4. AI-pozitif Örnekleri Tarama ve Jel Hedeflenen Fragments saflaştırılması <ol><li> 2μl ön eleme için% 1 etidyum bromür (ortalama 2.5μl 100 ml jel) ile boyanmış% 1 agaroz jel (Roche) 2μl 5x yükleme boya (BioRad) ve 6μl su ile karıştırılarak PCR ürün yükleyin. </li><li> DNA boyutu standart (BioRad EZ yük 100 baz puan (bp) merdiven) ile birlikte, 120V az 1 saat için jel çalıştırın bir jel dokümantasyon sistemi ile görselleştirmek. Şekil 1&#39;de bir örneğe bakın. </li><li> 2 6μl 5x optik yükleme boya ile bu adayların tüm PCR reaksiyon hacmi (23μl ~ hangi sol) yükleyin beklenen boyut aralığı amplifiye parçaları (200 bp ve 300 bp (hedef parçası 244 bp) arasında örnekleri seçin. % etidyum bromür agaroz jel lekeli ve 2 saat boyunca çalışır. </li><li> UV-transilluminator&#39;de (Bioblock Bilimsel) jel üzerine yerleştirin ve görsel olarak incelenmelidir. Şekil 2&#39;de bir örneğe bakın. 1,5 ml reaksiyon tüpleri bireysel bir neşter ve yerleştirilen jel doğru boyutu Vergi bantları. Zymoclean Jel DNA Kurtarma Takımı (Zymo Araştırma) ile örneğin, jel parçaları arındırın. </li></ol> 5. Sıralama ve PCR Ürünlerinin Tanıtımı <ol><li> ABI ABI Big Boya 3.1 kimya (Applied Biosystems) ile 3730 kapiller sequencer Sanger sıralama, örneğin hedef parçaları yürütmek. 10-20 ng jel içeren 10μl hacimleri sıralama reaksiyonlar hazırlayın saflaştırılmış şablon cDNA, 1.75μl 5x seyreltme tamponu, 0.5μl Big Boya V3.1 premix, 1 ul ileri astar (M52C 20, 10 mM) ve ddH2O. Bisiklete binme şartlar şunlardır: 1 dakika 25 devir izledi ilk denatürasyon, 96 de 10 sn ° C - 45 ° C ve 60 az 4 dakika 5 s ° C Arındırmak ve iç protokollere göre sıralama reaksiyon hazırlamak. </li><li> CDNA dizileri gibi GenBank23 Biyoteknoloji Bilgi (NCBI, Ulusal Merkezi az BLAST gibi web tabanlı araçlar örneğin nükleotid veritabanları, karşı çıkan <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> tanımlayın ). </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Yeşilbaş (Anas platyrhynchos) Ottenby Kuş Gözlemevi Aralık 2007&#39;de örneklendi. Bu protokol açıklandığı gibi, her yeşilbaş itibaren FTA kartta bir örnek alınmıştır. FTA kartları nakliye sonra, iki yıl boyunca -20 ° C&#39;de derin dondurucuda muhafaza edildi. Laboratuvar aynı FTA kartı örneği Kraus ve ark test izole 18, pozitif kontrol yanı sıra dokuz on kat seri dilüsyonları olarak dahil oldu . İki negatif kontroller) boş bir STA kart çıkarma, carry-over-zımba olup olmadığını sınamak için, ii) nükleaz ücretsiz su şablon olarak kullanılmış olan RT-PCR reaksiyonu kirlenme meydana gelirse test etmek için, ya da i PCR reaksiyonu hazırlanması. 