Los autores desean agradecer a Eva Hadzimova, Mattar Pierre y Kovach Christopher por su trabajo inicial en el establecimiento en la tecnología de electroporación in utero en el laboratorio de CS. Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) subvención (44.094 MOP) y CIHR / Fundación Fighting Blindness (FFB) Nuevas equipo de Grant (00933-000) a CS y el Hospital de Niños de Alberta una beca de la Fundación de Investigación de DMK. RD fue apoyado por una beca HOPE CIHR Canadá, RC se apoya en una Beca FFB y LML fue apoyado por una beca de formación CIHR en Genética y Desarrollo Infantil.

1. Set-up <ol><li> Set-up área quirúrgica, como se muestra en la figura. 1A, A &#39;. Los componentes clave de la puesta en marcha incluye un Eppendorf FemtoJet microinyector, micromanipulador Narishige con porta-agujas, steromicroscope Leica, sistema de iluminación por fibra óptica, sistema de ECM 830 electroporación Plaza de la onda con electrodos, una almohadilla eléctrica y un vaporizador de isoflurano anestesia. </li><li> Limpie todas las herramientas con un limpiador ultrasónico con Bransonic Metriclean2 solución de baja espuma para ultrasonidos instrumentos quirúrgicos. Esterilizar instrumentos en autoclave. Herramientas esterilizadas luego se guardan en Germex. </li><li> Preparar jeringas con solución salina tibia estéril y estéril solución de Ringer lactato. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Lugar de los animales dentro de una pequeña (12cm x 20cm) cámara de anestesia. El uso de un vaporizador, entrega 5% anestésico isoflurano y oxígeno a 1L/min (Fig. 1A, A &#39;). En particular, es importante recoger escape isoflurano mediante un sistema de depuración. </li><li> Eliminar los animales de la cámara cuando la respiración se vuelve profunda y regular. Pellizcar los dedos y las pruebas de visión reflejo de parpadeo se utilizan para garantizar la anestesia total. </li><li> Lugar del ratón embarazadas en su espalda en la parte superior de una almohadilla térmica (37 ° C). El cojín de la calefacción por primera vez esterilizados mediante limpieza con etanol al 70%, y luego se cubre con una esterilizada, gasa sin pelusa. Use un tubo respirador y un aparato para entregar la máscara de isoflurano (2,25%) durante la cirugía. </li><li> Inyectar la buprenorfina (0.1mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea en la piel de la nuca. </li><li> Monitor de animales a lo largo de la cirugía para la respiración profunda y regular. El animal no debe aliento, respirar profundamente o rápidamente. Respiración rápida y superficial puede ser un signo de la anestesia ligera, y el flujo de isoflurano debería incrementarse. Si el animal empieza a jadear, reducir el flujo de isoflurano. En el caso de un paro respiratorio, apague el isoflurano, y aumentar el flujo de oxígeno hasta el animal se recupera. Reinicie el isoflurano a una concentración menor. </li></ol> 3. Animal preparación para la cirugía <ol><li> Tape las extremidades anteriores del animal a la almohadilla y revisar una vez más la respuesta de retracción por pellizcar la pata trasera con una pinza roma. </li><li> El uso de un bastoncillo de algodón estéril, extender una capa gruesa de crema depilatoria (es decir, Nair) en el abdomen. En trazos firmes, garantizar el pelaje está completamente recubierto. Dejar actuar durante una media de tres minutos, comprobando de forma intermitente con una gasa estéril limpia para eliminar el vello. Moje una gasa estéril con agua estéril y limpie el abdomen hasta que todos los restos se han ido. Repita con clorhexidina (es decir, Stanhexidine) piel más limpia y más agua. Seque el abdomen con una gasa limpia y estéril. </li><li> Esterilizar sitio de la incisión con una solución de clorhexidina (es decir, Stanhexidine), seguida de más agua estéril. Seque el abdomen con una gasa limpia