Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant GM086822. Los autores desean agradecer a los Dres. Alec Pakhomov Wallace y Pablo (Univ. de Washington Fondo Usuario Nanotecnología (NTUF)) y Andrea Slade (Bruker AXS) por su asistencia técnica de expertos. ADN AFM de imágenes se llevó a cabo en la Universidad. de Washington NTUF, un miembro de la Red de Nanotecnología Nacional de Infraestructura. El plásmido 2xGal4-2xGRE-luciferease fue proporcionado amablemente por el laboratorio del Dr. Keith Yamamoto (Universidad de California en San Francisco).

1. Preparación de muestras de ADN y las proteínas para obtener imágenes libres de contaminantes <ol><li> Aislar a las biomoléculas para formar una imagen y colocarla en un tampón acuoso adecuado. Proteínas para formar una imagen puede ser purificado mediante cromatografía líquida de 6, inmunoadsorción seguido de la eliminación de los anticuerpos y los pellets de 1,2, o purificación Profinity exacta y eliminación de etiquetas 7 (Figura 2A). Aislar las moléculas de ADN para ser captado por la purificación minipreparación (Figura 2B). </li><li> Confirmar la composición y la pureza de las muestras de proteínas para formar una imagen utilizando SDS-PAGE y Western Blot. Para el ADN, la secuencia y confirmar la pureza de completar un análisis de restricción y electroforesis en gel de agarosa. </li><li> Incubar las muestras en un buffer de AFM de adsorción para promover la adhesión de la muestra a la mica. Para las muestras de proteínas, 10 mM HEPES buffer puede ser utilizado. Adicionales con baja fuerza iónica sales fuerza o cofactores se pueden añadir otros también. Para las muestras de ADN, incluyen un catión divalente (por ejemplo, Mg 2 + o Ni 2 +) para promover la adsorción sobre el sustrato de mica. Una adecuada Mg 2 +-tampón que contiene el ADN es de 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 2 mM de MgCl 2 3. Una alternativa Ni 2 + buffer es de 10 mM HEPES, pH 6,8, 10 mM NiCl2. </li><li> Diluir la muestra a una concentración de 5 mg / ml en tampón de adsorción. Mezclar con cuidado. Guárdelo en hielo, mientras que el microscopio se está preparando. </li></ol> 2. Montaje de Sonda de AFM <ol><li> Coloque el soporte de celda de la sonda de líquido en la estación de acoplamiento en voladizo de instalación correspondientes. </li><li> Localice el voladizo largo y grueso (denominado en voladizo de la &#39;B&#39;) de la palanca de fuerte nitruro (SNL) de la sonda que se utiliza para obtener imágenes. Cuidadosamente traslado al titular de celda de la sonda de líquido, asegurando que la punta permanece en posición vertical. Nota técnica: Deberá ser pagado mientras que la sonda se encuentra en tránsito, dejándolo caer desde cualquier altura puede dañar o destruir el voladizo o la punta. A micropalanca SNL (MSNL) de la sonda se puede utilizar como una alternativa a la sonda de SNL. </li><li> Retire el soporte de la sonda de la estación de acoplamiento y examinar el voladizo bajo un microscopio de luz para asegurarse de que está intacta y bien asentado en el soporte de la celda de la sonda de líquido. </li><li> Retire con cuidado la cabeza AFM del conjunto de cola de milano instrumento apretando el tornillo de cabeza moleteada pinza. Nota técnica: Deberá ser pagado durante la manipulación de la cabeza del AFM, dejándolo caer incluso de una distancia corta (por ejemplo, si no está sentado correctamente en el conjunto de cola de milano) puede causar daños considerables. </li><li> Invertir la cabeza AFM y presione firmemente el soporte de la celda de la sonda de líquido en los cuatro pernos en la base de la cabeza del AFM. Con cuidado, volver la cabeza AFM en el conjunto de cola de milano instrumento. Suelte el tornillo de cabeza moleteada pinza para sujetar la cabeza del AFM en el instrumento. </li></ol> 3. Localización de la punta en voladizo, la alineación de láser, y el ajuste de fotodetector <ol><li> Utilizando el software del instrumento AFM, localice en su punta, moviendo los mandos de la microscopía óptica a bordo. Ajustar la iluminación del microscopio, si es necesario para mejorar la identificación de la punta. Lleve el extremo de la punta del voladizo en la proximidad de la cruz que aparece en el software del instrumento. </li><li> Acerque la punta del voladizo en el foco mediante el ajuste de las flechas arriba y abajo del controlador óptica en el software. Use lenta (S) o la velocidad media (M), mientras que el ajuste de la óptica. </li><li> Alinear el láser en su punta con los mandos de ajuste de láser. Mover los botones de ajuste hasta que el punto rojo de láser se encuentra dentro de la mancha iluminación blanca. Recorrido a lo largo del brazo en voladizo con un patrón de zig-zag hasta que el láser se coloca en el extremo en voladizo. Cuando está bien alineado, un punto fuerte reflejo aparecerá en la ventana frontal de la cabeza AFM. </li><li> El centro de la célula fotoeléctrica ajustando las perillas fotodetector en la cabeza AFM. Esto alineará el punto láser en el punto de mira de la pantalla fotodetector del software del instrumento. La suma de la señal observada debe ser de aproximadamente 4.6. </li></ol> 4. Posicionamiento de la cabeza y el