84 numuneler analiz edildi. Bu 84 örneklerden PCR ürünlerinin jel resmi Şekil 1&#39;de bulunabilir. Doğal örneklerinden belirsiz gruplarından çok sayıda dışkı çeşitli mikrobiyal kontaminasyon varlığı nedeniyle görülebilir. Ancak, primer çifti hedef parçası 244 bp uzunluğunda. Jel (Şekil 1), yaklaşık olarak doğru boyut aralığı (200 bp ve 300 bp arasında) parçaları üretilen örneklerin bir alt kümesi tüm PCR reaksiyon hacmi yüklendi. Ek Şekil 1 jel kesilen bantların hangi bir örnek bulunabilir. Pozitif kontrol ek olarak, bu örnekler iki yeni protokol (69.899 ve 69.912) pozitif bulunmuştur. NCBI nükleotid veritabanına karşı BLAST arama, tüm diğer bantlar bakteriyel dizileri en yakın benziyordu veya okunabilir bir dizi hiç verim vermedi AI matris gen (Şekil 3) olarak kendi kimliklerini ortaya çıkardı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" /> Şekil 1. PCR ürünleri bir ön tarama Jel resim pozitif kontrol 2 ul PCR ürünü, sPozitif kontrol, iki negatif kontroller ve 84 kloakal örnekleri erial dilüsyonları yüklendi. 48 örnekleri alt panelinde üst jel paneli ve 48 örnekleri gösterilmiştir. Kırmızı oklar, 100 bp DNA büyüklükleri standart için kullanılan jel şeritleri göstermektedir. Resimde, kırmızı daireler beklenen boyut aralığı bantları göstermektedir. Mavi çevreler belirsiz bir Amplikon (sol üstte) veya boyutu 100 bp (sağ altta) altına astar dimer artefact göstermektedir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" /> Şekil 2. 200 bp ve 300 bp (hedef parçası 244 bp) arasındaki bantları ile örneklerin parçaları ile doğru boyut aralığı seçimi. Örnekleri seçilmiştir. Yeşil ok pozitif kontrol gösterir, iki kırmızı oklar NCBI nükleotid veritabanı cDNA dizileri karşılaştırarak AIV pozitif olarak teyit edildi örnekleri göstermektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" /> Şekil 3. NCBI bir temsilci BLAST arama Ekran yakalama eksize parçaları elde edilen cDNA dizileri biri NCBI web sitesinde nükleotid veritabanına karşı sorgulanır oldu. Örnek doğru AI Matrix gen parçası olarak tanımlanır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">Bu görüntünün tam boyutlu bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Ek Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" /> Ek Şekil S1. Seçilen örneklerin jel eksize Gruplar Bu resim, 200 bp ve 300 bp arasında aday bantları sonra Şekil 1&#39;de tasvir jel alınmıştır kesilmiştir .

