Damos las gracias a Hans Reiner pólder, Martin Fuhrmann y Walker Jackson para leer detenidamente el manuscrito. Los autores recibieron financiación que fue proporcionada por el Ministerio de Investigación MIWF del estado de Renania del Norte-Westfalia (SR), el BMBF-Projekträger DLR colaboración entre Estados Unidos y Alemania en neurociencia computacional (CRCNS, SR), Centros de Excelencia en Enfermedades Neurodegenerativas (COEN; SR), y la Universidad del programa de financiación habitual Bonn (BONFOR; SR).

1. Requisitos del sistema <ol><li> Sistema de microscopio: buena visualización de la dendrita es crucial. Si está disponible, utilice un sistema de microscopía de escaneo láser de dos fotones. En nuestros experimentos hemos utilizado un ámbito TRIM II, LaVision Biotec, Bielefeld, Alemania o un sistema Ultima IV, Tecnologías de la Prairie, Middleton, Wisconsin equipado con un Ti: Sapphire-pulsos láser ultrarrápidos (Camaleón Ultra II, coherente) y un objetivo de alto NA (60X, 0,9 NA, Olympus) para visualizar las dendritas que habíamos llenado con un colorante fluorescente a través de la pipeta parche. Aunque se cree que foto-daño a ser menos graves utilizando la exploración de 2 fotones, reducir la potencia del láser (por debajo de 8 mW en el tejido) y los tiempos de permanencia (por debajo de 1 microsegundos) o tanto como sea posible. </li><li> Una segunda posibilidad es la de activar una fuente de luz de fluorescencia de campo amplio (LED o una lámpara fluorescente) sincrónicamente con la adquisición de reducir el tiempo de exposición tanto como sea posible. Hemos utilizado un monocromador con una fuente de luz integrada (TILLPhotónicos, Gräfelfing, Alemania) en un Zeiss Axioskop 2 FS microscopio vertical, que estaba equipado con iluminación infrarroja Dodt-contraste (TILLPhotonics, Gräfelfing, Alemania). En nuestros experimentos tiempos de exposición variaron desde 10 mseg por lo general a máx. 30 mseg. </li><li> Utilice un amplificador de micro-iontoforesis rápido, por ejemplo, un sistema de micro-iontoforesis de dos canales MVCS-C-02 (NPI electrónica, Tamm, Alemania) con compensación de capacitancia rápido. Los microelectrodos iontoforesis de punta fina tienen resistencias de 25 a 100 mW (fundamentalmente en función del tamaño de la punta y de la forma de pipeta) y tiempos de subida rápidos sólo pueden alcanzarse si la indemnización capacidad del amplificador de iontoforesis se ajusta de manera óptima. Esta compensación rápida es necesaria la aplicación de impulsos de corriente con un inicio breve y rápida en el rango de sub-milisegundos a la pipeta iontoforético y de ese modo para expulsar el transmisor con alta resolución espacial en tamaños de punto por debajo de 1 m 13. Amplificadores iontoforesis son allo disponible en varias otras empresas, que no hemos probado en nuestro laboratorio. Estos dispositivos son a nuestro conocimiento no está equipado con circuitos de compensación de capacitancia. </li></ol> 2. Preparar Soluciones <ol><li> Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) y la solución interna, ya que se requiere para el diseño experimental. La única adición a la solución interna, que se requiere, es un colorante fluorescente de color rojo o verde (por ejemplo, 50 a 200 mM Alexa Fluor 488 o 594 hidrazida, Invitrogen), dependiendo del equipo óptico. Aquí un ejemplo para ACSF sacarosa que puede ser utilizado para la disección, en mM: NaCl 60, ​​100 de sacarosa, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 1 de CaCl 2, 5 MgCl2, 20 de glucosa, y para ACSF normales solución para los experimentos de patch-clamp en mM: NaCl 125, KCl 3, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 2,6 CaCl2, 1,3 MgCl 2, 15 glucosa. </li><li>Carbogenize (95% O 2, 5% CO 2) todas las soluciones extracelulares constantemente. </li><li> Preparar la solución interna, por ejemplo, en mM: 140 K-gluconato, 7 KCl, 5 HEPES-ácido, 0,5 MgCl 2, 5 fosfocreatina, 0,16 EGTA; con 50 - 200 micras Alexa 488. </li><li> Para glutamato micro-iontoforesis preparar una solución con 150 mM de ácido glutámico y ajustar el pH a 7,0 con NaOH. Añadir 50 -200 mM Alexa Fluor 488 o 594 hidrazida (Invitrogen) para la visualización. </li><li> Para iontoforesis de GABA preparar