voladizo AFM tuning <ol><li> Coloque una hoja recién cortado de mica unido a una platina de metal AFM en el soporte de la muestra magnetizada encima de la placa porta-AFM. Esta configuración se utiliza para colocar la cabeza antes de la AFM imágenes de la muestra de ADN o de proteína preparada en el paso 1. <ol><li> Nota técnica: El titular de la muestra magnetizada y titular de líquido de las células de la sonda son más gruesas que otra muestra de fijación de mecanismos y de los titulares de la sonda. Si no existe actualmente depuración insuficiente entre el conjunto titular de la mica de la muestra y la cabeza AFM, mover la cabeza AFM por seleccionar el icono de retirar en el software del instrumento en varias ocasiones. </li></ol></li><li> Gire la placa de sujeción AFM para la platina se coloca para la imagen inicial. Asegúrese de que el sustrato de mica se centra en la cabeza AFM. </li><li> Mueve la cabeza hacia el AFMsuperficie del disco mica-muestra utilizando el control de la superficie objeto de los instrumentos de software. Seleccione el medio (M) la velocidad en el motor Z, y continuar hacia la superficie hasta que la cabeza AFM es de aproximadamente 2 mm por encima de la mica. En este momento, pasar a utilizar el lento (S) Z velocidad del motor con el fin de evitar el contacto brusco entre la sonda y la superficie (en adelante, rompiendo la punta). </li><li> Proceder a mover la sonda más cerca de la superficie del sustrato de mica hasta rasgos distintivos en la superficie de la mica o el reflejo extremo están en foco. Alternar entre la superficie y los planos de reflexión punta focal a través del &quot;se centran en:&quot; desde el software del instrumento. </li><li> Seleccione el icono de la canción del software del instrumento y ajustar el cantilever. La frecuencia de resonancia del SNL recomendado y sondas MSNL cantilever es 20-60 kHz. Seleccione un máximo del 5% de compensación. Nota técnica: El ajuste voladizo adecuada es esencial para obtener imágenes de muestra adecuado. </li></ol> 5. Mica superficie de la muestra de imágenes <ol><li> Involucrar a la sonda sobre la superficie de la mica. Definición del tamaño de exploración inicial de 10 micras y velocidad de barrido de 1 Hz. Ganancia integral y el aumento proporcional puede ser inicialmente a 0,2 y 0,4, respectivamente. Ajustar las ganancias, según sea necesario a fin de que las exploraciones de seguimiento y volver más o menos se superponen. La disminución de la amplitud de consigna se incrementará la interacción entre la sonda y la mica y garantizar la participación. </li><li> Capturar imágenes exploración completa del campo m 10. Disminución de tamaño de digitalización a 5, 1 y 0,5 micras y la captura de imágenes completas de cada campo. Ajustar las ganancias y velocidad de barrido es necesario. La captura de imágenes de la superficie de mica ofrece una línea de base para la comparación con el ADN y las proteínas que contienen las muestras. </li><li> Desconectar la sonda con un solo clic en el icono de desactivar el software del instrumento. </li></ol> 6. Biomoléculas imágenes de interés <ol><li> Mezclar suavemente el ADN o las proteínas de la muestra preparada en el paso 1 y se preparan para cargarla en la superficie de mica imagen. Mezclar 5 l de la muestra preparada con 45 l de tampón fresco de adsorción (concentración de la muestra final = 0,5 mg / ml). </li><li> Añadir con cuidado 50 mg l del 0,5 / ml de solución de biomoléculas que contienen directamente sobre la superficie de la mica. Hacer esto sin mover la cabeza de la sonda o AFM, y asegurar la solución de muestra (pero no punta de la pipeta) hace contacto con la sonda. </li><li> Pausa de 5 minutos para permitir que las biomoléculas en la muestra que se adhieren a la superficie de la mica. </li><li> Al término de 5 minutos, pipeta de un adicional de 50 a 100 l de tampón de adsorción en el soporte de celda de la sonda de líquido, teniendo cuidado de no tocar la sonda, la cabeza AFM, o mica con la punta de la pipeta. Esto forma un menisco y permiten aprovechar imagen AFM modo en el líquido. Figura 3 muestra la disposición final de la celda de fluidos, en voladizo, muestra, titular de la muestra, y el menisco. </li><li> Reajustar el fotodetector y realinear el láser para el voladizo según sea necesario. Nota técnica: ver la punta de la sonda y la alineación láser es complicada debido a la difracción causada por la adición de tampón de muestra en el soporte de la sonda. Sintonizar manualmente el voladizo, si es necesario. </li><li> Vuelva a instalar la sonda usando el software del instrumento. Ajustar la desviación vertical, ganancia integral, y el aumento proporcional según sea necesario. Esto comenzará el proceso de re-imagen de la sección de mica escaneados inmediatamente antes de la adición de la muestra y capturar imágenes. </li><li> Aumentar el tamaño del escaneado (500 nm-10 micras) para identificar regiones de interés. Zoom-in y reducir la velocidad de barrido a 0,5 Hz para mejorar la resolución de la imagen </li><li> Una vez se haya completado imágenes, desconecte la sonda mediante la selección de retirar icono en el software del instrumento en varias ocasiones. De suficiente espacio libre entre la cabeza del AFM y el disco muestra antes del desmontaje de la celda de líquidos o platina. </li><li> Enjuague bien el titular de la celda de la sonda de líquido y platina con agua destilada para evitar que los cristales de sal que se formen como residual se evapora tampón de adsorción. Seca con aire comprimido. