Queremos agradecer a los fondos de puesta en marcha de la Wayne State University (MJA), una beca de la Fundación Americana para la Investigación del Envejecimiento (SMV), y una vía para el Premio de Transición de Carrera de la Independencia (R00EB007129) del Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería del Instituto Nacional de la Salud (MJA).

1. Metalación con LnCl tres sales <ol><li> Disolver el ligando en el agua para producir una solución de 30 a 265 mM. El ligando 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-ácido dietilentriamina pentaacético (p-SCN-BN-DTPA) se utilizó en este video a una concentración de 73 mM. </li><li> Ajustar el pH de la solución de ligando a entre 5,5 y 7,0 mediante la adición de 1 M de NH 4 OH. En este video, 0,2 ml de la 1 M NH 4 OH solución se utilizó. </li><li> Disolver 2.1 equivalentes de LnCl 3 en el agua para producir una solución con una concentración de 5-1000 mM. En este video, EuCl 3 y GdCl 3 fueron utilizados en concentraciones de 111 mm. Un exceso de metal se utiliza a menudo para impulsar el metalación hasta el final y por lo tanto simplificar la purificación. </li><li> Añadir la solución de LnCl 3 a la solución de ligando mientras se agita. </li><li> Después de la adición de LnCl 3, ajustar el pH de la mezcla de reacción a entre 5,5 y 7,0 mediante la adición de 0,2 M de NH 4 OH. Un total de 0,5 ml de 0,2 M de NH 4 OH solución se utilizó en este video. Si su ligando contiene sensibles a los ácidos grupos funcionales, ajustar los tiempos de pH múltiples durante este paso. ATENCIÓN - Si la solución se vuelve demasiado básico, cualquier base funcional de los grupos más sensibles, como el isotiocianato, serán inutilizados para la conjugación. </li><li> Monitor de la reacción a través de mediciones de pH. La reacción se completa cuando el pH se mantiene constante. </li></ol> 2. El aumento de pH diagnóstico diferencial (no incluido en este video, pero bueno para ligandos sin base sensible a los grupos funcionales) <ol><li> Añadir NH4OH concentrado a la mezcla de reacción para ajustar el pH de ≥ 11. Este paso se precipitan los metales no acomplejada como el hidróxido insoluble. </li><li> Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micras. Si la mezcla de reacción obstruye el filtro, la centrifugación y la decantación antes del filtrado se recomienda. </li><li> Si la diálisis no se realizará, eliminar el disolvente a presión reducida (evaporación giratoria o liofilización es recomendado). </li><li> Pasos 2.1-2.3 se puede repetir si lantánidos libre queda. </li></ol> 3. Diagnóstico diferencial de diálisis <ol><li> Corte el tubo de diálisis a una longitud apropiada (siga las instrucciones del fabricante) para mantener el volumen de la muestra, dejando una longitud extra (aproximadamente el 10% del volumen de muestra). En este vídeo, un 100-500 dalton de peso molecular de corte (MWCO) de la membrana se utilizó, pero más grandes tubos MWCO se puede utilizar en su caso, si la conjugación se realiza antes de metalación. Además, cassettes de diálisis se puede utilizar como una alternativa a los tubos de diálisis si lo desea. </li><li> En su caso sobre la base de las indicaciones del fabricante, disfrutar del tubo de diálisis en el corte de agua durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Llenar un depósito de diálisis (un vaso de 1 litro se usó en el video) con agua (líquido de diálisis). El volumen de líquido de diálisis debe ser aproximadamente 100 veces la de la muestra. </li><li> Dobla un extremo del tubo dos veces y seguro de la parte doblada del tubo con una abrazadera de cierre de la diálisis. Envuelva el extremo del cierre con una banda elástica para asegurarse de que permanece cerrada durante la diálisis. </li><li> Filtrar la mezcla de reacción a través de un filtro de 0,2 micras, y la carga del filtrado en el extremo abierto del tubo con cuidado de no romper la tubería. Asegúrese de dejar espacio en la cabeza lo suficiente para cerrar el tubo. </li><li> Doble el otro extremo abierto del tubo dos veces, con un cierre de seguridad, y envolver el cierre con una banda elástica en el paso 3.4. </li><li> Coloque un frasco de vidrio que contiene aire a la pinza en un extremo del tubo de diálisis con una goma elástica. Coloque un frasco que contiene la arena a la otra pinza. Estos viales asegurar que la tubería se queda sumergido en el líquido de diálisis. </li><li> Coloque la tubería completa en el embalse de diálisis que contiene líquido de diálisis. </li><li> Revuelva el líquido de diálisis con una placa de agitación magnética a una velocidad lenta (no vortex) a temperatura ambiente. </li><li> Cambiar el líquido de diálisis 3 veces en el transcurso de un día (en este video, el dializado se cambió a 2.5, 6.5 y 11.5 h), y luego permitir que la diálisis para seguir toda la noche (para un total de 20 a 28 h de diálisis). </li><li> Retire el tubo de diálisis de la solución de diálisis y abra cuidadosamente un cierre para extraer la muestra. Lave el tubo de diálisis 3 veces con agua y combinar los lavados con la muestra. </li><li> Eliminar el agua a presión reducida. La liofilización se utiliza en este video. </li></ol> 4. Evaluación de la presencia de metal libre <ol><li> Se disuelve el complejo metálico en tampón de acetato (preparación de buffer: Disolver 1,4 ml de ácido acético en 400 ml de agua, ajustar el pH a 5.8 con 1 M de NH 4 OH, y añadir agua para producir un volumen total de 500 ml) y añadir el xilenol indicador en naranja (16 mM de pH 5,8 buffer). En este video, 0,3 mg de complejo se disolvió en 0,3 ml de solución tampón y 3 ml de solución indicadora añadió. </li><li>Detectar la presencia de metales gratuita a través de la observación de un cambio de color del indicador de amarillo a violeta. </li><li> Si lo desea, la cantidad de metal libre se puede cuantificar mediante la creación de una curva de calibración 1. Por otra parte, el tinte arsenazo III se puede utilizar en lugar de xilenol naranja 2. Si se mantiene libre de metales, la muestra debe ser purificado mediante diálisis, una columna de la desalación, o de alto rendimiento de cromatografía líquida (HPLC) antes de la caracterización. </li></ol> 5. Determinación del número de coordinación de agua (q) <ol><li> Prepare una solución de la Eu-III que contiene complejo (~ 1 mm) en H 2 O y la otra solución de la misma concentración de D 2 O. Antes del análisis, la solución de D 2 O se evapora y se disuelve en D 2 O tres veces para eliminar los restos de H 2 O. </li><li> Añadir la solución de agua con una cubeta limpia y coloque la cubeta en un espectrofluorómetro. </li><li> Realizar análisis de excitación y emisión para determinar los valores máximos para cada uno (~ 395 nm y 595 nm ~, respectivamente). </li><li> Realizar una fosforescencia tiempo de desintegración experimento utilizando los siguientes parámetros: longitud de onda de excitación y de emisión establecidos en el paso 5.3, la excitación y la anchura de corte de emisiones (5 nm), flash cuenta (100), el retraso inicial (0,01 ms), tiempo máximo (13 ms) , y el retraso del crecimiento (0,1 ms). Estas condiciones son las adecuadas para la mayoría de los complejos, pero la demora máxima y los valores de incremento puede ser aumentado o disminuido para las especies con tiempos de decaimiento muy largas o cortas en extremo. </li><li> Repita el paso 5.4 con la solución de D 2 O preparada en la etapa 5.1. </li><li> De los datos de la decadencia luminiscencia obtenido en 5.4 y 5.5, el argumento del logaritmo natural de intensidad en función del tiempo. La pendiente de estas líneas son las tasas de decaimiento (τ -1) (Figura 2). En este video, Microsoft Excel 2007 se utilizó para generar las parcelas logaritmo natural de los datos en bruto. Utilizar los tipos de deterioro en la ecuación desarrollada por Horrocks y compañeros de trabajo (eq 1) 3. Si su ligando contiene grupos OH o NH coordinado al metal, entonces la ecuación debe ser modificada antes de su uso 3. </li></ol> la ecuación 1: <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="La ecuación 1" /> 6. Mediciones de relajación <ol><li> Seleccionar el modo de aplicación deseada en el analizador de tiempo de relajación: T 1 (tiempo de relajación longitudinal) o T 2 (tiempo de relajación transversal). </li><li> Prepare una serie de muestras que contienen diferentes concentraciones de D-os-III que contiene complejos en un disolvente acuoso. En este vídeo, el agua se utiliza como disolvente y soluciones de 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 y 0 mM se prepararon. Otros solventes acuosos o tampones podría ser utilizado, pero es importante utilizar el disolvente como el espacio en blanco. El volumen final de la muestra es específica para el instrumento que se utiliza. </li><li> Coloque una muestra en el instrumento y dejar reposar durante 5 minutos para que se equilibre a la temperatura del instrumento (37 ° C en este video). </li><li> Determinar el tiempo de relajación (en unidades de s) mediante el ajuste de los parámetros del software para obtener una curva suave exponencial de T 1 o T 2 (curvas representante de T 1 y T 2 se muestran en la Figura 3). </li><li> Repita los pasos 6.3 y 6.4 para todas las muestras, incluyendo el espacio en blanco. </li><li> Calcular la inversa de la medida T 1 o T 2 valores en unidades de s-1. </li><li> Parcela T 1 o T -1 2 -1 frente a Di-s los valores de concentración III (en unidades de mm). Debido a la naturaleza higroscópica de Di-s III complejos que contienen, confirmar la concentración de Di-s III con espectrofotometría de absorción atómica o acoplado inductivamente espectrometría de masas de plasma. Ajustar la parcela con una línea recta. Un diagrama representativo se muestra en la Figura 4. </li><li> La pendiente de la línea de ajuste es la capacidad de relajación (R 1 o R 2 para T 1 y T 2, respectivamente), y tiene unidades de mM -1 s -1. </li></ol> 7. Resultados representante Los datos representativos de los pasos de este protocolo se han incluido en las Tablas y Figuras sección. Además de la cantidad de agua-la coordinación y la caracterización de relajación descritos en el protocolo, es importante para caracterizar los productos finales usando técnicas estándar químico. La identidad de los compuestos se pueden obtener utilizando la espectrometría de masas, y los espectros de masas representativa que muestra los patrones de isótopos para el diagnóstico de Di-s III - Eu y III que contienen complejos se muestran en la Figura 5. Además, para los no-Gd III </sa&gt; lantánidos complejos que contienen, la espectroscopia de RMN puede ser utilizado para la identificación del producto. Para la caracterización de la pureza del complejo, HPLC o análisis elemental o ambos pueden ser utilizados. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Esquema general de metalación y purificación:. Esquema que muestra el procedimiento general para metalación y las razones para la elección de las diferentes vías de purificación. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 luminiscencia intensidad parcela:. Trama Representante del logaritmo natural de intensidad en función del tiempo de la sección 5. Las pendientes de las líneas generadas a partir de curvas similares adquiridos por el agua y las soluciones de D 2 O se utilizan con la ecuación 1 para caracterizar el número agua coordinación de Eu-III que contienen complejos. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3 Relajación curvas tiempo de caída:. Representante de los datos (izquierda) y T 1 (derecha) la adquisición de T 2. Las desviaciones de estas formas de curva se produce datos confiables. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4 determinación relaxividad:. Un representante de la parcela 1 / T 1 frente a la concentración de Di-s III. La pendiente de la línea de ajuste es de relajación y tiene unidades de mM -1 s -1. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5 Los espectros de masas:. Representante espectros de masas que muestra los patrones de isótopos para el diagnóstico de (izquierda), Di-s que contienen los complejos III y (derecha) de la UE III complejos que contienen. El negro picos de Gauss representan la distribución de isótopos teóricos y las líneas rojas son los datos reales.