<ol>
	<li>Pulido, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+and+evolution+of+avian+migration.">The genetics and evolution of avian migration.</a> BioScience. 57, 165-174 (2007).</li><li>Bin Muzaffar, S., Ydenberg, R. C., Jones, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza:+An+ecological+and+evolutionary+perspective+for+waterbird+scientists.">Avian influenza: An ecological and evolutionary perspective for waterbird scientists.</a> Waterbirds. 29, 243-257 (2006).</li><li>Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+virulence+of+the+1918+"Spanish"+influenza+virus.">The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus.</a> Proc. Am. Philos. Soc. 150, 86-112 (2006).</li><li>Butler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+flu+goes+global.">Swine flu goes global.</a> Nature. 458, 1082-1083 (2009).</li><li>Normile, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza.+Wild+birds+only+partly+to+blame+in+spreading+H5N1.">Avian influenza. Wild birds only partly to blame in spreading H5N1.</a> Science. 312, 1451-14 (2006).</li><li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+global+H5N1+outbreaks+match+bird+migration+patterns.">Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns.</a> Geospat. Health. 4, 65-78 (2009).</li><li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+the+spread+of+the+highly+pathogenic+avian+influenza+H5N1+virus+in+wild+birds+in+Europe.">Environmental factors influencing the spread of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in wild birds in Europe.</a> Ecol. Soc. 15, 26-26 (2010).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+dissemination+of+H5N1+viruses+isolated+during+an+influenza+outbreak+in+migratory+waterfowl+in+Western+China.">Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China.</a> J. Virol. 80, 5976-5983 (2006).</li><li>Gaidet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+viruses+in+water+birds.">Avian influenza viruses in water birds.</a> Africa. Emerg. Infect. Dis. 13, 626-629 (2007).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+in+migratory+birds+and+evidence+of+limited+intercontinental+virus+exchange.">Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange.</a> PLoS Pathog. 3, e167-e167 (2007).</li><li>Parmley, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+bird+influenza+survey,+Canada,+2005.">Wild bird influenza survey, Canada, 2005.</a> Emerg. Infect. Dis. 14, 84-87 (2005).</li><li>Wallensten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+influenza+A+virus+in+migratory+waterfowl+in+northern+Europe.">Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 404-411 (2007).</li><li>Munster, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+high-throughput+influenza+A+virus+surveillance+studies+of+wild+birds+by+use+of+molecular+diagnostic+tests.">Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 666-673 (2009).</li><li>Latorre-Margalef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+influenza+A+virus+infection+on+migrating+mallard+ducks.">Effects of influenza A virus infection on migrating mallard ducks.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1029-1036 (2009).</li><li>Runstadler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RRT-PCR+analysis+and+virus+isolation+to+determine+the+prevalence+of+avian+influenza+virus+infections+in+ducks+at+Minto+Flats+State+Game+Refuge,+Alaska,+during+August+2005.">Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005.</a> Arch. Virol. 152, 1901-1910 (2007).</li><li>Evers, D. L., Slemons, R. D., Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+preservative+on+recoverable+RT-PCR+amplicon+length+from+influenza+A+virus+in+bird+feces.">Effect of preservative on recoverable RT-PCR amplicon length from influenza A virus in bird feces.</a> Avian Dis. 51, 965-968 (2007).</li><li>Forster, J. L., Harkin, V. B., Graham, D. A., McCullough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sample+type,+temperature+and+RNAlater+(TM)+on+the+stability+of+avian+influenza+virus+RNA.">The effect of sample type, temperature and RNAlater (TM) on the stability of avian influenza virus RNA.</a> J. Virol. Methods. 149, 190-194 (2008).</li><li>Kraus, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+surveillance:+On+the+usability+of+FTA+cards+to+solve+biosafety+and+transport+issues.">Avian influenza surveillance: On the usability of FTA cards to solve biosafety and transport issues.</a> Wildfowl. , 215-223 (2009).</li><li>Smith, L. M., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting,+archiving+and+processing+DNA+from+wildlife+samples+using+FTA+databasing+paper.">Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA databasing paper.</a> BMC Ecol. 4, 4-4 (2004).</li><li>Rogers, C. D. G., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription+of+an+RNA+genome+from+databasing+paper+(FTA).">Reverse transcription of an RNA genome from databasing paper (FTA).</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 219-224 (2000).</li><li>Rogers, C., Burgoyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+typing:+Storing+and+processing+of+stabilized+reference+bacteria+for+polymerase+chain+reaction+without+preparing+DNA+-+An+example+of+an+automatable+procedure.">Bacterial typing: Storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing DNA - An example of an automatable procedure.</a> Anal. Biochem. 247, 223-227 (1997).</li><li>Fouchier, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+influenza+a+viruses+from+different+species+by+PCR+amplification+of+conserved+sequences+in+the+matrix+gene.">Detection of influenza a viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene.</a> J. Clin. Microbiol. 38, 4096-4101 (2000).</li><li>Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Res. 38, 46-51 (2009).</li><li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes.">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li><li>Muthukrishnan, M., Singanallur, N. B., Ralla, K., Villuppanoor, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+FTA+cards+as+a+laboratory+and+field+sampling+device+for+the+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus+and+serotyping+by+RT-PCR+and+real-time+RT-PCR.">Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR.</a> J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).</li><li>Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FTA+filter+paper+for+the+molecular+detection+of+Newcastle+disease+virus.">Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus.</a> Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).</li></ol>