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Ejemplos de imágenes de AFM se presentan en la Figura 4. Sustrato de mica (A) proporciona una superficie plana sobre la cual molecular del ADN y las proteínas, pueden absorber. Mica de imágenes antes de que las muestras de biomoléculas proporciona un control negativo y la evaluación del ruido de imagen. También proporciona un nivel de seguridad de que el voladizo se adapta de forma correcta y muestra imágenes posteriores será un éxito. De doble cadena de ADN plásmido (B, D), presuntamente superenrollado, se identifica fácilmente por su apariencia asimétrica y uniforme de depositar sobre el sustrato de mica previamente poco notable. Complejos de proteínas de tamaños de partículas discretas (C, E) también se distingue de forma exclusiva el sustrato de mica. Las diferencias de tamaño de partículas indican heterogeneidad de la muestra, y puede ser útil para la aproximación de estequiometría complejo de proteínas o la actividad bioquímica. La forma general en diagonal y la orientación constante de la prolas partículas de proteína observado en el Panel de C es un artefacto de imagen, como las proteínas era de esperar que se orientarán sobre el sustrato de mica en forma aleatoria. Las posibles causas de que el artefacto se observa es una anormalidad física o punta de AFM de imágenes en demasiado rápido de una velocidad de barrido. Mientras que la convolución punta (ilustrado en la Figura 1B) evita los cálculos de medición de la longitud absoluta en los ejes X e Y, medición de la altura (eje z) y x relativos y las mediciones y puede ser sin embargo útil para estimar las propiedades biofísicas de las biomoléculas imágenes. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1: Representación esquemática de aprovechar el modo de microscopia de fuerza atómica (AFM). A, el microscopio. Al final del cantilever es una punta afilada que oscila arriba y abajo, ya que las exploraciones sobre la superficie de un sustrato de mica que absorben biomoleculares complejos. A medida que el escáner se mueve en las direcciones x e y, un rayo láser se refleja en la parte posterior del cantilever en una posición sensible detector de fotodiodos para trazar la vertical (z) de distancia de la punta se mueve a su paso por los complejos biomoleculares sentado en el mica. B. La distorsión de la imagen en las direcciones x e y causada por convolución punta. El radio nominal de una punta de nitruro de silicio convencionales, es más grande que las partículas sean imágenes, y el borde de los contactos de la punta de la muestra, ya que atraviesa la superficie. Resultados de la punta de convolución en el que aparecen imágenes de partículas más grande en la direcciones x e y, pero no la dirección z. Este efecto puede ser minimizado por el uso de las puntas con un radio de giro nominal menor. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2: Ilustración de la proteína immunoadsorbed y preparación de muestras de ADN. Un lanzamiento de GR immunoadsorbed • complejo de la proteína Hsp70 de los anticuerpos monoclonales (mAb)-proteína A-Sepharosa (PAS) de pellets. Incubando la immunopellet con un péptido que contiene el epítopo MAB facilitar la liberación de la GR complejos • proteína HSP70 de la pastilla, lo que permite que el complejo se recogerán a partir del sobrenadante y se visualizan mediante AFM. B, Preparación de ADN para el AFM imagen requiere el uso de cationes divalentes de adsorción de amortiguamiento. El catión divalente aumenta la afinidad de ADN para el sustrato de mica. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3: Disposición Final de la cabeza AFM, titular de líquido de las células de la sonda, muestra, soporte de la muestra, y el menisco de amortiguamiento. Un cuidado, debe tener cuidado al depositar la muestra y cobertura adicional en el sustrato de mica para evitar el contacto físico entre la punta de la pipeta y la cabeza AFM, llame al líquido, y el sustrato de mica. B, de ampliación de la A. El menisco tampón se extiende desde la platina al titular de la celda de la sonda de líquido. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4: Micrografías de fuerza atómica de sustrato de mica (A), 2xGal4-2xGRE-luciferease ADN plásmido 8 (B, D), y GR • complejos de la proteína HSP70 (C, E) en la solución tampón. Mica sirve como una imagen de control para comparar con la visualización de ADN y proteínas. GR complejos de proteína Hsp70 • fueron preparados por inmunoadsorción de GR preparado con Hsp70 y luego se libera de la pastilla de anticuerpos de cuentas utilizando un anticuerpo mAb de la competencia (como se ilustra en la Figura 2A). ADN fue preparado por minipreparación plásmido convencional. Los grupos A, B y C son de un aumento equivalente (barras de escala = 200 nm), al igual que los paneles D y E (las barras de escala = 40 nm).

