우리는 기술 지원 버트 Dibbits 감사합니다. 동물 사육 및 게놈 그룹, Wageningen 대학, 네덜란드, 아낌없이 자신의 실험실에서 우리를 열었다. Ottenby 버드 천문대, 스웨덴의 직원은 특정 매그너스 Hellström, 마커스 Danielsson, 크리스토퍼 매그너슨 및 Stina 앤더슨에 맬러즈 트래핑 및 샘플링에 대한 감사입니다. 우리는 실험실에서 촬영을위한 Sanne 스벤슨, Jonatan Qvist 및 Ottenby에서 촬영을 위해 당 엑셀 Gjöres, 그리고 마노 Camon 감사드립니다. 다니엘 Bengtson이 간행물의 비디오 부분에 대한 아름다운 오리 사진을 제공했습니다. CDC 보건 이미지 라이브러리 (필,에서 자유 자재 <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/는</a> ) 사용 되었음 : 전자 현미경 (제 280; 박사 어스킨 팔머에 의해)와 그림 (제 11823을; 인플루엔자 바이러스의 더글러스 요르단)에 의해. 재정 지원은 KNJV (로얄 네덜란드 사냥꾼 협회), 농업의 네덜란드 교육부, Faunafonds과에는 Stichting 드 Eik 트러스트 (모두 네덜란드)에 의해 주어진 것으로 스웨덴 연구 협의회 (부여 안돼. 2007-20774)과 EC Newflubird 프로젝트 설립. RNA 격리 화학 물질 앰비온, Inc의 RNA 회사의 후한 선물했다. 이것은 Ottenby 버드 천문대에서 기여 번호 245입니다.