, Tuzakla, yol tutuşu ve ulusal mevzuat kuş örnekleme yapıldı ve İsveç Tarım ve araştırma hayvan etik komitesi Kurulu tarafından kabul edildi.

Burada açıklanan protokol AIV varlığı dışkı ya da benzer örnekleri ekrana ek bir yöntem sağlar. Özellikle örnek toplama, hızlı ve kolay hale getirmek için tasarlanmış. Bu sayede daha az eğitimli kişiler, avcılar ya da yaban hayatı yöneticileri olarak AI gözetim katkıda bulunmak için yapar. Mümkünse örnekleri dondurma önerilmez rağmen, soğuk zincir, uygulanması gerekir. Örneğin oda sıcaklığında bir kaç gün, laboratuvar taşıma sırasında kartları kuru kaldığı sürece, RNA molekülleri FTA kartları için bir sorun değildi. Araştırma topluluğu tarafından değerlendirilir, alkol 15 veya guanidin 16 gibi diğer non-soğutmalı depolama sistemleri, tehlikeli doğası nedeniyle özel nakliye düzenlemeleri gerektirir. Buna karşın, STA kartı yöntemi tehlikeli maddelerin nakliye gerektirmez. Ancak, bu konuda bir başka ilginç depolama ortamı, 17 ya tehlikeli değildir RNAlater ™. Örnek herhangi bir standart moleküler laboratuvarda analiz yapılabilir. Her zamanki PCR reaksiyonları ve kılcal dizilimini dışında hiçbir özel ekipman gerektirmez. Örnek toplama zaten potansiyel patojen ajanları FTA kartı antibakteriyel ve antiviral aktivite inaktive edildi çünkü tüm adımlar bir biyogüvenlik düzeyi olmadan yerine getirilebilir. Çapraz kontaminasyon ve yabani kuş örnekleri ile sonraki yanlış pozitif örnekler çalışmalarda gözlenmemiştir. Ancak, RNA ve PCR ile çalışırken, pre-ve post-PCR adımlar için çalışma yerleri ve ayrı odalarda temizlemek için özel dikkat etmek her zaman tavsiye edilir. Davlumbaz Çalışma laboratuarda aerosol kontaminasyon riskini azaltır. Pipetleme filtre ipuçları ile yapılmalıdır. 84 örnek altı geleneksel RealTime RT-PCR yöntemi 24 ve RealTime RT-PCR Ct değerlerini bilinen olumlu olduğunu biliyorum aynı ördek aynı anda alınan numuneler üzerinde önceki bir çalışmada. Ct değerleri &lt;30 (viral RNA yüksek konsantrasyonda belirten) ördekler yöntem kök tarafından tespit edilen iki pozitif örnekler. Geleneksel protokol ile pozitif bulunmuştur diğer dört örnek Ct değerlerinin&gt; 30 (daha az yoğun) ve protokol tarafından tespit edilemedi. Sadece nispeten yüksek virüs titreleri olan örnekleri bizim testinin pozitif olduğunu ve bu yöntemin duyarlılığı tüm pozitif örnekleri tespit edilememesi kaynağı olması muhtemeldir. Ayrıca, bu çalışmada örneklem büyüklüğü çok düşük olduğunu ve daha kontrollü ve titiz deneyler yapılır eğer bu yöntem tamamen geliştirilmiş ve değerlendirilmelidir. Ancak, bu örnekleri uzak bir alana toplanan olurdu, geleneksel analiz hiç mümkün olmuş olmaz. Ayrıca, bu ilk sonuçlar, daha fazla optimizasyon ihtiyacı pilot deneyler kaynaklanmaktadır. Örnek toplandıktan sonra düzenli olarak -20 ° C derin dondurucu, iki yıllık depolama bir dönem muhtemelen viral RNA kalitesini etkiledi. Bu mümkün RNA bozulması inaktive virüs oda sıcaklığında depolama ile ilgili önemli bir konudur. Alternatif sıvı, yukarıda da belirtildiği gibi saklanan örnekler, viral genom 16 uzamaktadır analizi etkileri önemli ölçüde bozulma muzdarip. Çalışmamızda test olmamakla birlikte, FTA kartları Avian İnfluenza virüsleri 25, 26 çok benzer diğer RNA sistemlerinde sağlam RNA molekülleri korumak için uygun olduğu kanıtlanmıştır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif ya da enstrüman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Plastik rayon kuru çubukla </td><td> Copan, İtalya </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> STA kartı </td><td> Whatman </td><td></td><td> çeşitli seçenekler </td></tr><tr><td> Harris mikro yumruk 2mm mat </td><td> Whatman </td><td> 1154409 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz ücretsiz 96well plaka </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 652290 </td><td> veya benzer </td></tr><tr><td> Kim hassas mendil </td><td> Kimtech </td><td> 75512 </td><td></td></tr><tr><td> RNA hızlı çıkarma çözüm </td><td> Ambion </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMAX-96 viral izolasyon kiti </td><td> Ambion </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> Bir Adım Erişim RT-PCR sistemi </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> veya benzer </td></tr><tr><td> Agaroz MP </td><td> Roche </td><td> 1388991001 </td><td> çok amaçlı agaroz </td></tr><tr><td> 5x yükleme tamponu </td><td> BioRad </td><td></td><td> DNA merdiveni ile teslim </td></tr><tr><td> EZ yük 100 bp merdiven </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> veya benzer </td></tr><tr><td> Etidyum bromür% 1 </td><td> Fluka </td><td> 46067 </td><td> veya benzer </td></tr><tr><td> 1.5ml reaksiyon tüpleri </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> veya benzer </td></tr><tr><td> Zymoclean Jel DNA kurtarma kiti </td><td> Zymo Araştırma </td><td> D4001 </td><td> veya benzer </td></tr><tr><td> ABI büyük boya 3.1 kimya </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td> veya benzer </td></tr></tbody></table>

avian influenza surveillance with fta  cards: field methods, biosafety, and transportation issues solved