una solución 1 M de GABA y ajustar el pH a 5 con HCl 15. A este pH GABA está cargado, sólo entonces se puede aplicar el uso de la iontoforesis. Tenga en cuenta que el bajo pH en la solución expulsada al espacio extracelular podría afectar propia transmisión GABA 16,17. Proteja la solución de GABA de la luz y con frecuencia preparar solución de GABA fresca, ya que la solución anterior puede perder su eficacia. </li><li> Si es difícil de ver eventos GABAérgicas, equipogh Cl - solución interna fuerza motriz, por ejemplo, dejando fuera de KCl, pueden ayudar a visualizar los eventos GABAérgicas para ver si la iontoforesis GABA está trabajando, sin embargo para investigar la integración sináptica una fuerza de conducción fisiológica podría ser recomendada. Para la detección general de pequeños eventos GABAérgicas, un protocolo se muestra en la Figura 8C puede ayudar. </li></ol> 3. Tire y probar las pipetas iontoforesis <ol><li> En general, tirando de las pipetas adecuadas es quizás el paso más importante para lograr la iontoforesis neurotransmisor controlada. Cuando se utiliza la iontoforesis en cultivo celular, es posible tirar de electrodos muy finos similares a microelectrodos afilados 10. En los experimentos de patch-clamp en rodajas agudas, sin embargo, estas pipetas muy finas se doblan sobre la superficie de corte cuando se bajan en el tejido con un ángulo, por lo que es imposible de alcanzar dendritas más profundas. </li><li> Por lo tanto, tirar de una pipeta con una punta muy pequeña, por lo que no neurotransmitter puede salir, pero la punta tiene que ser lo suficientemente rígido como para penetrar en el tejido (Figura 2). Por ejemplo, usar 150 GB F 8P pipetas de clase (Science Products, Hofheim, Alemania) y un tirador horizontal (por ejemplo, un extractor DMZ-Universal, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Alemania, o un extractor de P-97, Sutter Instrument Company , Novato, CA) con varios pasos de tracción para lograr una pequeña abertura, sino también un corto Tapper con un ángulo pronunciado (Figura 2 y Tabla 2). </li><li> También es posible utilizar pipetas de vidrio de cuarzo para tirar de pipetas iontoforéticos 10. Se supone que tiene mejores propiedades mecánicas y ser más confiable, sin embargo se requieren extractores especiales láser. Pero también es posible lograr buenos resultados con pipetas de vidrio normales, que por lo general se utilizan para tirar de pipetas de parche. </li><li> Pon a prueba el rendimiento de pipeta y la resistencia en una cámara sin tejido, antes de utilizarlas por primeratiempo, ya que las fugas de glutamato podría dañar el tejido. </li><li> Configure el amplificador iontoforesis correctamente. A continuación, llenar la pipeta con el neurotransmisor y la solución que contiene colorante y colocarlo en el baño (ACSF). </li><li> Compensar la capacitancia (Figura 3). Por lo general, muy pipetas agudos tendrán una capacidad superior a los contundentes. </li><li> Comprobar la resistencia de la pipeta: El amplificador de micro-iontoforesis utilizado aquí tiene una característica construir-en para la medición de la resistencia a la pipeta. Evoca impulsos de prueba rectangulares breves, que pueden ser controlados con un osciloscopio estándar o una tarjeta A / D conectado a un ordenador con el software de adquisición. Dependiendo de la forma y el tamaño de la punta, la punta debe tener una resistencia entre 25 a 90 mW. </li><li> Centrarse en la punta con un objetivo de inmersión en agua de 60X o 40X y cambiar a imágenes fluorescentes y si es posible, agrandar Si hay una fuga de colorantes fluorescentes fuera de la punta de la pipeta, aplique una pequeña positivo (en el caso de gluTamate) o negativo (en el caso de GABA, Figura 4) actual conservan (&lt;0,02 μA). Si eso no ayuda para cancelar la fuga, cambiar la pipeta. </li><li> Aplicar una corriente de paso fuerte o usar el disparador manual y supervisar la punta en la imagen fluorescente para ver si la solución puede ser expulsado fuera de la pipeta. Como se mencionó anteriormente, la polaridad del impulso de corriente está en función de la carga de la molécula que se supone que ser expulsado. Para expulsar el glutamato es una corriente negativa y para GABA una corriente