El programa de la NSF-MRI (CHE: 1229103) es reconocido por la financiación de la compra de la nueva electrónica de control, software, líquido de las células, y otros equipos necesarios para montar un doble AFM / STM. Reconocemos las instalaciones compartidas en la Universidad de Chicago programa NSF-MRSEC (DMR-0820054) para obtener ayuda con la instrumentación de AFM, la capacitación y formación de imágenes, y de tiempo de instrumentos puestos a disposición por la Red de Investigación Instalaciones Materiales (DMR-0820054). Particularmente Agradecemos al Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, y el Prof. Ka Yee Lee para dar la bienvenida a nuestros estudiantes antes de la financiación de la propuesta de la NSF-MRI que trajo la instrumentación necesaria para nuestro campus. Reconocemos la financiación de una beca Título III STEM (ID: P031C110157) otorgó a la Universidad Northeastern Illinois que proporciona becas de investigación de verano para estudiantes y profesores, así como el apoyo a los consumibles. Por último, reconocemos Bruker-Nano, Inc. para la continuación del apoyo instrumental y permiso para reproduce un gráfico que muestra el mecanismo de PeakForce QNM y usar la palabra ScanAsyst para describir el software automatizado.

1. Informática y Microscopio Set Up <ol><li> Abra la válvula del cilindro N 2 y ajustar las perillas para asegurar la mesa de aire está flotando y el nivel. </li><li> Encienda el ordenador, el controlador y la luz de fibra óptica en este orden. </li><li> Ajuste el escáner al modo / LFM AFM y centrar la cámara en la cabeza AFM. </li><li> Software de código abierto. Seleccione categoría experimento &quot;Propiedades nanomecánicos&quot;, &quot;Quantitative nanomecánico Mapping&quot; en el grupo experimento, y &quot;PeakForce QNM en Fluid&quot; bajo experimento. Haga clic en Experimento de carga y luego Configuración. </li><li> Enfoque la cámara con el objetivo Z para ver la superficie del escenario. Uso de la gruesa arriba / abajo piezos mueven la etapa de aproximadamente 1 mm por debajo de la superficie de la abertura de la cabeza AFM. </li></ol> 2 Preparación de Superficie Mica <ol><li> Presione una etiqueta adhesiva sobre la cara de un disco limpio soporte de la muestra (15 mm de diámetro, 0,8 mm de espesor). Empuje una mica V-4disco de grado (25 x 25 x 26 mm) sobre el adhesivo hasta que quede firmemente unido. </li><li> Frota un trozo de cinta adhesiva transparente sobre la mica asegurar que esté completamente adherido sin burbujas de aire. Tire de la cinta de la mica de un lado para escindir de manera uniforme ella. Repita si es necesario para asegurar la mica es plana. </li><li> Agarre el disco de soporte, lado limpio mica para arriba, con un par de pinzas circulares (pinzas de disco), y coloque en el escáner. La mica debe ser por debajo del nivel de la abertura de la cabeza AFM. </li></ol> Asamblea Cell 3. fluido e Imagen de Mica Surface <ol><li> Enjuague la celda de fluido, junta tórica, adaptador de la jeringa, el adaptador de la manguera y la manguera de expulsión en etanol al 100%. Enjuague la celda de fluido en agua DI. Deje que todo el aire partes seque por completo. </li><li> Empuje el adaptador de la manguera en el puerto de la célula de fluido limpio. Presione suavemente la junta tórica en la muesca centro de la celda de fluido usando pinzas plana encabezados. </li><li> Presione el resorte ligeramente en el clip de retención de la sonda y convertirlo lejos de la del groove por la punta. </li><li> Sujete la sonda en el extremo largo de la punta con unas pinzas de punta plana. Coloque la sonda en la ranura con la punta hacia el centro de la célula. Empuje el resorte en y ajustar el clip de retención sobre la sonda para asegurarlo (Figura 1B). </li><li> Compruebe la pinza en el AFM para asegurarse de que está completamente retraída (Figura 1C). </li><li> Coloque la celda de fluido, la junta tórica y la sonda hacia abajo, en la parte superior de la muestra de mica. Deje que la cámara de fluido para descansar en los pernos de la AFM. Baje la abrazadera para estabilizar la cámara de fluido en el escenario. Pulse el interruptor hacia abajo en el microscopio hasta que una inspección visual muestra la junta tórica firmemente comprimido entre el disco de soporte y la celda de fluido. </li><li> Mientras observa el monitor, enfocar