Kuş Gribi Virüsler (AIVs) insanlarda 1 de dahil olmak üzere birçok memeli, bozar. Bu AIVs neredeyse tüm olası virüs alt tipi 2 barındıran, kendi doğal hosts çeşitlidir. İnsan gribi pandemiler başlangıçta AIVs 3 kaynaklanmaktadır. Birçok ölümcül H5N1 salgınları sırasında, son yıllarda insan vakaları bildirilmiştir. Son zamanlarda yeni bir AIV ilgili gerginlik, insan nüfusunun kasıp kavuran &#39;domuz gribi salgını&#39; 4 neden. Insan ticareti ve ulaşım faaliyetleri yüksek derecede patojen suşları 5 yayılması için sorumlu olacak gibi görünse de, dağılma da kısmen yabani kuşlar 6, 7 atfedilen olabilir. Ancak, tüm AIV suşları gerçek rezervuarı yabani kuşlar. Bu ve kanatlı sektöründe ağır ticari kayıplar karşısında tepki olarak, büyük gözetim programları AIVs ekolojisi hakkında bilgi toplamak için ve bazı yüksek derecede patojen suşları 8-12 algılamak için erken uyarı sistemleri kurmak için küresel uygulanmıştır. Geleneksel virolojik yöntemlerle virüs sağlam ve analizden önce ekili gerektirir. Bu, derin dondurucu ve taşıma sırasında yerde olmak ağır biyogüvenlik prosedürleri ile sıkı soğuk zincirleri gerektirir. Bu nedenle, uzun vadeli bir gözetim, genellikle iyi donanımlı laboratuvarlara yakın birkaç alan istasyonları sınırlıdır. Lojistik hantal prosedürler uygulanmaktadır sürece uzak bölgelerde örneklenmiş olamaz. Bu sorunlar 13 tanınan, 14 ve alternatif depolama ve taşıma stratejileri (alkol veya guanidin) 15-17 araştırıldı edilmiştir. Son zamanlarda, Kraus ve ark. 18, özel bir filtre kağıdı dayalı toplamak için bir yöntem, saklama ve taşıma AIV örnekleri, tanıttı . STA kartları 19 kuru bir depolama temeli 20 RNA korumak ve iletişim 21 üzerine etkin patojenlerin kılmak. Bu çalışmada, STA kartları ters transkripsiyon PCR ve ortaya çıkan cDNA dizisi ve virüs genleri ve kararlı olabilir AIV RNA tespit etmek için kullanılabileceğini gösterdi. AIV kullanılmış ve örnekleri ayrı ayrı ele alındı ​​Kraus ve ark. 18 çalışmasında bir laboratuvarda izole . Burada sunulan uzantısı, Ottenby Kuş Gözlemevi (SE İsveç) ördek tuzağı yabani kuşların dışkı örnekleri saha şartlarında yöntemlerinin yararlılığı göstermek için doğrudan test edildi. Kloakal bezlerden ördek ve örnek toplama yakalamak olduğunu göstermiştir. Geçerli protokol, tek tüp işleme 96-iyi bir tasarım iş akış yukarı ölçeklendirme içerir. FTA kartları yöntemi geleneksel yöntemlere göre daha az duyarlı olmasına rağmen, büyük gözetim programları için mükemmel bir ek sağlar. Korunması için soğuk zincir veya alkol ya da guanidin olarak tehlikeli reaktifler, nakliye açısından bir güvenlik düzenlemelerine gerek kalmadan dünyanın herhangi bir yerinden gelen örneklerin toplanması ve analizi sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved at JoVE.com

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Kuş Gribi Virüsler RNA, korumak, tespit ve sıra için bir yöntem doğrulanmış ve kuşların doğal dışkı örnekleri kullanarak uzatıldı. Bu teknik, bir soğuk zincir ve bulaşıcı virüslerin taşıma sürdürmenin gerekliliğini ortadan kaldırır ve 96-iyi bir yüksek verimli kurulum yapılabilir.

Kuş FTA Kartları İnfluenza Sürveyans: Alan Yöntemleri, Biyogüvenlik ve Ulaşım Sorunları çözüldü

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

avian-influenza-surveillance-with-fta-cards-field-methods-biosafety

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K Görüntüleme.  Wageningen University. Kuş Gribi Virüsler RNA, korumak, tespit ve sıra için bir yöntem doğrulanmış ve kuşların doğal dışkı örnekleri kullanarak uzatıldı. Bu teknik, bir soğuk zincir ve bulaşıcı virüslerin taşıma sürdürmenin gerekliliğini ortadan kaldırır ve 96-iyi bir yüksek verimli kurulum yapılabilir.

Video: Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

Yabani Kuşlar Kuş Gribi Virüsü Hızlı Teşhis: Alanında Taşınabilir RRT-PCR ve Dondurulmuş kuru Reaktifler Kullanımı

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Tetracistronic minigenomlar İçeren virüs benzeri partiküller ile Biyogüvenlik Seviyesi 2 Koşullarında Ebola virüsü Ömrü Modelleme

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.