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	<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&#149;hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft.">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&#149;hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li><li>Harrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+glucocorticoid+receptor+transport+on+microtubules+by+dynein.">Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein.</a> J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).</li><li>Pastre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+mica+mediated+by+divalent+counterions:+a+theoretical+and+experimental+study.">Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study.</a> Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>Guthold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+one-dimensional+diffusion+and+transcription+by+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase.</a> Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).</li><li>Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nick-sensing+DNA+3'-repair+enzyme+from+Arabidopsis.">A nick-sensing DNA 3'-repair enzyme from Arabidopsis.</a> J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li><li>Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+subtilisin+into+a+fluoride-triggered+processing+protease+useful+for+one-step+protein+purification.">Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification.</a> Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).</li><li>Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ligand+binding+domain+controls+glucocorticoid+receptor+dynamics+independent+of+ligand+release.">The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release.</a> Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).</li><li>Shen, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+sample+preparation+method+for+atomic+force+microscopy+visualization+of+individual+DNA+molecules+in+situ.">A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ.</a> Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).</li><li>Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+tuning+and+use+of+an+apertureless+near+field+infrared+microscope+for+protein+imaging.">Assembly, tuning and use of an apertureless near field infrared microscope for protein imaging.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+effects+of+matrix+stiffness+on+cellular+function+using+acrylamide-based+hydrogels.">Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+the+neuronal+SNARE+fusion+machinery.">Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery.</a> Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).</li></ol>