positiva (Figura 4). </li><li> Las burbujas de aire en la pipeta que bloquean la expulsión de tinte y el transmisor, se puede borrar mediante la aplicación de un alto eyección actuales varias veces. </li><li> Tomados en conjunto, si no hay fugas visibles y la eyección prueba fue exitosa, compensar la capacitancia e iniciar el experimento. </li><li> Precaución: Dado que la compensación de capacitancia se consigue mediante un circuito de realimentación, este circuito puede oscilar sobreimpulso o si es overcompensated. Utilizar con cuidado el ajuste del dial de compensación de capacitancia. </li><li> Dependiendo de la estabilidad extractor a veces es necesario para ajustar la configuración del extractor de tiempo en tiempo, ya que el filamento puede haber cambiado propiedades. Sin embargo, si una vez que una buena pipeta está diseñado, que puede ser utilizado para varios días. Por lo tanto, después de terminar el experimento iontoforético almacenar la pipeta en un recipiente cerrado sin dañar la punta. </li><li> Para el siguiente experimento llenar la pipeta con la solución de neurotransmisor, se aplican varios pulsos expulsan fuertes para limpiar la punta y luego comprobar si las propiedades (por ejemplo, resistencia) el cambio de manera significativa. Entonces compensar la capacitancia y utilizar la pipeta de nuevo. No use una sola pipeta con diferentes soluciones de neurotransmisores. </li></ol> 4. Preparar las rodajas de cerebro <ol><li> Si micro-iontoforesis se utiliza por primera vez sin duda preparar las rodajas después de establecer un programa extractor de funcionar de forma fiable. </li> &lt;procedimientos li&gt; Perform anestesia y la decapitación de acuerdo a las pautas de cuidado de animales de su institución o de la autoridad local. </li><li> Después de la eliminación del cerebro, la transferencia a hielo frío ACSF sacarosa (véase el Protocolo 2.1). </li><li> Cortar la región de interés en rodajas de grosor adecuado (por ejemplo, 300 micras). </li><li> Incubar las rebanadas en ACSF sacarosa a 35 ° C durante 30 min. Posteriormente, transferirlos a una cámara de retención sumergida que contiene ACSF normal a temperatura ambiente. </li><li> A lo largo de la preparación y la experimentación carbogenize la ACSF que rodea las rebanadas con 95% O 2, 5% de CO 2. </li></ol> 5. Establecer una grabación de células enteras <ol><li> Coloque la pipeta iontoforesis (s) ya cerca de la superficie de corte antes de parchear una celda, para evitar el posicionamiento de larga duración, después de establecer el modo de célula completa. </li><li> Tire una resistencia baja parche pipeta (3-5 mW), llenarlo con la dvosotros que contiene solución interna y aplicar presión positiva a la pipeta (30 - 60 mbar). </li><li> Ingrese el baño y el enfoque de la celda bajo la guía visual (dos imagen contraste gradiente fotón contraste o Dodt infrarrojos). </li><li> Vigilar la resistencia pipeta con un pulso de prueba (por ejemplo, -10 mV, 20 ms) en el modo de fijación de voltaje. Al tocar el tejido corregir el potencial de compensación. </li><li> Acércate a la célula y empuje suavemente la punta de la pipeta en ella hasta que un &quot;hoyuelo&quot; se puede ver claramente. Inmediatamente liberar la presión de la pipeta, se aplican 40 - 60 mbar de presión negativa y cambiar el potencial de membrana de -65 mV. </li><li> Cuando la corriente de mantenimiento alcanza valores por debajo de 100 pA, liberar la presión negativa. </li><li> Después de establecer un sello giga (resistencia&gt; 1 GΩ), la ruptura de la membrana con un corto, fuerte succión a la pipeta o breve exceso de compensación del circuito de compensación de capacitancia. </li><li> Dependiendo del modo (abrazadera de tensión o de corriente) que se requierepara el diseño experimental, compensar apropiadamente. </li><li> Iniciar para traer la pipeta iontoforético en su posición final. Si es necesaria una descripción más detallada de cómo llevar a cabo con éxito grabaciones de patch clamp, hay varias directrices excelentes disponibles 18,19. </li></ol> 6. Coloque la pipeta iontoforética y generar un potencial iontoforética Postsináptica <ol><li> En general, los acontecimientos iontoforéticos pueden ser evocados en lugares definidos