y estéril. Repita este paso con etanol al 70% y un hisopo de frescos, esterilizados de algodón. </li><li> Colocar una gasa estéril sobre el abdomen con un corte en el medio a través del cual los cuernos uterinos se retiró durante la cirugía. </li></ol> 4. Incisión y exposición de cuernos uterinos <ol><li> Para exponer los cuernos uterinos, primero busque la línea alba como la tenue línea debajo de la piel en la línea media. El uso de pinzas, tire de la piel de la pared abdominal y el corte de una pequeña incisión, directamente desde el abdomen hacia abajo, a mediados de la piel con unas tijeras (aproximadamente 1 cm de longitud). </li><li> El uso de pinzas y tijeras curvas, repita el proceso con el peritoneo. </li><li> Coloque una gasa estéril con una pequeña incisión vertical sobre la incisión y humedecer con solución salina estéril calentada. </li><li> Diapositivas pinza en la incisión y localizar el útero. Mantenga la incisión abierta con pinzas, mientras que la eliminación de los cuernos uterinos. </li><li> Sujete cuidadosamente el útero entre los embriones visible primera y segunda y tire de los embriones en la gasa. Retire los dos lados de los cuernos uterinos, poniendo sobre la gasa estéril y contar el número de embriones, tomando nota de cualquier resorción o &quot;insalubres&quot; de los embriones (por ejemplo, un tamaño más pequeño del cuerpo). Húmedos los cuernos uterinos con solución salina y con cuidado devolver la mitad del útero en el abdomen. </li></ol> 5. La inyección de ADN en los ventrículos <ol><li> Las agujas quirúrgicas están preparados con un extractor Sutter Micropipetas Flaming utilizando pipetas de borosilicato con capilares (Programa: calor = 750, = 30 Tire, Vel = 90, hora = 150). Usando una hoja de bisturí estéril, la punta de la aguja suavemente afeitado en un ángulo de 45 grados. </li><li> Para cargar la aguja, pipetas Pasteur se tira a un diámetro estrecho en una llama. La boca se adjunta a la pipeta de carga para elaborar unos 10 l de 3mg/ml libre de endotoxinas ADN mezclado con verde de metilo 0,01% (nota: verde de metilo tinte permite inyecciones de ADN para ser visualizado). La aguja llena se monta en un soporte micromanipulador y unido a la inyección FemtoJet. </li><li> Comenzando con el embrión más cercano al ovario, circular con fórcepsse utilizan para activar suavemente el embrión dentro de la decidua por lo que se coloca &quot;cara a seguir&quot;, permitiendo que las inyecciones que se produzca en un rostral a la dirección del caudal. Una fuente de luz de fibra óptica para la iluminación se utiliza para ayudar a visualizar la línea media del cerebro embrionario, que está flanqueada por los ventrículos laterales grandes en las regiones rostral (Fig. 1B, B &#39;). </li><li> El embrión se mantiene en posición con las pinzas circular. La aguja se coloca por encima del útero para que el ángulo de entrada en el cerebro es de aproximadamente 45 grados. Utilizando el micromanipulador, y un movimiento rápido y constante, la punta de la aguja se inserta a través de la pared uterina y en el ventrículo lateral del embrión. Las inyecciones se dirigen hacia los ventrículos laterales, tercero ventrículo o espacio subretiniano para apuntar el telencéfalo, diencéfalo y la retina, respectivamente. Tenga en cuenta que las vesículas cerebrales embrionarias están abiertas en las primeras etapas embrionarias de tal manera que el ADN inyectado en los ventrículos laterales fluye hacia el ventrículo 3 º. </li><li> Presione el pedal para inyectar la endotoxina libre de ADN (1-3 l) utilizando un Eppendorf FemtoJet microinyector. Una inyección de éxito es fácil de visualizar por la difusión del colorante verde de metilo a través de los ventrículos del cerebro embrionario. La aguja se retira lentamente dibujando una copia de seguridad para evitar roturas. </li></ol> 