1. 오리 트래핑 및 Cloacal 보라고 <ol><li> 함정 류어 오리 또는 음식을 유치하여 케이지에 속 Anas (또는 다른 조류)의 오리 dabbling, 개인 카드 보드 상자에 넣어 두었어요. 상자에 교통 시간은 함정에 가까운 거리 내에서 필드 스테이션을 설치하여, 예를 들어, 최소로 보관해야합니다. 물류 환경은 각 연구에 따라 다를 수 있습니다. 조언 및 관련 동물 윤리위원회의 승인이 설정 각각의 새로운 추적을해야합니다. 또는 또한 사냥꾼 쇼트 조류는 샘플 수 있습니다. </li><li> 그 몸에 꽉 날개를 개최하여 상자의 오리 뽑아 낸다. 직접 상자의 아래쪽에서 가지 경우 대부분 존재하는 신선한 떨어지는를 샘플. 멸균 면봉으로 그들을 들고 왓먼 ​​FTA 카드에 유체를 적용해야합니다. 그렇지 않다면, cloacal 보라고을 수행합니다. </li><li> 의 뒷면에있는 오리를 켭니다. 이것은 하수에 대한 액세스를 허용하고 샘플링을 용이하게합니다. 하수구가 꼬리의 기본에 가까운 복부 아래에 위치하고 튀어나온 구조입니다. 경험이 풍부한 사람이 보유하고 샘플 새를 동시에, 또는 다른 두 사람이 도와 드릴 수 없습니다. </li><li> 조심스럽게 멸균 플라스틱 레이온 면봉 (코판, 이탈리아) 약 1cm를 삽입하고 하수의 완만한 소용돌이를 확인하십시오. 왓먼 FTA 카드의 표면을 통해 하수의 유체로 면봉을 롤. 동물의 샘플링을 수행한 후에는 즉시 릴리스는 바람직합니다. </li><li> 최소한 1 시간 동안 실온에서 FTA 카드를 건조 후, 종이 봉지 (예 : 봉투)에 각각 샘플을 저장합니다. 스토리지 아마도 습한 기후에서 실리카 비즈와 상온에서 가능합니다. 전송 및 기관 &#39;biosafety 임원을 받고는 병원균이 FTA 카드 표면과 접촉시 운영 중지 상태가 될 있기 때문에, 일반 우편으로 FTA 카드를 보낼 수 있도록 수 있습니다. </li></ol> 2. 바이러스성 RNA 격리 <ol><li> 찌끼 / cloacal 유체를 포함하여 FTA 카드 자료를 추출합니다. 펀치 세 번 해리스 2mm의 구멍을 뚫는 장소 RNase 무료 96well 판의 우물에 사람을 모두와 함께 디스크. 각각의 새 샘플 사이, 알코올과 김 정학 (Kimtech) 닦아와 함께 조심스럽게 구멍을 뚫는를 청소하십시오. 항상 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 사용합니다. 긍정적인 컨트롤은 갓 FTA 카드에 적용 실험실 변형, 또는 긍정적인 결과를 얻을 수 알지있는 자연 샘플로 구성될 수 있습니다. 대조군으로, 빈 FTA 카드에서 디스크를 펀치. 또한, (템플릿으로 물로) 나중에 실험에서 PCR 컨트롤에 대한 또 다른 잘 무료로 둡니다. </li><li> 70μl RNA 빠른 추출 솔루션 (앰비온)과 열 밀봉 플레이트 (AbGene 온습 실러) 추가합니다. (; 사전에 시험이 사용된 접시 쉐이크 모델에 따라 다름) 유출 - 이상 발생하지 않는 결정 속도 상온에서 접시 쉐이크 5 분 알을 품다. </li><li> MagMAX - 96 바이러스 RNA 격리 키트 (앰비온)와 제조 업체의 프로토콜에 따라 바이러스성 RNA 격리 운반. 간단히 : 시간을 추가하십시오 130μl 준비 용해 / 각 잘하는 바인딩 솔루션 (키트에서). 전송 50μl는 각 잘하는 FTA 카드 자료를 추출. 1 분 접시를 흔들어. </li><li> 그리고 아래로 pipetting하여 각 샘플과 섞어 20μl 준비 구슬 믹스 (키트에서) 추가합니다. 5 분 결정 속도를 흔들어. RNA 분자는 자석 구슬에 바인딩합니다. </li><li> 자장으로 접시를 이동 96 잘 구슬을 캡처하라. 사용 자성 스탠드의 모델에 따라,이 5 분 이상 걸릴 수 있습니다. 솔루션은 완전히 명확 살이되면 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. 그런 다음 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 세척 용액 1 두 번 씻어 솔루션 2 (키트에서)와 함께 두 번 구슬을 씻으십시오. 4 세척 단계 각 각 샘플을 150μl 준비 세척 솔루션을 추가하는 경우, (또는 솔루션은 완전히 명확까지) 결정 속도에 1 분, 자기 서서 접시를 이동 약 5 분 동안 구슬을 캡처 흔들, 제거하고 뜨는 폐기하십시오. 