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paramagnetic+metal+complexes+as+water+proton+relaxation+agents+for+NMR+imaging:+theory+and+design.">Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design.</a> Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).</li><li>Yoo, B., Pagel, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+responsive+MRI+contrast+agents+for+molecular+imaging.">An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging.</a> Front. 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Dado el creciente número de publicaciones que incluyen lantánidos basado en 04.14 agentes de contraste, es importante que se tenga cuidado en la preparación, purificación y caracterización de los productos para garantizar resultados reproducibles y comparables. Estos complejos son a menudo considerados un desafío para purificar y caracterizar con respecto a las moléculas orgánicas, debido a su naturaleza paramagnética y la sensibilidad de los grupos funcionales que podrían ser utilizados para biocon...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivos y Equipos </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> EuCl 3 • 6H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203.254-5G </td></tr><tr><td> p-SCN-BN-DTPA </td><td> Macrocyclics </td><td> B-305 </td></tr><tr><td> de hidróxido de amonio </td><td> EMD </td><td> AX1303-3 </td></tr><tr><td> Spectra / Por la biotecnología de éster de celulosa (CE) membrana de diálisis - 500 D MWCO </td><td> Fisher Scientific </td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td> Millipore Millex IC-LG Filtro de unidades </td><td> Fisher Scientific </td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td> xilenol naranja sal tetrasódica </td><td> Alfa Aesar </td><td> 41379 </td></tr><tr><td> ácido acético </td><td> Fluka </td><td> 49199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Isótopos Cambridge Laboratories, Inc. </td><td> DLM-4-25 </td></tr><tr><td> purificador de agua </td><td> ELGA </td><td> PURELAB ultra </td></tr><tr><td> de alto rendimiento cromatografía líquida y espectrometría de masas </td><td> Shimadzu </td><td> LCMS-2010EV </td></tr><tr><td> analizador en tiempo de relajación </td><td> Bruker </td><td> mq60 Minispec </td></tr><tr><td> Espectrofotómetro UV-VIS </td><td> Fisher Scientific </td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td> liofilizador </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> pH metro </td><td> Hanna Instruments </td><td> HI 221 </td></tr><tr><td> espectrofluorómetro </td><td> HORIBA Jobin Yvon </td><td> FluoroMax-4 </td></tr><tr><td> Calculadora de peso molecular versión 6.46 por Matthew Monroe, descargado 17 de octubre 2009 </td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td> Calculadora de peso molecular </td></tr></tbody></table>