AFM ofrece una técnica única capaz de obtener imágenes microscópicas individuales biomoléculas sin recubrir en soluciones tampón acuoso y cerca fisiológicos en tiempo real. Esto permite la visualización de proteínas y moléculas individuales de ADN, así como complejos multiproteicos y los complejos ADN-proteína. Partículas macromoleculares con imágenes AFM puede ser útil para evaluar la homogeneidad de la muestra y para la identificación de la disposición física de los elementos constitutivos de las partículas observadas. Este enfoque de la observación de las partículas individuales macromoleculares pueden ser un complemento útil a las técnicas convencionales de bioquímicos, tales como ensayos de inmunoprecipitación, electroforesis en gel de poliacrilamida, y la exclusión tamaño de cromatografía en columna, que proporcionan datos significativos sumativa en representación de la 10 3 -10 11 complejos de biomoléculas individuales de interés actual en una muestra. La investigación sobre estequiometría multiproteico complejos, las interacciones biomoleculares, y los requisitos de cofactor todos pueden ser investigados mediante AFM. El método que aquí se presenta puede ser adaptado para dar cabida a preguntas específicas biofísicos de interés. Por ejemplo, utilizando un soporte de la celda de la sonda de líquido, capaz de intercambiar buffer, es posible que los requisitos de cofactor de ensayo para la formación de proteínas complejas. Proteína-ADN se pueden formar asambleas y disociado casi en tiempo real e incluso mientras se toman las radiografías. ADN se pueden generar con secuencias específicas de interés (por ejemplo, los elementos de respuesta o presunta nueva secuencia de unión a proteínas), mezclado con la hipótesis de la proteína de unión, y la imagen que proporcionan una evidencia directa de las interacciones intermoleculares. Al tocar el modo de AFM de imágenes es mucho menos complicada si las muestras secas se utilizan en lugar de las muestras en soluciones acuosas, y se encuentra de ADN lineal y cerrado círculo de plásmidos de ADN han sido dos imágenes de esta manera 3,9. El método que aquí se presenta utiliza muestras en soluciones tamponadas con el fin de proporcionar un entorno de imagen más fisiológica. Otros métodos de imágenes notables de proteínas también deben ser considerados, incluyendo cerca de microscopía de campo infrarrojo 10. El uso complementario de inmunoadsorción en consorcio con AFM ofrece la oportunidad de preparar una gran variedad de complejos de proteínas, utilizando técnicas bien establecidas bioquímicos, y luego a visualizar después de la liberación de la immunoadsorbing anticuerpos cordón de pellets. Por ejemplo, GR immunoadsorbed ha sido ensayada por su asociación con la proteína chaperona molecular Hsp70 1, así como la proteína dineína motor 2 a través de este enfoque con el fin de estimar el tamaño del complejo y estequiometría. Tamaño de las partículas y las características biofísicas (rigidez por ejemplo) han sido útiles para determinar la identidad de las biomoléculas en las muestras AFM imágenes 11,12. También es posible confirmar la identidad de biomoléculas por la adición de una biomolécula que interactúan (por ejemplo, un ligando o anticuerpo monoclonal), que se unen a su objetivo y provocar un aumento del tamaño de las partículas si la biomolécula objetivo está presente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Dimension 3100 </td><td> Bruker </td><td> Dimension 3100 </td></tr><tr><td> Dimensión de la celda de fluidos </td><td> Bruker </td><td> DTFML-DD-HE </td></tr><tr><td> Palanca de nitruro de Sharp (SNL) de nitruro de silicio Sonda de AFM </td><td> Bruker </td><td> SNL-10 </td></tr><tr><td> Micropalanca fuerte nitruro de palanca (MSNL) de nitruro de silicio Sonda de AFM </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td></tr><tr><td> NanoScope AFM de instrumentos de software </td><td> Bruker </td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td> De metal AFM platinas portamuestras </td><td> Ted Pella </td><td> 16208 </td></tr><tr><td> Grado V1 Mica discos de 12 mm </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td></tr></tbody></table>

