Los autores desean agradecer a la Dra. Kathleen Mathers, el Dr. Jean-Philippe Mocho y la Dra. Yolanda Torres Saavedra por su ayuda para llevar a cabo en el útero de la electroporación en los procedimientos de asepsia, y Hayley Wood por su ayuda para preparar los dibujos. EP fue apoyado por una Federación a largo plazo Europea de Sociedades Bioquímicas (FEBS) y una beca del Medical Research Council (MRC) de becas de desarrollo profesional, TAC por una subvención del Wellcome Trust de Elizabeth Fisher y Tybulewicz Víctor (080174/B/06/Z) , HW por un EMBO becas a largo plazo y RA por una beca de MRC. Este trabajo fue apoyado por una subvención para el proyecto de la Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) y por un FG Grant-in-Aid, de la Medical Research Council (U117570528) para

En el Reino Unido, los ratones se encuentran, criados y tratados de acuerdo con las directrices aprobadas por el Ministerio del Interior en el marco del Animal (Procedimientos Científicos) de 1986. 1. Preparación: El ADN de soluciones y Agujas <ol><li> Purificar el ADN plásmido con una endotoxina libre de Maxi-prep kit. Preparar una solución de ADN del plásmido para la inyección a las concentraciones deseadas en agua y añadir Fast Green (concentración final de 0,05%) para visualizar las inyecciones. La eficacia de la electroporación es altamente dependiente de la concentración de ADN. Una concentración de 1 mg / l se utiliza generalmente. Esta concentración es suficiente para visualizar las neuronas electroporadas sin afectar su desarrollo. Sin embargo, de acuerdo con el promotor utilizado en el vector de plásmido (bajo nivel de expresión con el promotor de citomegalovirus / potenciador, el nivel de expresión fuerte con el citomegalovirus temprano inmediato potenciador y pollo β-actina de fusión promotor (CAG) promotor), así como el tamaño y el<html> estabilidad de la proteína expresada, esta concentración se puede ajustar (0,25 g / l de 5 g / l). </li><li> Tire las agujas de vidrio utilizando un extractor de micropipeta. </li></ol> 2. Preparación de la cirugía <ol><li> Autoclave instrumentos quirúrgicos y solución salina de tampón fosfato (PBS). </li><li> Preparar la solución de analgésico en PBS (buprenorfina, la concentración Vetergesic, final de 30 mg / ml). Pesar el ratón embarazada e inyectar por vía subcutánea 0,1 mg / kg de Vetergesic al menos 30 minutos antes de la cirugía. Durante este tiempo, preparar la zona quirúrgica. Encienda los cojines de la calefacción y la cámara de recuperación. Coloque PBS estéril en un baño de agua caliente y todos los instrumentos y materiales estériles sobre paños estériles. Colocar los electrodos de platino en un vaso lleno de PBS y conectarse a la electroporador. Completa la aguja con la solución de ADN utilizando una punta microloader, conectar la aguja a la titular capilar y pellizcar la punta de la aguja con un fórceps. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. Cirugía Antes de la inyección de ADN y electroporación <ol><li> Anestesiar a un ratón embarazada (E14.5-E15.5) con isoflurano en transportador de oxígeno (oxígeno de 2 l / min) con una cámara de inducción de la anestesia. Espere hasta que el animal pierde reflejo de enderezamiento. </li><li> Traslado del animal a un &quot;pre-cirugía&quot; máscara. Ponga una gota de gel para los ojos en cada ojo para evitar ulceración de la córnea de los ojos mientras la madre está bajo anestesia general. Use una rasuradora eléctrica para afeitarse el vello del abdomen. Limpie el área afeitada, una vez con clorhexidina para recoger pelo al viento. </li><li> Transferir el animal a una segunda máscara en la zona quirúrgica. Coloque el ratón con la espalda sobre el cojín eléctrico. Inicio de la cirugía cuando el reflejo de pedal se ha perdido. </li><li> Ponte la máscara y guantes estériles. Cubrir el animal con un campo estéril (con un pequeño agujero en el abdomen) para evitar que los tejidos y los instrumentos de ser contaminado por las áreas de la piel que no han sido afeitadas y desinfectadas. Limpie el área afeitada unal menos 3 veces con clorhexidina. Use un hisopo de algodón estéril diferente cada vez. Utilice un bisturí para realizar una incisión vertical a lo largo de la línea media (aproximadamente 1 pulgada de largo) a través de la piel. Con unas tijeras, hacer una incisión similar del músculo del abdomen a lo largo de la línea alba (línea blanca compuesta principalmente de tejido conectivo de colágeno). </li><li> Elija los embriones más accesibles y colocar las pinzas de anillo entre dos embriones y tire con cuidado la cadena de embriones fuera de la cavidad abdominal. Desde este punto en adelante, mantener los embriones hidratado con estéril pre-calentado PBS. </li></ol> N microscopio se requiere para la visualización. 4. La inyección de ADN y electroporación <ol><li> Comience con uno de los embriones más laterales, por lo que es más fácil seguir la pista de que los embriones fueron electroporated. No tire demasiado de los embriones, ya que esto aumenta el riesgo de hemorragia. Manipular la posición del embrión dentro del saco amniótico mediante las pinzas de anillo yestabilizar la cabeza de los embriones entre los anillos. Apriete suavemente para empujar hacia arriba el embrión más cercano a la pared uterina. </li><li> Con la otra mano, tome el titular capilar e insertar la aguja con cuidado en el centro de la semiesfera para orientar el ventrículo lateral. Presione el pedal para inyectar aproximadamente 1 l de solución de ADN se mezcla con Fast Green (menos de 1 l para estudiar las dendritas). Usted debe observar que el colorante verde de llenado del ventrículo lateral. Los pasos críticos: - La nitidez de la aguja es fundamental para penetrar adecuadamente la pared uterina. Es importante para minimizar el movimiento de la aguja en la superficie de la pared uterina y después de la inserción en el ventrículo porque una ampliación del agujero dará lugar a la fuga de líquido amniótico y la muerte del embrión. Evite los vasos sanguíneos perforantes en la pared uterina, ya que esto dará lugar a la hemorragia y la muerte del embrión. - Es importante no inyectar un volumen demasiado grande de ADN en el ventrículo lateral porque inducehidrocefalia (no superan el 2 l en E14.5). El volumen de ADN se ajusta de acuerdo con la finalidad del experimento. Si 1μl se utiliza generalmente para la mayoría de los experimentos, un volumen más pequeño de ADN (aproximadamente 0,5 l) se requiere para la dendrita y