dependiendo del experimento deseada, por ejemplo, en una dendrita espinosa para el glutamato micro-iontoforesis, en el eje dendríticas, soma o segmento inicial del axón para GABA micro-iontoforesis. </li><li> Acércate a la célula hasta aproximadamente 1 m distancia sin tocarlo. Después de alcanzar la posición de interés es crucial que no neurotransmisor se está filtrando y que la capacitancia de la pipeta esté bien compensada. </li><li> Si se aproxima la célula con un glutamato llena pipetee iontoforéticoe provoca la despolarización detectable del potencial de membrana, ajuste la corriente conservan si es posible, o cambiar la pipeta. </li><li> Aplicar impulsos de corriente negativos cortos, a partir de cero y aumentar la corriente de forma sistemática (por ejemplo, desde 0,1 hasta 0,4 mseg, 0,01 a 1 μA pulsos). Esto ayuda a saber en qué rango de la corriente iontoforética evoca las respuestas deseadas en el experimental específica puesta a punto. </li><li> Si no hay ninguna respuesta detectable, levante la pipeta varias cientos de micrómetros y aplicar una fuerte corriente de expulsión (&gt; 0,1 μA) para limpiar la punta. Ajuste la compensación de capacitancia, acercarse a la célula, y vuelva a intentarlo. </li><li> Si aún no hay respuesta, reducir la corriente de retener. Tenga mucho cuidado con los ajustes de la carátula ya que este procedimiento puede causar la liberación de neurotransmisores incontrolada. Por lo tanto, vigilar constantemente el control para detectar los cambios respectivos en el potencial de membrana. </li><li> Si es difícil de detectar eventos GABAérgicas, puede ser útil usar unn composición de la solución interna de rendimiento en un alto Cl - fuerza motriz. Para lograr esto, reducir la concentración de Cl - en la solución de la pipeta (véase la sección 2.6 del protocolo.). Esto dará lugar a acontecimientos GABAérgicas más grandes en el potencial de membrana en reposo debido a una fuerza de conducción más alta. </li><li> Alternativamente, inyecte medidas actuales largos resultan en la membrana potenciales posibilidades de -100 mV a -48 mV (Figura 8C). Con este protocolo el Cl - motor se incrementa a potenciales hiperpolarizados causan una respuesta GABA despolarización. </li><li> También es posible utilizar el protocolo de inyección de corriente de paso para determinar el potencial de inversión de los acontecimientos evocados, lo que ayuda a determinar la naturaleza GABAérgica de los eventos. La fuga de GABA es más difícil de detectar que las fugas de glutamato. En este caso, un control constante de la resistencia de entrada puede ayudar, cuando se acercó a la pipeta llena de GABA. Si la resistencia de entrada disminuye, la corriente puede retener be incrementa o una pipeta diferente se debe utilizar. </li><li> En los experimentos de control para iontoforesis glutamato, sugerimos una Ca 2 + experimento de imágenes, utilizando 200 mM OGB-1 y no EGTA en la solución de la pipeta para visualizar la entrada de calcio local que puedan ser causados ​​por fugas de glutamato. </li><li> En general, para lograr una respuesta estable es muy importante tener una pipeta mecánicamente estable para evitar la deriva con el tiempo. La deriva puede ser causado por cambios de temperatura, por lo tanto, se recomienda conectar el equipo por lo menos media hora antes de las medidas para evitar la deriva térmica. Asegúrese de utilizar buenos cierres de cartucho en el soporte de la pipeta y la punta está muy fijo. El titular de la misma puede ser, además, fijado con cinta de teflón, por otro lado, estar seguro de que no hay tensión en los cables de la headstage o manipulador, que también es una fuente potencial de la deriva. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aquí le explicamos cómo aplicar micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores para investigar la integración sináptica en las dendritas. Esta técnica se ha utilizado con éxito para investigar la transmisión sináptica glutamatérgica y GABAérgica en diferentes regiones del cerebro in vitro e in vivo 9,20-22. Micro-iontoforesis se ha utilizado durante más de 60 años, pero en los primeros años, se utiliza sobre todo para bien aplicar localmente neurotransmisores y fármacos en...