visualization of recombinant dna and protein complexes using atomic force microscopy

Microscopía de fuerza atómica (AFM) permite la visualización de proteínas individuales, las moléculas de ADN, los complejos de proteína-proteína, y los complejos ADN-proteína. En el extremo del voladizo del microscopio es una sonda de nano-escala, que atraviesa zonas de la imagen que van desde los nanómetros a micrómetros, que mide la elevación de las macromoléculas que descansa sobre la superficie del sustrato en un momento dado. Las fuerzas electrostáticas hacen que las proteínas, lípidos y ácidos nucleicos para fijar libremente sobre el sustrato en orientaciones aleatorias y permitir imágenes. Los datos generados se asemejan a un mapa topográfico, donde las macromoléculas resolver en tres dimensiones las partículas de tamaño discreto (Figura 1) 1,2. Al tocar el modo de AFM implica la oscilación repetida del voladizo, que permite imágenes de los biomateriales relativamente suave, como el ADN y las proteínas. Uno de los notables beneficios de la AFM respecto a otras técnicas de microscopía nanométrica es su adaptabilidad con respecto a visualizar las proteínas individuales y complejos macromoleculares en tampones acuosos, incluyendo casi fisiológica condiciones de buffer, en tiempo real y sin manchas o revestimiento de la muestra que se va a examinar. El método que aquí se presenta describe la imagen de ADN y un factor de transcripción immunoadsorbed (es decir, el receptor de glucocorticoides, GR) en la solución tampón (Figura 2). Immunoadsorbed proteínas y complejos de proteínas se puede separar de la immunoadsorbing anticuerpos cordón de pellets por la competencia con el epítopo de anticuerpos y luego imágenes (Figura 2). Esto permite una manipulación bioquímica de las biomoléculas de interés antes de la imagen. Una vez purificada, el ADN y las proteínas pueden ser mezclados y el complejo de la interacción resultante puede formar una imagen así. La unión del ADN a la mica requiere un catión divalente 3, tales como Ni 2 + o Mg 2 +, que se pueden añadir a las reservas de la muestra sin embargo, mantener la actividad de la proteína. Utilizando un enfoque similar, AFM se ha utilizado para visualizar las enzimas individuales, como la ARN polimerasa 4 y una enzima de reparación de cinco, con destino a las hebras individuales de ADN. Estos experimentos proporcionar información significativa en la proteína-proteína y proteína-ADN interacciones biofísicas que tienen lugar a nivel molecular. Partículas de imágenes individuales macromoleculares con AFM puede ser útil para determinar la homogeneidad de las partículas y para la identificación de la disposición física de los elementos constitutivos de las partículas de imágenes. Mientras que el presente método fue desarrollado para la visualización de los complejos chaperona GR-proteína y ADN 1,2 líneas de actuación a la que el GR se unen, se puede aplicar ampliamente el ADN de imágenes y muestras de proteínas de una variedad de fuentes.

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

A modo de aprovechar microscopio de fuerza atómica (AFM) el método para la visualización de ADN plásmido, proteínas citoplasmáticas, y los complejos ADN-proteína se describe. El método incluye los enfoques alternativos para la preparación de muestras para el AFM imágenes después de la manipulación bioquímica. ADN que contiene regiones específicas que interactúan las proteínas se observan en las condiciones de amortiguación casi fisiológico.

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.3K vistas.  Seattle University. A modo de aprovechar microscopio de fuerza atómica (AFM) el método para la visualización de ADN plásmido, proteínas citoplasmáticas, y los complejos ADN-proteína se describe. El método incluye los enfoques alternativos para la preparación de muestras para el AFM imágenes después de la manipulación bioquímica. ADN que contiene regiones específicas que interactúan las proteínas se observan en las condiciones de amortiguación casi fisiológico.

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Investigación

Bioingeniería

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie de medición de potencial de bacterias usando Kelvin Sonda de Microscopía de Fuerza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Visualización de Germinosomes y la membrana interna de las esporas de Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Aplicación de microscopía de fuerza atómica para detectar la osteoartritis temprana

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automatización De Las Mediciones De Microscopio De Fuerza Bio-Atómica En Cientos De Células De C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...