el mando de ajuste grueso para visualizar la parte superior de la celda de fluido en la pantalla. </li><li> Mueva el microscopio hasta que haya una imagen clara de la punta utilizando los botones de ajuste de X / Y y Z el objetivo. La punta se Appoído como una metálica, triángulo de oro. Mueva la punta más cerca de la superficie de la muestra usando la palanca piezo abajo en el microscopio. Se centran en la reflexión de la punta. No pierda de vista el voladizo real en relación a su reflejo. En esta etapa, deben ser estrechamente alineados, pero no completamente superpuesta. </li><li> Conecte el adaptador de la jeringa a una jeringa estéril de 1 ml. Una un extremo de la manguera de inyección para el adaptador de jeringa y coloque el otro extremo de la manguera en el recipiente de solución tampón. Extienda completamente el émbolo de la jeringa. </li><li> Conecte la manguera al adaptador de manguera en la celda de fluido. Presione suavemente el émbolo hasta que el líquido se llena completamente la cámara central. Compruebe la célula para asegurar que no haya burbujas de aire. Compruebe que hay derraman hacia fuera de la célula de fluido en el microscopio no fluido. Coloque la jeringa sobre un soporte sólido levantada. </li><li> Utilice la alimentación de la cámara y las perillas de traducción / Y X para localizar el láser en la pantalla (un punto rojo difuso). Usando el láser movembotones de control de ENT, se mueven el láser en la punta. </li><li> Ajuste con precisión los controles de láser y espejos hasta que la señal suma que aparece en el microscopio se maximiza (valor = 4-6). </li><li> Ajuste el ángulo del diodo cuadrante usando los botones en la parte trasera izquierda y el lado superior izquierdo de la cabeza de exploración para reducir las deflexiones verticales y horizontales que se muestran en el microscopio lo más cerca posible a cero (± 0,1). </li><li> En el software, seleccione opciones de adquisición. Como mínimo, seleccione la altura (traza y retraza), error de fuerza máxima y la deformación. Las otras opciones son dependientes del usuario y se pueden adaptar en base a la información específica deseada por el experimentador. </li><li> Seleccione &quot;línea&quot; para RT Plane Fit en cada ventana de adquisición. Seleccione &quot;ninguno&quot; para el OT Plano Fit en las ventanas de altura. Ajuste el X e Y offset y ángulo de lectura a cero, si no lo ha hecho. </li><li> Ajuste la velocidad de barrido de 1 Hz, la muestra por la línea 256, el control automático ScanAsystal individuo, y el auto Z límite ScanAsyst en off. Cambiar el límite de Z a 500 nm. Ajuste el tamaño de escaneo a 1 micra. </li><li> Haga clic en participar. En este punto, la punta se aproxima a la superficie. Mientras que la punta se acerca, observar el cambio de voltaje piezo Z en la esquina inferior izquierda de la pantalla. Si la punta se sale del rango, retire la punta y re-enfoque. Si esto no funciona, puede necesitar ser cambiado con el fin de tener un enfoque exitoso de la punta. Una vez que la punta está activado, las líneas comenzarán a aparecer en cada una de las ventanas de adquisición que compondrán una imagen. </li><li> Tomar imágenes de mica en 1 x 1 my un zoom lentamente para asegurarse de que la superficie de la mica es limpia y plana. Haga clic en la captura continua para guardar las imágenes tal y como aparecen. Acercar y moverse alrededor de la superficie si lo deseas. </li></ol> 4. Proteína Deposición y Preparación de la muestra de la Imagen <ol><li> Obtener muestra de proteína purificada 38 y mantener en hielo. Si se almacena en un congelador, descongelar la muestra enhielo durante 5 min. </li><li> Diluir la proteína a 0,0010 mg / ml solución buffer de imágenes utilizando refrigerado. El buffer de imágenes se utiliza aquí es 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), NaCl 150 mM, y 15 mM de MgCl 2. </li><li> Llenar una cámara 4 (100 x 15 mm) placa de Petri con solución buffer de imágenes refrigerado. Llenar cada cámara con al menos 5 ml de solución. Mezclar suavemente la solución de proteína se diluye con la punta unida a micropipeta. </li><li> Aplicar 200 l de la solución de proteína diluida a la superficie de la mica ya preparado. Después de 30 segundos, recoger la proteína de superficie / mica con las pinzas circulares (pinzas de disco). Mantenga la muestra paralela