Las neuronas en el sistema nervioso central reciben una variedad de entradas sinápticas en sus procesos dendríticos delgadas y ramificadas 1. Allí, la mayoría de las entradas excitadoras dendríticas están mediadas por las sinapsis glutamatérgicas. Estas sinapsis se pueden activar de una manera distribuida en el espacio, lo que resulta en la integración lineal postsináptica de los potenciales postsinápticos excitatorios (EPSP). Si las sinapsis se activan de forma simultánea y en proximidad espacial en la dendrita, estas entradas excitadoras pueden ser integrados supra-linealmente y generan picos dendríticas 2-5. Además, la integración de entradas excitadoras depende de la ubicación de la entrada en el árbol dendrítico. Las señales que llegan a la región distal del mechón son mucho más atenuado que las entradas proximal por filtrado de cable 6. En el hipocampo, las entradas distantes a las dendritas apicales penacho se generan por una región del cerebro diferente que los de proximal dendriTES 7. Una cuestión interesante es por lo tanto, la forma de entrada sináptica es procesada por diferentes compartimentos dendríticas y si la integración dendríticas regula la influencia de estas entradas en capas sobre el disparo neuronal de diferentes maneras. No sólo las propiedades funcionales, las características morfológicas de la dendrita, la ubicación y la agrupación de las entradas están afectando a la integración dendríticas de entradas excitadoras, también las entradas inhibidoras adicionales de terminales GABAérgicas crucial determinar la eficacia de las sinapsis glutamatérgicas 8,9. Estos diferentes aspectos de la integración sináptica pueden ser investigados utilizando idealmente neurotransmisor micro-iontoforesis, que permite la aplicación espacialmente definida de diferentes neurotransmisores a los dominios dendríticas. Estamos aquí demostrar la forma de establecer con éxito micro-iontoforesis de glutamato y GABA para investigar la integración de señales en las neuronas. Para esta aplicación, de punta finase utilizan pipetas de alta resistencia llenos de soluciones concentradas de neurotransmisores. Estas pipetas están posicionados cerca de la membrana externa de la célula, donde se encuentran los receptores de los neurotransmisores. Es necesaria una buena visualización de las ramas dendríticas. Esto se logra mejor mediante tintes fluorescentes, que se introducen a través de la pipeta parche. A continuación, un impulso de corriente muy corto (&lt;1 ms) (en el rango de 10 a 100 nA) se utiliza para expulsar las moléculas neurotransmisoras cargadas. Con estos pulsos cortos y compensación de capacitancia efectiva, potenciales o corrientes postsinápticas pueden ser evocados con alta precisión temporal y espacial, lo que significa que se conoce con precisión la ubicación de la entrada excitadora. El glutamato micro-iontoforesis puede activar sinapsis en un radio definido, que es menor que 6 m como se muestra aquí (Figura 1 9), pero también es posible llegar a resolución sinapsis única 10-12. Heine, M., y col </em&gt; mostró que la resolución espacial de las micro-iontoforesis rápido, incluso se puede ajustar para detectar tamaños por debajo de 0,5 micras, que es más pequeño que tamaños de los puntos alcanzados regularmente con uncaging de dos fotones de glutamato 13. Con micro-iontoforesis rápido que es fácilmente posible usar dos o más pipetas iontoforéticos y colocarlos en diferentes lugares, aunque distantes en el árbol dendrítico. De esta manera, la integración de eventos excitatorios, incluidos los de las diferentes vías, se puede investigar. También es posible utilizar un glutamato y una pipeta iontoforético lleno de GABA en el mismo tiempo. De esta manera el efecto de la inhibición GABAérgica en diferentes ubicaciones relativas a la entrada de excitación (en-camino, la inhibición de fuera de ruta) puede ser estudiada. Además, el impacto de la inhibición por interneuronas dirigidos dominios neuronales específicas, como las dendritas distales, soma o axones 14, puede ser investigada utilizando iontoforesis GABA. En las neuronas cultivadas, micro-iontoforesis rápido ofrece la oportunidad de investigate distribución de sinapsis individuales y los aspectos elementales de la comunicación sináptica en las neuronas de muchos más detalles 10,11. En este artículo se demuestra en detalle la forma de establecer la iontoforesis glutamato y GABA para el uso en rodajas de cerebro de agudos, lo que permite que investigan la integración sináptica de entradas excitadoras e inhibidoras en dependencia de la ubicación de entrada, los puntos fuertes de entrada, y el momento, solo o en interacción. Vamos a señalar las ventajas y limitaciones de esta técnica y cómo solucionar con éxito.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)</td>
			<td>LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope Ultima IV</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Coherent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X Objective, NA 0.9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-iontophoresis system MVCS-02</td>
			<td>NPI Electronics, Tamm, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Company, Novato, CA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments (150 GB F 8P)</td>
			<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 hydrazide</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5835</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09137.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09108.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast micro-iontophoresis of glutamate and gaba: a useful tool to investigate synaptic integration