6. Electroporación <ol><li> El embrión inyectado (aún dentro del útero) se coloca en la gasa estéril que cubre el abdomen de la madre y mojado a fondo con solución salina caliente. Tenga en cuenta ** La adición de solución salina a la superficie de la membrana es esencial para permitir el paso eficiente de una corriente eléctrica. </li><li> GenePaddle electrodos se utilizan para sujetar el útero después de la inyección de ADN. Cinco pulsos cuadrados eléctrico de 40-50V y 50 ms se entregan a una velocidad de un pulso por segundo utilizando un sistema de electroporación ECM8300 BTX (Fig. 1C, C &#39;). </li><li> Cubrir el embrión inyectado / electroporated con una gasa húmeda de protección y continuar con el embrión que viene. </li><li> Al término de la inyección / electroporación de todos los embriones deseada, empuje con cuidado los cuernos uterinos en el abdomen (Fig. 1D). </li><li> Retire con cuidado el cuerno uterino y empiezan de nuevo con el embrión más cercana al ovario. </li></ol> 7. Sutura y grapas <ol><li> Una vez que todos los embriones están de vuelta en el interior del útero, se suman a la cavidad abdominal ~ 2.3 ml de solución salina caliente. </li><li> Para cerrar la herida, comenzar por la eliminación de la gasa en el abdomen y la identificación de los lados del peritoneo. Comenzar la sutura del peritoneo mediante la línea de negro de seda trenzada. No se recomienda el uso de sutura absorbible para este procedimiento ya que suele ser más débil y puede dar lugar a sangrado posquirúrgico y la infección. Anclar la línea en el peritoneo cercano al esternón y proceder a punto de distancia del ancla. Asegúrese de que todas las suturas son muy ajustados, y que no hay órganos subyacentes o la piel ha sido sin querer cosido en el peritoneo. Clip de la línea de sutura restante y desechar. </li><li> Estire la piel se cerró sobre la línea de sutura con las pinzas. Por medio de 9 mm Reflex ™ piel cierre grapas, clips de la piel sobre la herida, teniendo cuidado de no básicos por debajo de la línea de sutura, o para tirar de la piel demasiado fuerte. El método preferido es el de mantener la piel y del cuerpo con pinzas, y vienen en un ángulo de 90 grados con la herramienta de primera necesidad. Continúe hasta que la herida está cerrada (aproximadamente tres grapas). Una vez terminado, asegúrese de grapas estén bien apretados presionando suavemente con la herramienta de sutura (Fig. 1D). </li></ol> 8. Atención postquirúrgica <ol><li> Para supervisar la recuperación anestésica, a su vez las mujeres sobre su estómago y apagar el isoflurano. Mantener la cara del animal en el interior del aparato respiratorio, a su vez de oxígeno hasta el 3% para ayudar a la recuperación de la anestesia. El animal debe ser colocado en una gasa limpia y seca en la parte superior de la almohadilla de calefacción para evitar la hipotermia. </li><li> Mientras el animal está aturdido, se inyectan 2 ml de solución de Ringer por vía subcutánea en la piel del cuello del animal. </li><li> Continúe sosteniendo el animal en el flujo de oxígeno durante varios minutos y las almohadillas de gasa calentamiento con el fin de despertar a los animales. Períodos cortos de movimiento de los animales deben ser observados, ya que regresa a un patrón de respiración normal. Observar durante varios minutos hasta que los animales parece consciente y despierto. </li><li> Rocíe el abdomen de la hembra con gentamicina spray y envolver al animal en una gasa estéril. </li><li> Transferencia del animal en una jaula estéril con ropa de cama en autoclave y la vivienda de cartón. </li><li> Botellas de agua deben ser limpiados, esterilizados y con agua estéril. A 500 ml de agua se añaden 2 ml de antibiótico sulfametazina (25% de acciones). </li><li> Administrar 0,05 mg / kg por vía subcutánea de la buprenorfina después de la cirugía por la