a la mesa de laboratorio. </li><li> Mientras sostiene la muestra, sumergir inmediatamente la muestra en la solución tampón contenida en el primer cuadrante de la placa de Petri (paso 4.2) asegurando al mismo tiempo que la muestra es paralela a la cuenca de la placa de Petri. Después de 1 segundo, retirar la muestra. </li><li> Seguir apretando la muestra paralela a la cuencade la placa de Petri, repita el paso 4.5 para los tres cuadrantes restantes. </li><li> Coloque el disco sobre un paño libre de polvo seco, para quitar el exceso de humedad y transferir el disco en la platina del microscopio. No toque la superficie real con el paño. No permita que la muestra se seque. </li><li> Repita los pasos 3.6 a 3.16. </li></ol> 5. Imaging proteínas en Mica <ol><li> Haga clic en la caja de parámetros de la comprobación en el lado izquierdo de la pantalla. Tamaño de Primavera y radio de la punta deben establecerse basa en que se utiliza la punta. </li><li> Haga clic en participar. Al igual que en el proceso de formación de imágenes mica (paso 3.17), observar la ventana de z-piezo cuando se acerca la punta. </li><li> Permitir el escáner a la imagen de la misma zona durante al menos dos pases consecutivos. Haga clic en la captura continua de guardar cada imagen recogida. </li><li> Mueva el escáner a una nueva región y / o cambiar el tamaño de la imagen si lo deseas. </li><li> Después de que el software automatizado ha terminado de ajustar elparámetros de análisis para un tamaño de imagen en particular, a su vez el software de apagado. </li><li> Ajustar manualmente velocidad de barrido, límite de z, el número de líneas, y la tensión con el fin de afinar el enfoque de la imagen. Si la imagen se vuelve demasiado fuera de foco, gire el software de nuevo para devolver la posición de partida original. Para aumentar la resolución de una imagen, mientras que el zoom sobre una proteína, disminuir la velocidad de exploración y aumentar el número de líneas proporcionalmente. </li><li> Después del experimento, limpiar la célula líquida con etanol al 100% y enjuague con DI H 2 O. Deje que el líquido celular que se seque completamente. </li><li> Abra el software de datos para procesar las imágenes de datos en bruto. En primer lugar, aplanar la imagen haciendo clic en el icono de aplanar. Seleccione Zero º orden y haga clic en ejecutar. Dependiendo de la imagen, un plano de ajuste puede ser necesario para obtener una imagen debidamente plana. En este caso, seleccione el icono en forma de avión y dibujar un plano de una superficie plana de la imagen con el cursor. Haga clic en ejecutar. Repita si es necesario </li><li> Select en la ficha de sección transversal para medir las dimensiones de la proteína. Dibujar una línea con el cursor se mueve por encima de la molécula o el área a analizar. Repetir para múltiples áreas y el software va a generar una superposición. Exportar la imagen o los datos utilizados para generar la imagen en un formato compatible con otros programas de software y de dibujo. </li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+engineering+enhances+a+phytochrome-based+infrared+fluorescent+protein.">Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein.</a> J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).</li><li>Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-transfer+and+hydrogen-bond+interactions+determine+fluorescence+quantum+yield+and+photochemical+efficiency+of+bacteriophytochrome.">Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1.">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , .</li><li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome,+RpBphP3,+reveals+residues+that+modulate+photoconversion.">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li><li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome:+photoconversion+and+signal+transduction.">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li><li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca.">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928 (2011).</li><li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution.">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li><li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes.">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li></ol>

There are no competing financial interests or conflicts of interest.