그런 다음 자석 스탠드에서 접시를 제거 다음 씻어 솔루션을 추가하고, 같은 이전에 세척 단계를 수행합니다. 마지막 세척 단계 후, 2 분 동안 접시 통에 실온에서 가능하고 공기 건조 비즈만큼 씻어 솔루션을 제거합니다. </li><li> 비즈에서 RNA를 해제하고 접시 쉐이크 4 분 흔들 용출 버퍼의 50μl를 (키트에서) 추가합니다. 이전에 설명한대로 구슬을 캡처합니다. 뜨는 지금 하류 애플 리케이션을위한 준비가 분리된 RNA가 포함되어 있습니다. </li></ol> 3. AIV 매트릭스 진의 RT - PCR 25 μl 반응에서 한 단계 RT - PCR 교통 시스템과 역방향 전사 PCR (RT - PCR) (Promega)를 수행 (. 크라우스 외에서 조정 18 Fouchier 외 22.) <table border="1"><tbody><tr><td> Nuclease 무료로 물 </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 버퍼 </td&gt; <td> 5μl </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> 프라이머 M52C 22 (10 μm의) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> 프라이머 M253R 22 (10 μm의) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 ㎜) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV 반대 transcriptase (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Tfl 효소 (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> RNA 샘플 </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> Biometra T1 thermocycler의 PCR 조건은 45 45 분 초기 역방향 전사 ° C, 94에서 이분 초기 변성 다음 ° C와 40 사이클 : 94 ° C 1 분, 1 분 56 ° C, 그리고에 대한 2 분 동안 68 ° C. 68에서 추가로 7 분 연신율은 ° C의 증폭을 마칩니다. 4. AI - 긍정적인 샘플에 대한 검사 및 젤에서 타겟 파편의 정화 <ol><li> 사전 심사 1 %의 ethidium의 브로마이드 (100 ML 젤 당 2.5μl) 물들일 1 % 아가로 오스 겔 (로체)에 2μl 배 로딩 염료 (BioRad)와 6μl 물과 혼합 PCR 제품의 2μl를로드합니다. </li><li> DNA 크기 표준 (BioRad EZ 하중 100 BP의 사다리)와 함께, 120V에서 1 시간 동안 젤을 실행, 겔 문서 시스템과 시각화. 그림 1의 예제를 참조하십시오. </li><li> 예상 크기 범위에서 증폭된 파편 (200 BP 300 BP (대상 조각은 244 BP)을 사이로 샘플을 선택합니다. 2 6μl 배 로딩 염색과이 후보의 전체 PCR 반응 볼륨을 (23μl를 ~ 중 왼쪽에 있습니다)로드 %의 ethidium의 브로마이드는 아가로 오스 겔을 스테인드 2 시간 동안 실행됩니다. </li><li> UV - transilluminator (Bioblock 과학)에 젤 장소와 시각 검사. 그림 2에서 예제를 참조하십시오. 개별 1.5 ML 반응 튜브에 메스와 배치로 젤에서 올바른 크기의 엑사이스 밴드. Zymoclean 젤 DNA 복구 키트 (Zymo 연구)와 예를 들어, 겔에서 조각을 정화. </li></ol> 5. 시퀀싱 및 PCR 제품 식별 <ol><li> ABI 빅 다이 3.1 화학 (응용 Biosystems)와 ABI 3730 모세관 시퀀서에 대한 인스턴스에 대한 대상 조각 생거 시퀀싱을 수행합니다. 포함된 10μl 권 시퀀싱 반응을 준비 10-20 NG 젤 - 정화 템플릿 cDNA, 1.75μl 배 희석 버퍼, 0.5μl 빅 다이 V3.1의 premix, 1 μl 앞으로 프라이머 (M52C 20, 10 ㎜)과 ddH2O 있습니다. 자전거 조건은 다음과 같습니다의 25주기에 의해 다음 1 분 초기 변성, : 96 10 S ° C, 45 ° C 60 4 분 5 S ° C. 