mañana. </li><li> Monitor de la hembra cerca de las primeras 24 horas después de la cirugía. Si los animales se mantienen más de 24 horas, las mujeres se trasladan a nuevas sterile jaulas en el día 2. </li></ol> 9. Resultados representante Neocórtex El neocórtex es la región del sistema nervioso central que es responsable de visuales y el procesamiento sensorio y mayor funcionamiento cognitivo. Está compuesto por neuronas de proyección glutamatérgica y interneuronas GABAérgicas que se derivan de el telencéfalo ventral y dorsal, respectivamente. Para hacer frente a los roles de diferentes genes en el desarrollo de la neocorteza, que utilizamos en la electroporación in utero a cualquiera misexpress o bloquear la expresión (es decir, a través del uso de las construcciones shRNA) de diferentes genes en el dorsal o ventral telencéfalo 1,3,4. Para misexpress genes en el telencéfalo embrionario, se utiliza un vector de expresión bicistrónico (pCIG2), que contiene un promotor de CMV-βactin potenciador y un sitio interno de entrada de ribosomas (IRES), una mayor proteína verde fluorescente (EGFP, en pCIG2) cassette, lo que permite transfectadas las células para ser detectados por epifluorescencia (Fig. 2A-C). Se utilizó esta tecnología para introducir las construcciones de expresión en el telencéfalo de E11.5 a E15.5 (datos mostrados son en E12.5;. Fig. 2). Al permitir que los embriones para desarrollar varios días después de la electroporación, que son capaces de rastrear la diferenciación y la migración de las buenas prácticas agrarias con etiqueta progenitores. A medida que avanza la diferenciación, 3 días después de la electroporación GFP + células se diferencian y migran fuera de la zona ventricular (VZ), la zona subventricular (SVZ) y zona intermedia (iz) y en la placa cortical (cp;. Fig. 2C). Si los cerebros electroporated en E12.5 se analizan después de 24 horas, podemos monitorear eventos anteriores en la maduración de progenitor y la migración neuronal por la co-etiquetado con marcadores de células progenitoras apical (es decir, Pax6;. Fig. 2A), los progenitores basal (es decir, Tbr2; . Fig. 2B) y postmitóticas neuronas neocortical (es decir, Tbr1;. Fig. 2C). Diencéfalo El hipotálamo está en la base ventral del sistema nervioso central y funciona como una puerta de enlace entre el sistema endocrino y el sistema nervioso autónomo. Durante el desarrollo, los múltiples núcleos que forman el hipotálamo madura diferenciarse de una zona progenitor común que las líneas de la región ventral-la mayor parte del diencéfalo embrionario. En la actualidad, las vías moleculares que regulan la proliferación de células progenitoras, la diferenciación neuronal y la formación de núcleos hipotalámicos son poco conocidos. Hemos utilizado en la electroporación in utero al objetivo de la expresión del gen de diencéfalo embrionario mediante la inyección de ADN en el ventrículo 3 º de la E12 embryos.We luego siguió la distribución de las buenas prácticas agrarias en la diferenciación de las neuronas en el E14. Con esta metodología, hemos logrado poner en la expresión de GFP en el tálamo, el pre-tálamo y el hipotálamo (Fig. 3). El análisis de las secciones coronal revela que hemos abordado con éxito la expresión de GFP en las células progenitoras que la línea de la zona ventricular del ventrículo 3 y las neuronas que migran a la zona del manto para formar núcleos (Fig. 3B) Retina La retina es la capa de nervios del ojo, responsable de convertir los fotones de luz en impulsos eléctricos transmitidos al cerebro. Se desarrolla como una evaginación del diencéfalo embrionario, y por lo tanto, se deriva del tubo neural. La retina neural se desarrolla a partir de un compartimento apical progenitor que se encuentra adyacente al espacio subretiniano, una cavidad que separa el ojo del mesénquima de la cabeza. Orientación