AFM es un método de microscopía de sonda de barrido completamente capaz de visualizar las proteínas y otras macromoléculas biológicas en condiciones fisiológicamente pertinentes. En comparación con la cristalografía de rayos X y RMN, una limitación de AFM es su incapacidad para lograr la misma resolución, en particular la resolución lateral. Cuando se utiliza AFM para analizar una molécula en cualquier superficie, el impacto de la superficie y la sonda en la imagen de la molécula también deben ser consider...

Microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha convertido en una herramienta muy importante para la investigación de las propiedades estructurales y mecánicas de superficies, películas delgadas, y las moléculas individuales desde su invención en 1986 (Figura 1). 1-3 Uso de una célula líquido, el método tiene llegado a ser particularmente útil en los estudios de macromoléculas biológicas y células incluso que viven en un ambiente fisiológicamente relevante. 4-10 Tapping-mode AFM se ha utilizado tradicionalmente para obtener imágenes de materiales blandos o moléculas unidas débilmente a la superficie, ya que el modo de contacto-AFM es típicamente inadecuado debido a los daños causados ​​por las fuerzas laterales ejercidas sobre la muestra por el voladizo. 11 AFM en modo Tapping reduce sustancialmente estas fuerzas por tener la punta toque la superficie de forma intermitente en lugar de estar en contacto constante. En este modo, el voladizo se hace oscilar en o cerca de su frecuencia de resonancia normal a la superficie. Al igual que en contacto con el modo de AFM, la topografía es analyzed trazando el movimiento de la piezo-z como una función de xy (distancia). La dinámica en voladizo pueden ser bastante inestables a o cerca de resonancia; por lo tanto, son muy difíciles de automatizar fuera de una situación de &quot;estado estacionario&quot;. En concreto, estas dinámicas dependen tanto de las propiedades de la muestra y entorno de digitalización. Para una molécula suave adsorbido a un (a) superficie dura, un bucle de retroalimentación bien afinado para la molécula puede dar lugar a la oscilación de realimentación para la superficie. Operación en el líquido complica aún más la sintonización del voladizo. Los cambios en los niveles de temperatura o de fluidos requieren reajuste constante de punto de ajuste, las ganancias, y otros parámetros de imagen. Estos ajustes suelen llevar mucho tiempo muy difícil y para los usuarios. Pico Quantitative Fuerza nanomecánico Asignación de propiedades (PF-QNM), como tocar el modo de AFM, evita interacciones laterales poniéndose en contacto con la muestra de forma intermitente (Figura 2). 12-15 &lt;/ Sup&gt; Sin embargo, PF-QNM opera en modo no-resonante y frecuencias mucho más bajas que en modo tapping AFM. Esto elimina los problemas de ajuste de modo de contacto intermitente-AFM, en particular los exacerbado por la presencia de fluido. Con PF-QNM, las imágenes se recogieron mediante la adopción de una curva de respuesta de la fuerza en cada punto de contacto. Con la adición de software ScanAsyst, 15 de ajuste de los parámetros de análisis puede ser automatizado y una imagen de alta resolución obtuvo en cuestión de minutos, incluso por usuarios inexpertos. Una vez que el usuario se familiarice con el AFM, cualquiera o todos los parámetros automatizados pueden estar desactivadas en cualquier momento que permite la experimentalista para ajustar la calidad de imagen de forma manual. Desde su creación, PF-QNM se ha aplicado para asignar bacteriorodopsina, una proteína de membrana, y otras proteínas nativas a nivel submolecular. 16-18 Para bacteriorodopsina, hay una correlación directa entre la flexibilidad de proteínas y de rayos X las estructuras cristalográficas. 12 PF -qnM se ha utilizado para investigar las células vivas con alta resolución. 19,20 conexiones importantes Además, los datos PF-QNM ha dilucidado entre la estructura y la mecánica dentro de la membrana de los eritrocitos que son críticas para la integridad y función celular. 21 Hemos empleado de microscopía de sonda de barrido (SPM) métodos, incluyendo AFM 22, 23 para estudiar la estructura de los fotorreceptores de luz roja llamada bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 Se componen de un módulo de detección de luz unido covalentemente a un módulo de señalización efector tales como histidina quinasa (HK). 