análisis columna vertebral. De hecho algunas células aisladas tienen que ser dirigidos con el fin de visualizar y medir el árbol dendrítico de las neuronas electroporated. </li><li> Colocar los electrodos en los lados de la cabeza embrión con el positivo (+) paleta en el mismo lado que el ventrículo inyectado por electroporación corteza o en el lado opuesto del ventrículo inyectado por electroporación hipocampo (Figura 2). A continuación, aplique cinco pulsos eléctricos 30V (50 ms de duración) a intervalos de 1 seg. Paso fundamental: Evitar la aplicación de corriente a través de la placenta ya que esto puede provocar la muerte del embrión. Todos los embriones de un ratón embarazada puede ser electroporación, por lo general con el mismo ADN que la construcción para evitar cualquier confusión. Sin embargo, una disminución de la cirugía a largo<html> Cuál es la tasa de supervivencia de los embriones. La cavidad abdominal no se debe abrir más de 30 min. </li></ol> 5. Cirugía Post-electroporación <ol><li> Después de electroporación de embriones, añadir PBS en la cavidad abdominal y el uso de las pinzas de anillo para reemplazar el cuerno uterino en su ubicación original. Suturar la pared del abdomen y la piel con suturas absorbibles Vicryl. </li><li> Colocar el animal en una cámara de recuperación hasta que se despierta (min generalmente 5-10) y luego se transfieren en una jaula colocada en una almohadilla térmica. </li></ol> 6. Después de la cirugía Comprobar el comportamiento de los ratones para evaluar el dolor, sufrimiento o angustia y pesar a los animales 24 horas y 48 horas después de la cirugía. Si es necesario, se pueden administrar analgésicos para minimizar el dolor y las molestias. 7. Procesamiento de tejidos Recoge los embriones electroporated o crías en las fases embrionarias o postnatal requeridos para el experimento. ove_content &quot;&gt; - Para el análisis en las etapas embrionarias (por ejemplo, para estudiar la proliferación celular o la migración): La eutanasia de la madre a través de la dislocación cervical y recoger los embriones. Después de la decapitación, seleccionar los cerebros que han sido debidamente electroporadas, como se indica por la cantidad y localización de la señal fluorescente, visualizado a través del cráneo usando un binocular fluorescente. Diseccionar el cerebro fuera del cráneo y corregir durante la noche en PFA al 4% y luego el lugar en el 20% de sacarosa / PBS durante la noche. Insertar en el complejo de octubre, la congelación a -80 ° C y la sección de uso de un criostato. - Para el análisis en las etapas postnatales (por ejemplo, para estudiar las dendritas y espinas): Anestesie crías o ratones adultos con inyección intraperitoneal de pentobarbital (40-60 mg / kg) y realizar la perfusión transcardial con PBS, seguido por 4% PFA en PBS. Diseccionar el cerebro fuera del cráneo y después de fijar en PFA 4% durante la noche. Después de lavados en PBS, la sección de los cerebros de un vibrátomo (100 micras para las secciones dendrite análisis). Montar las secciones en Aqua Poli / montaje utilizando cubreobjetos de 0.16-0.19 mm de espesor a las dendritas de imagen y las espinas. 8. Los resultados representativos La Figura 3 muestra ejemplos de las células electroporated en la corteza cerebral (Figuras 3A, B), en la CA1 (Figuras 3C, D) y en el giro dentado del hipocampo (Figuras 3e, f). Ratones de tipo salvaje se electroporated en E14.5 con una construcción de las buenas prácticas agrarias (PCA-b-EGFPm5 silenciador 3) y los cerebros fueron cosechadas en el día postnatal (P) 14. Mediante la inyección de un pequeño volumen de solución de ADN (0,5 l o menos de una solución al 1 g / l), unas pocas células están etiquetados, que permite la visualización de la arborización dendrítica de aislados GFP + células (Figura 3), así como sus espinas a mayor aumento (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;fuerte&gt; Figura 1. Representación esquemática de los protocolos de electroporación que se pueden utilizar para estudiar las dendritas y espinas. (A) La electroporación de una construcción de las buenas prácticas agrarias para comparar las dendritas y espinas en los ratones de tipo salvaje y mutante. (B) La electroporación de GFP-shRNA (GFP se expresa de la misma construcción) para comparar las dendritas y espinas en los ratones a electroporación con un shRNA construcción específica de un gen de interés (X) o un shRNA control. (C) IUE se puede utilizar junto con un sistema inducible Cre con el fin de restringir la expresión de la ARNhc al período de tiempo conveniente. En este experimento, un vector que expresa una forma de la recombinasa Cre que puede ser activado por 4-hidroxitamoxifeno (CAG-ER T2 CREER T2; 1 g / l) 10, se electroporó junto con un vector que expresa un ARNhc específico en una dependiente Cre manera (1 g / l, y con un indicador de recombinación (CALNL-GFP construir, inducible GFP expresión por Cre;. 1 g / l) 10 El eficienciasCY de la caída puede ser mejorada mediante el aumento de la concentración de la ARNhc así como el aumento CAG-ER T2 CREER concentración T2. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> Figura 2. De control espacial de la electroporación. Esta figura muestra dónde colocar los electrodos de paletas de acuerdo con el sitio de la inyección de ADN a fin de orientar la corteza cerebral o el hipocampo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> Figura 3. Visualización de la glorieta dendrítica de las células en el útero por electroporación en la corteza cerebral y el hipocampo. (A, B) secciones coronales que muestran las buenas prácticas agrarias + en las células piramidales de la corteza cerebral, (CD) en las células piramidales CA1 del hipocampo y (E, F), las células granulares del giro dentado en P14. Una construcción de las buenas prácticas agrarias (PCA-b-EGFPm5 silenciador 3) se electroporated en E14.5. Las fotos de alta magnificaciónB, D, F) muestran que la IUE es un método eficaz para visualizar las dendritas. Las barras de escala representan 50 micras (B, D y F), 150 micras (A, C, E). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> Figura 4. Visualización de las espinas dendríticas en las neuronas que se P14 electroporadas en el útero en E14.5 con las buenas prácticas agrarias que expresa la construcción. (A, B) Las imágenes de alta magnificación de las espinas de las dendritas basales de las neuronas piramidales del hipocampo. Las barras de escala representan 5 micras (A) y 2 micras (B).