construcciones de ADN de los progenitores la retina por lo que requiere que las inyecciones se realizan en un área de blanco pequeño. Utilizando micromanipuladores, hemos logrado objetivos con éxito esta pequeña área en los embriones de E13.5 a E15.5 (que se muestra es E15.5 electroporations de PCIC con el reportero mCherry; Fig. 4.). Si electroporated retinas se examinan 24 horas después de la transfección, se observa que la mayoría de las células + mCherry se encuentran en la capa exterior neuroblast (onbl), donde los progenitores se encuentran dividiendo, y no en la capa de células ganglionares de la retina (gcl; imagen insertada), donde las células postmitóticas localizar. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Introducción a la electroporación en el útero de configuración y metodología. (A) Los componentes clave de la cirugía de configuración incluyen un Eppendorf FemtoJet microinyector (1), micromanipulador Narishige con soporte de la aguja (2), steromicroscope Leica (3), iluminación de fibra óptica sistema (4), ECM 830 Sistema de la plaza de electroporación de onda con los electrodos (5) y el cojín de la calefacción (6). (A &#39;) El animal se anestesia con un vaporizador de isoflurano anestesia. (B, B &#39;) En pocas palabras, después de la anestesia, los cuernos uterinos están expuestos y el ADN mezclado con verde rápido se inyecta en el cerebro embrionario vesículas. Una inyección de éxito se visualiza mediante el seguimiento de la rápida tinte verde (B &#39;). (C, C) Después de que el ADN es inyectado con éxito, los electrodos de paletas se colocan a ambos lados del útero, positicañoning el embrión de modo que el ADN se estira hacia el polo positivo en la región del cerebro de la elección. (D, D &#39;) Una vez que todos los embriones son inyectados deseado, el útero es empujado hacia atrás en el abdomen (D), el peritoneo se sutura, y la piel se grapa (D&#39;). La mujer embarazada entonces se permite la recuperación y las crías de electroporación se recogen en los puntos de tiempo deseado. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Ejemplo representativo de la electroporación telencefálicas dorsal. (AC) Fotomicrografía de una sección coronal a través de un telencéfalo E13.5 dorsal electroporated en E12.5 con pCIG2. Electroporated células GFP + son analizados por su expresión de marcadores de células progenitoras apical (Pax6 +, rojo, A), los progenitores basal (Tbr2 +, rojo, B) y las neuronas postmitóticas (Tbr1 +, rojo, C). cp, placa cortical; svz, zona subventricular, vz, zona ventricular. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Ejemplo representativo de la electroporación diencefálico. (A) Un punto de vista ventral del cerebro de un E14 que ha sido electroporated en E12 con pCIG2. GFP epifluorescencia es visible en el tálamo, el pre-tálamo y el hipotálamo, lo que demuestra la expansión de la microinyección pCIG2 plásmido en todo el ventrículo 3 º. (B) Microfotografía de la sección coronal a través del cerebro electroporación, que muestra la migración de las células GFP + fuera de la zona ventricular y en la zona del manto, donde los núcleos del hipotálamo se forma. 3V, tercer ventrículo, T, el tálamo, Hy, el hipotálamo, mz, zona del manto, Tel, telencéfalo, PreT, prethalamus; vz, zona ventricular. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Ejemplo representativo de la electroporación de retina. Sección coronal a través de un ojo E16.5 electroporación con PCIC en E15.5 que muestra la acumulación de células mCherry + en la capa exterior de los neuroblastos y no en Brn3b + en las células ganglionares de la retina en la capa de células ganglionares. La inserción es una imagen de mayor aumento de la zona de caja. gcl, ganglionares de la retina la capa de células, le, lentes, capa onbl, neuroblast exterior, re, la retina.