Uno de los intereses fundamentales de la neurociencia es entender la integración de entradas excitadoras e inhibidoras a lo largo de la muy compleja estructura del árbol dendrítico, que finalmente conduce a la producción neuronal de potenciales de acción en el axón. La influencia de diversos parámetros espaciales y temporales de entrada sináptica específica en la salida neuronal está actualmente bajo investigación, por ejemplo, la atenuación dependiente de la distancia de las entradas dendríticas, la interacción dependiente de la ubicación de las entradas espacialmente segregadas, la influencia de la inhibición GABAergig en la integración excitatorio, lineal y modos de integración no lineales, y muchos más. Con micro-iontoforesis rápido de glutamato y GABA es posible investigar con precisión la integración espacial y temporal de la excitación glutamatérgica y la inhibición GABAérgica. Requisitos técnicos críticos son o bien una lámpara fluorescente activado, el diodo emisor de luz (LED), o una de dos fotones scanning microscopio para visualizar ramas dendríticas sin introducir significativa foto-daño del tejido. Además, es muy importante tener un amplificador de micro-iontoforesis que permite la compensación de capacitancia rápido de pipetas de alta resistencia. Otro punto crucial es que ningún transmisor se libera involuntariamente por la pipeta durante el experimento. Una vez establecida, esta técnica dará señales fiables y reproducibles con una alta especificidad y neurotransmisor ubicación. En comparación con el glutamato y GABA uncaging, iontoforesis rápido permite el uso de dos transmisores en el mismo tiempo pero en lugares muy distantes sin limitación para el campo de visión. También hay ventajas en comparación con la estimulación eléctrica focal de axones: con micro-iontoforesis se conoce definitivamente la ubicación del sitio de entrada y es seguro de que sólo se libera el neurotransmisor de interés. Sin embargo, tiene que tener en cuenta que sólo con micro-iontoforesis lapostsynapse se activa y aspectos presináptica de la liberación de neurotransmisores que no se resuelven. En este artículo se demuestra cómo crear micro-iontoforesis en experimentos de cortes de cerebro.