<ol>
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Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).</li><li>Castro, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. o. n. g. -. t. e. r. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation.">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopia+formation+in+rat+but+not+mouse+neocortex+after+RNA+interference+knockdown+of+DCX.">Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX.</a> Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El IUE es una poderosa herramienta para manipular la expresión génica no sólo en el espacio sino también en el tiempo. Mostramos aquí que esta técnica se puede utilizar para visualizar y manipular genéticamente las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo de los ratones. Además de las ventajas anteriormente citadas, cabe señalar que el IUE, en contraste con Golgi método, se puede combinar con inmunohistoquímica o hibridación in situ, que permite, por ejemplo al fenotipo de las células electroporadas. También es importante mencionar que este procedimiento no induce malformaciones cerebrales evidentes a pesar de su relativa invasividad. Además, a nivel celular, el IUE no modifica las propiedades electrofisiológicas de las neuronas de la electroporated 13. Mientras que nuestra demostración se centra en la visualización de las morfologías dendríticas y la columna vertebral, el IUE de las neuronas corticales o del hipocampo en E14.5 también podría utilizarse para estudiar otros eventos de desarrollo tales como la formación del axón y la orientación. En añadeition, el mismo tipo de protocolo podría ser implementado en otras etapas del desarrollo embrionario que se dirigen a poblaciones diferentes. Por ejemplo, un paradigma electroporación desarrollo muy tarde cortical en E18.5 se puede realizar para impulsar la expresión en células progenitoras astrocíticos 1. De manera similar, mientras que una electroporación del hipocampo en E14.5 permite orientar CA1-CA3 progenitores neuronas piramidales y progenitoras dentado gránulo celular al mismo tiempo, una electroporación finales del hipocampo (E18.5 o postnatal temprana) permitiría orientar gránulo dentado diferente progenitores 14. En este caso, el volumen inyectado de ADN puede ser aumentado, así como la intensidad de la corriente. Los transgenes introducidos por el IUE parecen seguir siendo episomal y por lo tanto perdió a partir de células después de sucesivas divisiones celulares. En las células postmitóticas tales como neuronas, sin embargo, los transgenes episomales permanecer activo durante meses después de la electroporación permitiendo estudios a largo plazo 13, 15. En nuestro estudio, hemos observado brillante GFP + células hasta 7 semanas después del nacimiento (el último tiempo hemos analizado) que indican que la orientación de embriones de los precursores neuronales corticales o del hipocampo utilizando los resultados de IUE en la expresión persistente de los transgenes de los primeros puntos en el tiempo de desarrollo hasta a la edad adulta. Una limitación actual de la técnica es que es difícil de ejercer un control preciso sobre el número total de células electroporadas. Sin embargo, al disminuir el volumen inyectado de solución de ADN, hemos demostrado que es posible marcar unas pocas células y para visualizar la arborización dendrítica de aislados GFP + células, así como sus espinas. La dimensión de la zona transfectadas también podría ser ajustado mediante la modificación de los parámetros de la electroporación, tales como la intensidad de corriente y el número de impulsos o el diámetro de las palas de electroporación. En total IUE es un método que es fácil de aplicar, rápida yeficiente para el estudio dendritas y espinas en vivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Preparación de las agujas y la solución de ADN para la inyección </td></tr><tr><td> Endofree Maxi Kit plásmido </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio borosilicato capilares 1,0 mm de diámetro exterior x 0,58 mm ID </td><td> Aparato de Harvard </td><td> 30-0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader consejos </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956003 </td><td> Para pipetas Eppendorf 0,5 l-10 l / l 2-20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td> El material para la cirugía </td></tr><tr><td> Extra finas tijeras iris </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas curvas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 91197-00 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas de anillo </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11103-09 </td><td></td></tr><tr><td> Portaagujas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 12002-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pinza Graefe </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura absorbible Vicryl </td><td> Ethicon Inc (Johnson &amp; Johnson) </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td> Paños estériles de 30 cm x 45 cm </td><td> Buster </td><td> 141765 </td><td></td></tr><tr><td> Hisopos estériles </td><td> Shermond </td><td> Huby-340 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Bastoncillos de algodón </td><td> Limpieza de la Cruz Co., Ltd </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td> La buprenorfina (Vetergesic) </td><td> Alstoe Sanidad Animal </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clorhexidina </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td> Viscotears los ojos de gel </td><td> Novartis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> El isoflurano </td><td> Abbott Laboratories </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject, Sodio Pentobarbitona 20% </td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> La electroporación </td></tr><tr><td> Electroporador </td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Tweezertrode 5 mm </td><td> BTX, Harvard Apparatus </td><td> 45-0489 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet microinyector </td><td> Eppendorf </td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> Control de pie durante FemtoJet microinyector </td><td> Eppendorf </td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td> Titular del capilar </td><td> Eppendorf </td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Procesamiento de tejidos </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> VWR (Prolabo) </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos </td><td> ThermoScientific (Menzel-Glaser) </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td><td> 22 x 50 mm # 1,5 </td></tr><tr><td> Agua Poly / montaje </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 18606 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation

En la electroporación in utero (IUE) se ha convertido en una poderosa técnica para estudiar el desarrollo de las diferentes regiones del sistema nervioso embrionario 1-5. Hasta la fecha esta herramienta ha sido ampliamente utilizado para estudiar la regulación de la proliferación celular, la diferenciación y la migración neuronal especialmente en el desarrollo de corteza cerebral 6-8. A continuación le detallamos el protocolo para electroporar en el útero de la corteza cerebral y el hipocampo, y aportar pruebas de que este enfoque puede ser usado para estudiar las dendritas y espinas en estas dos regiones cerebrales. La visualización y la manipulación de las neuronas en cultivos primarios han contribuido a una mejor comprensión de los procesos involucrados en las dendritas, la columna vertebral y el desarrollo de la sinapsis. Sin embargo neuronas de cultivo in vitro no están expuestos a todas las señales fisiológicas que pueden afectar dendrita y / o la formación de la columna vertebral y el mantenimiento durante el desarrollo normal. Nuestro conocimiento de las estructuras dendríticas y la columna vertebral <em&gt; in vivo en ratones de tipo salvaje o mutante proviene principalmente de observaciones utilizando el método de Golgi-Cox 9. Sin embargo, la tinción de Golgi se considera que es impredecible. De hecho, los grupos de células nerviosas y tractos de fibras están etiquetados al azar, con áreas específicas que suele aparecer manchada por completo mientras que las áreas adyacentes están desprovistos de manchas. Estudios recientes han demostrado que el IUE de las construcciones fluorescentes representa un atractivo método alternativo para estudiar las dendritas, las espinas, así como las sinapsis en los ratones mutantes / de tipo salvaje 10-11 (fig. 1A). Además, en comparación con la generación de agujeros ciegos de ratón, IUE representa una aproximación rápida para realizar la ganancia y la pérdida de estudios de la función de la población específica de las células durante una ventana de tiempo específico. Además, el IUE ha sido utilizado con éxito con la expresión inducible del gen o inducible ARNi se aproxima a refinar el control temporal sobre la expresión de un gen o ARNhc 12. Estas ventajas de la IUE se lo opened nuevas dimensiones para estudiar el efecto de la expresión génica / supresión de las dendritas y espinas, no sólo en estructuras cerebrales específicas (Figura 1B), sino también en un punto de tiempo específico del desarrollo (fig. 1C). Por último, el IUE es una herramienta útil para identificar las interacciones funcionales entre los genes implicados en las dendritas, la columna vertebral y / o desarrollo de la sinapsis. En efecto, a diferencia de otros métodos de transferencia de genes, como el virus, es fácil de combinar múltiples RNAi o transgenes en la misma población de células. En resumen, la IUE es un poderoso método que ya ha contribuido a la caracterización de los mecanismos moleculares que subyacen a la función cerebral y la enfermedad y también debería ser útil en el estudio de las dendritas y espinas.