정화 및 내부 프로토콜에 따라 순서 반응을 준비합니다. </li><li> 이러한 바이오 정보 (NCBI에 대한 국립 센터 BLAST와 같은 웹 기반 도구를 예를 들면 같은 GenBank23 같은 뉴클레오 티드 데이터베이스에 대한 cDNA 시퀀스를 발생 식별 <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. 대표 결과 : 맬러즈 (Anas platyrhynchos)는 2007 년 12 월에 Ottenby 버드 천문대에서 샘플링했다. 이 프로토콜에서 설명한대로 각 맬러드에서 FTA 카드의 샘플을 촬영했다. 배송 후, FTA 카드는 2 년간 -20 ° C에서 냉동실에 보관했다. 연구소의 동일한 FTA 카드 샘플 크라우스 외에 테스트 분리. 18은 긍정적인 제어뿐만 아니라 아홉 열배 시리얼 dilutions로 포함되었습니다. 마이너스 2 점 컨트롤) 빈 FTA 카드에서 추출, 구멍을 뚫는에서 - 이월있다면 테스트하고, nuclease 무료 물을 템플릿으로 사용어진 II) RT - PCR 반응, 오염 동안 발생한 경우 테스트, 아니면되었습니다 PCR 반응의 준비 인치 84 샘플을 분석했다. 다음 84 샘플의 PCR 제품의 겔 그림은 그림 1에서 찾을 수 있습니다. 자연 샘플 unspecific 밴드의 수많은이 선고를받은 여러 미생물 contaminations의 존재로 인해 볼 수 있습니다. 그러나, 뇌관의 쌍 대상 조각은 244 BP 깁니다. 약 올바른 크기 범위 (200 BP 300 BP 사이)에서 조각을 제작 샘플의 하위 집합의 전체 PCR 반응 볼륨 젤 (그림 1)에로드되었습니다. 겔에서 해고당한 밴드 중 일러스트는 보충 그림 1에서 찾을 수 있습니다. 긍정적인 컨트롤 이외에,이 샘플의 두 종류 (69899 및 69912) 새로운 프로토콜에 의해 긍정했다. 다른 모든 밴드가 가장 밀접하게 박테리아 시퀀스를 닮은, 혹은 전혀 읽을 수있는 순서를 양보 안하면서 NCBI 뉴클레오 티드 데이터베이스에 대해 BLAST 검색, AI 유전자 매트릭스 (그림 3)로 자신의 정체성을 공개했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" /> 그림 1. PCR 제품의 예비 심사의 젤 그림. 긍정적인 제어 2 μl PCR 제품, S긍정적인 컨트롤, 두 부정적인 컨트롤과 84 cloacal 샘플 에리얼 dilutions가로드되었습니다. 48 샘플은 아래쪽 패널에서 최고의 겔 패널, 48 샘플에 표시됩니다. 빨간색 화살표는 100 BP의 DNA 크기의 표준에 사용되는 겔 차선을 나타냅니다. 그림 들면, 빨간 동그라미가 예상 크기 범위에서 밴드를 보여줍니다. 블루 동그라미 unspecific amplicon (상단 왼쪽) 또는 크기 100 BP (하단 오른쪽) 아래 프라이머의 이합체의 인위를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" /> 그림 2. 200 BP 300 BP (대상 244 조각 BP) 사이의 밴드와 함께 올바른 크기의 범위에서 파편 샘플 선택. 샘플이 선택되었습니다. 녹색 화살표가 긍정적인 컨트롤을 나타냅니다 두 빨간색 화살표는 NCBI 뉴클레오 티드 데이터베이스에 자신의 cDNA 시퀀스를 비교하여 AIV 긍정적인 것으로 확인되었다 샘플을 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" /> 그림 3. NCBI에서 대표 BLAST 검색의 화면 캡처. excised 조각에서 얻은 cDNA 시퀀스 중 하나는 NCBI 웹사이트에서 뉴클레오 티드 데이터베이스에 대해 질의했다. 예제가 올바르게 AI 매트릭스 유전자 조각으로 식별됩니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">이 이미지의 전체 크기 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="보충 그림 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" /> 보충 그림 S1. 겔에서 excised 선택된 샘플의 밴드.이 사진은 200 BP 300 BP 사이의 후보 밴드 후에 그림 1에 묘사된 겔에서 찍은이 도려되었습니다.