Un enfoque simple para determinar la extensión espacial de la iontoforesis es para retraer la pipeta iontoforético paso a paso de la dendrita, mientras se mantiene constante la glutamato expulsado. Hemos encontrado que la extensión espacial de una estimulación de micro-iontoforético tenía un diámetro de aproximadamente 12 micras (Figura 1 que muestra radio). ¿Qué tan profundo en el tejido de la iontoforesis se puede utilizar depende de la rigidez de la pipeta. Sin embargo, las pipetas iontofor?...

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

En este artículo presentamos micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores como técnica para investigar la integración de las señales postsináptica con alta precisión espacial y temporal.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

fast-micro-iontophoresis-glutamate-gaba-useful-tool-to-investigate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.4K vistas.  University of Bonn. En este artículo presentamos micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores como técnica para investigar la integración de las señales postsináptica con alta precisión espacial y temporal.

Video: Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

De corte de carga: una herramienta útil para examinar el grado de acoplamiento Marcador brecha unión entre las neuronas retinianas

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Investigación

Neurociencias

MPI CyberMotion Simulator: Implementation of a Novel Motion Simulator to Investigate Multisensory Path Integration in Three Dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. Humans can do path integration based exclusively on visual 2-3, auditory 4, or inertial cues 5. However, with multiple cues present, inertial cues - particularly kinaesthetic - seem to dominate 6-7. In the absence of vision, humans tend to overestimate short distances (&lt;5 m) and turning angles (&lt;30&deg;), but underestimate longer ones 5. Movement through physical space therefore does not seem to be accurately represented by the brain.
Extensive work has been done on evaluating path integration in the horizontal plane, but little is known about vertical movement (see 3 for virtual movement from vision alone). One reason for this is that traditional motion simulators have a small range of motion restricted mainly to the horizontal plane. Here we take advantage of a motion simulator 8-9 with a large range of motion to assess whether path integration is similar between horizontal and vertical planes. The relative contributions of inertial and visual cues for path navigation were also assessed.
16 observers sat upright in a seat mounted to the flange of a modified KUKA anthropomorphic robot arm. Sensory information was manipulated by providing visual (optic flow, limited lifetime star field), vestibular-kinaesthetic (passive self motion with eyes closed), or visual and vestibular-kinaesthetic motion cues. Movement trajectories in the horizontal, sagittal and frontal planes consisted of two segment lengths (1st: 0.4 m, 2nd: 1 m; &plusmn;0.24 m/s2 peak acceleration). The angle of the two segments was either 45&deg; or 90&deg;. Observers pointed back to their origin by moving an arrow that was superimposed on an avatar presented on the screen.
Observers were more likely to underestimate angle size for movement in the horizontal plane compared to the vertical planes. In the frontal plane observers were more likely to overestimate angle size while there was no such bias in the sagittal plane. Finally, observers responded slower when answering based on vestibular-kinaesthetic information alone. Human path integration based on vestibular-kinaesthetic information alone thus takes longer than when visual information is present. That pointing is consistent with underestimating and overestimating the angle one has moved through in the horizontal and vertical planes respectively, suggests that the neural representation of self-motion through space is non-symmetrical which may relate to the fact that humans experience movement mostly within the horizontal plane.

An efficient way to gain insight into how humans navigate themselves in three dimensions is described. The method takes advantage of a motion simulator capable of moving observers in ways unattainable by traditional simulators. Results confirm that movement in the horizontal plane is underestimated, while vertical movement is overestimated.

MPI CyberMotion Simulator: Implementación de un simulador de movimiento Novela encargado de investigar la integración multisensorial ruta en tres dimensiones

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

La cuantificación automática de la fluorescencia en el Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Using an &amp;#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

El uso de un enlace del sitio Tag α-Bungarotoxina para el Estudio de GABA A receptor de membrana localización y el Tráfico

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

Inducción de un estado isoeléctrico cerebro para investigar el impacto de la actividad endógena sináptica neuronal en la excitabilidad<em&gt; En Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer&#039;s Mouse Models

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

El uso de biosensores basados ​​en enzimas para medir tónica y fásica glutamato en modelos de ratones con Alzheimer

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Un análisis del flujo de calcio de alto rendimiento para el estudio de los receptores NMDA con sensibilidad D/glicina-serina y glutamato

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...