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Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Este artículo describe en detalle un protocolo para electroporar en el útero de la corteza cerebral y el hipocampo en E14.5 en ratones. También se muestra que este es un método valioso para estudiar las dendritas y espinas en estas dos regiones cerebrales.

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

17.8K vistas.  MRC National Institute for Medical Research. Este artículo describe en detalle un protocolo para electroporar en el útero de la corteza cerebral y el hipocampo en E14.5 en ratones. También se muestra que este es un método valioso para estudiar las dendritas y espinas en estas dos regiones cerebrales.

Video: Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Investigación

Neurociencias

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Específica Striatum Cortex, hipocampo, Thalamus-, hipotálamo, núcleo-septal lateral y<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporación en el ratón C57BL / 6

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Inducción de la recombinación del Cre-lox en la corteza Cerebral de ratón a través de electroporación en el útero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial prefrontal cortex. This technique is a marked improvement over previous methods of Golgi impregnation because the premixed chemicals are safer to use, neurons are consistently well impregnated, there is far less background debris, and for a given region, there are extremely small deviations in spine density between experiments. Moreover, brains can be accumulated after a certain point and kept frozen until further processing. Using this method any brain region of interest can be studied. Once stained and cover slipped, dendritic spine density is determined by counting the number of spines for a length of dendrite and expressed as spine density per 10 &#181;m dendrite.

The protocol describes a modification of the rapid Golgi method, which can be adapted to any part of the nervous system, for staining neurons in the hippocampus and medial prefrontal cortex of the rat.