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, 트래핑 취급 및 조류 샘플링하는 것은 국가의 법률에 따라 수행되었으며 농업과 연구 동물 윤리위원회의 스웨덴어위원회에 의해 승인되었습니다.

여기에서 설명한 프로토콜은 AIV의 존재를 faecal 또는 유사한 샘플을 화면으로 보충 방법을 제공합니다. 이것은 특히 샘플 수집 빠르고 쉽게하도록 설계되었습니다. 이렇게하면 같은 사냥꾼이나 야생 동물의 관리자로서 적은 훈련 명, AI 감시에 기여 할 수 있습니다. 가능한 샘플을 냉동 것은 권장하지만 아무도 시원한 체인은 적용할 필요가 없습니다. 실온의 며칠 예를 들어 실험실로 이송하는 동안, 카드 건조 남아만큼, FTA 카드에서 RNA 분자에 대한 문제가되지 않았습니다. 이러한 알코올 15 구아니딘 16로 현재 연구 공동체에 의해 평가하는 다른 비 냉각 저장 시스템은, 때문에 그들의 유해 자연의 특별 운송 계약이 필요합니다. 반면, FTA 카드 방식은 유해 물질의 전달을 요구하지 않습니다. 그러나, 이러한 측면에서 또 다른 흥미로운 저장 매체는 17도 위험이 아니라고 RNAlater ™입니다. 샘플 분석은 어떤 표준 분자 연구실에서 진행하실 수 있습니다. 일반적인 PCR 반응 및 모세관 배열 이외의 특별한 장비는 필요 없었습니다. 이미 샘플 컬렉션에있는 잠재적인 병원성 대리인이 FTA 카드의 항균 및 항바이러스 활동에 의해 inactivated 있었기 때문에 모든 단계 biosafety 수준없이 진행 될 수 있습니다. 교차 오염 및 그 이후의 거짓 긍정적인 표본은 야생 조류 샘플의 실험에서 관찰되지 않았습니다. 그러나, RNA 및 PCR 작업했을 때 사전 및 사후 PCR 단계 작업 장소와 별도의 객실을 청소 특별한주의를 지불하는 것이 좋습니다. 펌 후드에 근무하는 실험실에서 에어로졸 오염의 위험을 감소시킵니다. Pipetting 필터 팁을 진행해야합니다. 우리가 84 샘플의 여섯 전통 RealTime에 의해 RT - PCR 방법 24 RealTime을 RT - PCR에서 CT 값이 알려져있다 긍정적인 것을 알고있는 동일한 오리에서 동시에 촬영한 샘플에 대한 이전의 연구에서. CT 값 &lt;30 (바이러스 RNA의 높은 농도를 나타내는)했다 오리에서 우리의 방법의 줄기에 의해 감지 두 가지 긍정적인 샘플. 전통적인 프로토콜로 긍정적인하던 나머지 네 가지 예제&gt; 30 일 (이하 집중)와 우리의 프로토콜에 의해 감지되지 않았습니다 CT 값을했다. 상대적으로 높은 바이러스 titers만이 샘플의 분석에 긍정적인되었으며 그것은 방법의 감도는 모든 긍정적인 샘플을 감지하는 실패의 원인이라고 가능성이 높습니다. 또한, 현재 연구의 표본 크기가 매우 낮은 경우 더 많은 통제와 엄격한 실험을 수행하는 경우 메서드는 완전히 개발 및 평가 수 있습니다. 이 샘플은 원격 지역에서 수집했을 경우에는, 전통적인 분석이 전혀 불가능되지 않았을 것입니다. 또한 이러한 첫번째 결과 더 최적화가 필요 파일럿 실험에서 줄기. 샘플 수집 후 정기적으로 -20 ° C의 냉장고에서 2 년간의 저장 기간은 아마도 또한 바이러스 RNA의 품질에 영향을. inactivated 바이러스의 상온 저장을 상대할 때는이 가능한 RNA 저하가 중요한 문제입니다. 상기와 같은 다른 액체에 저장된 샘플은 바이러스 게놈 16 이상 펼쳐진 분석 영향을 크게 저하의 고통. 우리의 연구에 테스트하지 않지만, FTA 카드는 물론 조류 독감 바이러스 25, 26 매우 유사한 다른 RNA 시스템에 그대로 RNA 분자를 보존하기 위해 적합한 것으로 입증했습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약이나 악기의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 플라스틱 레이온 마른 면봉 </td><td> 코판, 이탈리아 </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> FTA 카드 </td><td> 워트 먼지 </td><td></td><td> 몇 가지 옵션을 </td></tr><tr><td> 매트와 해리스 마이크로 펀치 2mm </td><td> 워트 먼지 </td><td> 1,154,409 </td><td></td></tr><tr><td> RNase 무료 96well 플레이트 </td><td> 그라 이너 바이오 원 </td><td> 652290 </td><td> 또는 유사한 </td></tr><tr><td> 김 정밀 쳐줍니다 </td><td> Kimtech </td><td> 75,512 </td><td></td></tr><tr><td> RNA 빠른 추출 솔루션 </td><td> 앰비온 </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMAX - 96 바이러스성 격리 키트 </td><td> 앰비온 </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> 원 - 스텝 RT - PCR 교통 시스템 </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> 또는 유사한 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 MP </td><td> 로체 </td><td> 1388991001 </td><td> 다목적 아가로 오스 </td></tr><tr><td> 배 로딩 버퍼 </td><td> BioRad </td><td></td><td> DNA 사다리와 함께 배달 </td></tr><tr><td> EZ 하중 100 BP 사다리 </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> 또는 유사한 </td></tr><tr><td> Ethidium 브로마이드 1퍼센트 </td><td> Fluka </td><td> 46,067 </td><td> 또는 유사한 </td></tr><tr><td> 1.5ml 반응 튜브 </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> 또는 유사한 </td></tr><tr><td> Zymoclean 젤 DNA 회복 키트 </td><td> Zymo 연구 </td><td> D4001 </td><td> 또는 유사한 </td></tr><tr><td> ABI 큰 염료 3.1 화학 </td><td> 응용 Biosystems </td><td></td><td> 또는 유사한 </td></tr></tbody></table>