preparation, purification, and characterization of lanthanide complexes for use as contrast agents for magnetic resonance imaging

Polyaminopolycarboxylate basada en ligandos se utilizan habitualmente para quelar iones lantánidos, y los complejos resultantes son útiles como agentes de contraste para resonancia magnética (MRI). Muchos ligandos disponibles en el mercado son especialmente útiles debido a que contienen grupos funcionales que permiten la rápida y de alta pureza, y de alto rendimiento, la conjugación de macromoléculas y biomoléculas a través de amina reactiva ésteres activados y los grupos isocianato o maleimides tiol reactivos. Mientras metalación de estos ligandos se considera de conocimiento común en el campo de la química bioconjugation, las sutiles diferencias en los procedimientos de metalación hay que tener en cuenta a la hora de seleccionar los materiales metálicos de partida. Además, múltiples opciones para la purificación y caracterización de existir, y la selección del procedimiento más eficaz depende en parte de la selección de los materiales de partida. Estas diferencias sutiles son a menudo descuidado en los protocolos publicados. Aquí, nuestro objetivo es demostrar los métodos comunes para metalación, purificación y caracterización de los complejos de lantánido que se pueden utilizar como agentes de contraste para resonancia magnética (Figura 1). Esperamos que esta publicación permitirá a los científicos biomédicos para incorporar las reacciones de complejos de lantánidos en su repertorio de reacciones comúnmente utilizados por facilitar la selección de materias primas y métodos de purificación.

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Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Se demuestra la metalación, purificación y caracterización de los complejos de lantánidos. Los complejos descritos aquí pueden ser conjugados a las macromoléculas para permitir el seguimiento de estas moléculas por medio de resonancia magnética.

Preparación, purificación y caracterización de los complejos lantánidos para el uso de agentes de contraste para resonancia magnética

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

preparation-purification-characterization-lanthanide-complexes-for

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Biology

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