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	<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Langevin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+in+utero+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+gene+regulatory+elements+in+the+murine+telencephalon.+Dev+Dyn+236.">Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236.</a> , 1273-1286 (2007).</li><li>Mattar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+transcription+factors+cooperate+to+specify+a+cortical+projection+neuron+identity.">Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity.</a> Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus.">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li><li>Vue, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice.">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li><li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice:+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections.">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).</li><li>Buffo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+transcription+factor+Olig2+in+response+to+brain+injuries:+implications+for+neuronal+repair.">Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).</li></ol>

En el útero de la electroporación se puede utilizar para analizar una amplia variedad de procesos de desarrollo. Por ejemplo, la transfección de genes reporteros, como las buenas prácticas agrarias, mCherry o fosfatasa alcalina puede ser utilizado para llevar a cabo el linaje de búsqueda y experimentos de migración neuronal. Por otra parte, la recombinasa Cre puede ser transitoriamente expresó que la eliminación selectiva de un alelo floxed en un espacio y / o de manera temporal controlada. Además, shR...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Categoría </th></tr><tr><td> Tijeras finas </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 14078-10 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Iris tijeras curvas </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 14061-10 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Ex-Delicado Porta-agujas </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 12002-12 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Anillo de pinza, de 9 mm </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11103-09 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Ojo vestirse Forcep </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11051-10 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Dumont # 7 DMX Forcep </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11271-30 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Dumont # 5 DMX Forcep </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11251-30 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Tejido pinza Adson- </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 11027-12 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Reflejo de aplicador de clip </td><td> Mundial de instrumentos de precisión </td><td> 500343 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Cuchara perforada, 15 mm de diámetro </td><td> Bellas Ciencia Herramientas Inc. </td><td> 10370-18 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Autoclip Remover </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Seda Negro trenzado de sutura </td><td> Ethicon Inc. </td><td> K871 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> Reflejo de la piel de cierre inoxidable clips de acero herida </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 500346 </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td></tr><tr><td> ECM 830 electroporación sistema de onda cuadrada </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Pinzas w / Brecha variable 2 Ronda de 5 mm de electrodo de platino Plate </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Pinzas w / Brecha variable 2 Ronda 7mm electrodo de platino Plate </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P7 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet microinyector </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Control de pie de Eppendorf FemtoJet microinyector </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (misc) </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Modelo Bransonic limpiador ultrasónico 1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995-534 CPN-952-118 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Sutter P97 micropipeta Extractor </td><td> Sutter Instrument, Carsen Group Inc. </td><td> P-97 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipetas - borosilicato con filamento de OD: 1 mm, ID: 0,78 mm, 10 cm de longitud </td><td> Sutter Instrumento </td><td> BF100-78-10 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> 3-ejes manipulador grueso </td><td> Carl Zeiss Canadá Inc. </td><td> M-152 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Dispositivo de sujeción magnética para micromanipulador </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> M1 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Placa base para micromanipulador </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 5052 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipeta titular </td><td> Mundial de la PrDECISIÓN Instrumentos </td><td> MPH3 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Micropipeta Mango </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 5444 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Estereomicroscopio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Vaporizador de isoflurano anestesia </td><td> Porter Instrumentos Empresa </td><td> MODELO 100-F </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Metriclean2 solución de baja espuma para ultrasonidos instrumentos quirúrgicos </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Gentamicina 40mg/ml en 0,2 g azul de metileno spray antibiótico después de la sutura </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Germex para la esterilización de instrumentos quirúrgicos </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> BNP pomada oftálmica </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Distribuido por Church &amp; Dwight Co., Inc. </td><td> disponibles en el mercado </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Stanhexidine 4% w / v piel más limpia </td><td> Omega Laboratories Inc. </td><td> 01938983 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> La buprenorfina (Temgesic) analgésico </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Sulfa &quot;25&quot; sulfametazina antibiótico oral </td><td> Profesionales de Laboratorios Veterinarios </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Solución de Ringer lactato </td><td> Baxter Corporación </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Saline - 0,9% de cloruro sódico </td><td> B-Braun Medical Inc. </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Anestésicos por inhalación - El isoflurano USP </td><td> Pharmaceutical Partners Inc. de Canadá </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Reactivos quirúrgica </td></tr></tbody></table>

efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation

La capacidad de manipular la expresión génica es la piedra angular de la moderna embriología experimental, lo que lleva al esclarecimiento de múltiples vías de desarrollo. Varias tecnologías transgénicas potente y bien establecidas están disponibles para manipular los niveles de expresión de genes en el ratón, lo que permite la generación de los modelos de la pérdida y ganancia de función. Sin embargo, la generación de ratones transgénicos resulta costoso y el tiempo. Métodos alternativos de la manipulación genética han sido ampliamente tratado por lo tanto. En el útero de la electroporación es un método de entrega de genes en ratones vivos 1,2 embriones que se han adaptado con éxito 3,4. Se basa principalmente en el éxito de las tecnologías de la electroporación in ovo que se utilizan comúnmente en chica 5. En pocas palabras, el ADN es inyectado en los ventrículos abierta del cerebro en desarrollo y la aplicación de una corriente eléctrica provoca la formación de poros transitorios en las membranas celulares, lo que permite la absorción de ADN en la célula. En nuestras manos, los embriones pueden ser eficientemente electroporated a partir del día embrionario (E) 11,5, mientras que la focalización de los embriones más jóvenes que requieren una guiada por ultrasonido protocolo microinyección, como se describió anteriormente 6. Por el contrario, E15.5 es la última etapa que puede electroporar, debido a la aparición de los parietales y la diferenciación de hueso frontal, lo que dificulta la microinyección en el cerebro. Por el contrario, la retina se puede acceder a través del final de la embriogénesis. Los embriones se pueden recoger en cualquier punto durante todo el período postnatal embrionario o temprano. La inyección de un reportero construir facilita la identificación de las células transfectadas. Hasta la fecha, en la electroporación in utero ha sido más utilizado para el análisis del desarrollo neocortical 1,2,3,4. Los estudios más recientes se han centrado en el embrión de la retina y el tálamo 7,8,9 10,11,12. A continuación, presentamos una modificación en el protocolo de electroporación in utero que puede ser fácilmente adaptada a los diferentes dominios de destino del sistema nervioso central embrionario. Aportar pruebas de que mediante el uso de esta técnica, podemos apuntar el telencéfalo diencéfalo embrionario, y la retina. Los resultados representativos se presentan, en primer lugar que muestra el uso de esta técnica para introducir las construcciones de expresión de ADN en los ventrículos laterales, lo que nos permite controlar la maduración progenitor, diferenciación y migración en el telencéfalo embrionario. También muestran que esta técnica puede ser utilizada para combatir el ADN de los territorios que rodean el ventrículo diencefálico 3 º, lo que permite las rutas migratorias de diferenciar las neuronas en los núcleos diencefálicos a ser monitoreados. Por último, se muestra que el uso de micromanipuladores nos permite introducir con precisión construcciones de ADN en las áreas objetivo pequeño, como el espacio subretiniano, lo que nos permite analizar los efectos de la manipulación de la expresión de genes en el desarrollo de la retina.

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Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

efficient-gene-delivery-into-multiple-cns-territories-using-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

19.7K vistas.  University of Calgary. En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

Guiada por ultrasonido microinyección en el cerebro anterior Ratón In Utero En E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Investigación

Neurociencias

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Gen de entrega de cerebro de rata postnatal por la inyección no ventricular plásmido y electroporación

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Generación de ratas transgénicas por vía tópica<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación y<em&gt; En vivo</em&gt; Detección bioluminiscencia

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Técnica ratón Microcirugía de infusión para Targeted Sustancia de entrega en el SNC<i&gt; vía</i&gt; La arteria carótida interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Inducción de la recombinación del Cre-lox en la corteza Cerebral de ratón a través de electroporación en el útero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...