avian influenza surveillance with fta  cards: field methods, biosafety, and transportation issues solved

조류 독감 바이러스 (AIVs)는 인간이 하나 등 많은 포유 동물을 감염. 이러한 AIVs 거의 모든 가능한 바이러스 subtypes 2 품고 그들의 자연적인 호스트로 다양합니다. 독감의 인간 전염병은 원래 AIVs 3 줄기. 최근에 H5N1 발생하는 동안 많은 치명적인 인간의 환자가보고되었다. 최근, 새로운 AIV 관련 변종은 &#39;신종 인플루엔자의 유행&#39;4 유발, 인간의 인구를 휩쓸고. 인간의 무역과 운송 활동이 높은 병원성 종자 5의 확산에 대한 책임 것으로 보인다 있지만, 분산도 일부 야생 조류 6, 7에 의한 수 있습니다. 그러나 모든 AIV 종자의 실제 저수지 야생 조류입니다. 이것과 가금류 산업에 심각한 상업적인 손실의 얼굴에 대한 반응으로, 대형 감시 프로그램은 AIVs의 생태에 대한 정보를 수집하고, 특정 고도의 병원성 변종 8-12을 감지하는 조기 경보 시스템을 설치하는 세계적으로 구현되었습니다. 전통 virological 방법은 바이러스가 온전하고 분석하기 전에 재배가 필요합니다. 이것은 깊은 냉동고 및 수송 동안에있을 무거운 biosafety 절차와 엄격한 감기에 사슬을 요구. 장기 감시 따라서 일반적으로 잘 갖추어진 실험실에 가까운 몇 가지 필드 방송국에 제한됩니다. logistically 성가신 절차를 구현하지 않는 원격 영역은 샘플 수 없습니다. 이러한 문제는 13 인정, 14, 대체 저장소 및 운송 전략의 사용 (알콜이나 구아니딘) 15-17를 조사하고 있습니다. 최근 크라우스 외. 18 특수 여과지에 따라 수집하는 방법, 저장 및 전송 AIV 샘플을 소개했다. FTA 카드 19 건조 저장 기준 20 RNA를 보존 및 연락처 21시 비활성 병원균을 렌더링합니다. 이 연구는 FTA 카드 리버스 전사 PCR과 결과 cDNA가 합성 및 바이러스 유전자와 결정 될 수 AIV RNA를 감지하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났다. AIV가 사용되었고, 샘플 개별적으로 처리했는지 크라우스 외. 18 연구에서는 실험실 격리. 여기에 제시 확장에 Ottenby 버드 천문대 (SE 스웨덴)에서 오리 트랩에서 야생 조류에서 faecal 샘플은 현장 조건에 따라 방법의 유용성을 설명하기 위해 직접 테스트했다. cloacal 면봉으로 오리 및 샘플 수집 잡는 것은 증명합니다. 현재 프로토콜은 하나의 튜브 처리에서 96 잘 설계 작업 흐름의 최대 - 스케일링을 포함합니다. 전통적인 방법보다 민감하지만, FTA 카드의 방법은 대형 감시 제도에 대한 훌륭한 보완을 제공합니다. 그것은 알코올이나 구아니딘 같은 위험한 시약의 운송과 관련하여 시원한 체인 또는 안전 규정을 유지하기 위해 필요없이 어디서나 세계에서 샘플의 수집과 분석이 가능합니다.

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Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

조류 독감 바이러스의 RNA를 보존 감지하고 순서 방법 확인과 조류의 자연 faecal 샘플을 사용하여 확장되었습니다. 이 기술은 시원한 체인 및 전염성 바이러스의 취급을 유지의 필요성을 제거하고 96 - 웰 높은 처리량 설치에 적용할 수 있습니다.

조류 FTA 카드 인플루엔자 감시 : 필드 방법, Biosafety, 그리고 교통 문제 해결

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

avian-influenza-surveillance-with-fta-cards-field-methods-biosafety

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K 조회수.  Wageningen University. 조류 독감 바이러스의 RNA를 보존 감지하고 순서 방법 확인과 조류의 자연 faecal 샘플을 사용하여 확장되었습니다. 이 기술은 시원한 체인 및 전염성 바이러스의 취급을 유지의 필요성을 제거하고 96 - 웰 높은 처리량 설치에 적용할 수 있습니다.

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Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

연구

면역학 및 감염병학

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Tetracistronic Minigenomes를 포함하는 바이러스 입자와 바이오 안전성 수준이 조건에서 에볼라 바이러스의 수명주기를 모델링

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

인간 백신 닭 계란에 인플루엔자 바이러스 전파

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질과 마우스 MX1 단백질의 공동 면역 침전

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.