26 El módulo de detección de luz normalmente contiene un cromóforo bilin que experimenta la transformación estructural tras la absorción de un fotón, con una serie de cambios estructurales que llegan al módulo de señalización efector y que conducen a una transformación global de la proteína entera . 24,27-29 Sobre la base de esta transformación, hay dos absorción de luz distinta sstados de BphPs, una luz que absorbe estado rojo y rojo lejano, denotan como Pr y Pfr. Pr es térmicamente estable estado, adaptada a la oscuridad para la mayoría de BphPs. 28 La base molecular de Pr / Pfr fotoconversión no se entiende por completo debido al conocimiento estructural limitada de estas proteínas. Con la excepción de una estructura de D. radiodurans, 30 todas las estructuras cristalográficas de rayos X publicada de estas proteínas están en el estado adaptado a la oscuridad y carecen de dominio efector. Los BphPs intactos son demasiado grandes para ser estudiado de manera efectiva por resonancia magnética nuclear (RMN) y son notoriamente difíciles de cristalizar en su forma intacta (particularmente en el estado de luz adaptado) para la cristalografía de rayos X. BphPs Recientemente se han diseñado como marcadores de proteínas fluorescentes infrarrojos (de IFP). 31 Caracterización estructural de estas proteínas puede ayudar aún más en el diseño IFP efectiva. 32-36 El foco de este artículo para presentar un procedimiento paraobtención de imágenes de BphPs utilizando AFM de células de líquido a través de PF-QNM. El método se demuestra por los estudios del estado de luz adaptada de la RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) a partir de la bacteria fotosintética R. palustris. El procedimiento que aquí se presenta es AFM enfoque conveniente y sencillo para obtención de imágenes de proteínas, así como otras macromoléculas biológicas. Con este método, los detalles estructurales de moléculas individuales se pueden recoger en un corto período de tiempo, similar a una sesión de laboratorio curso de ciencias de nivel superior. A través de la medición de secciones transversales y completando nuevos análisis dimensionales, los datos experimentales se pueden comparar con los modelos computacionales útiles. 37-42

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4997-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode 8 AFM</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>492-008-011</td>
			<td>equipped with Nanoscope V controller and J scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapping Mode Fluid Cell</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>MTFML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica V-4 Grade</td>
			<td>SPI supplies</td>
			<td>1150503</td>
			<td>25 x 25 x .26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample support disk</td>
			<td>nanoSurf</td>
			<td>BT02236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Plasta-Medic, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 15 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipettors</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>XL 3000i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RpBphP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared according to cited references</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light</td>
			<td>Digital Instruments Inc.</td>
			<td>F0-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco AFM Disc Gripper</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1668</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>102-ST1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1</td>
			<td>Schrodinger, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy of red-light photoreceptors using peakforce quantitative nanomechanical property mapping

Microscopía de fuerza atómica (AFM) utiliza una punta piramidal unida a un voladizo para investigar la respuesta de la fuerza de una superficie. Las deflexiones de la punta se pueden medir a ~ 10 pN por un láser y un detector sectorizado, que puede ser convertido a la imagen topografía. La modulación de amplitud o AFM &quot;modo de tocar&quot; implica la sonda de toma de contacto intermitente con la superficie mientras oscilante a su frecuencia resonante para producir una imagen. Utilizado conjuntamente con una célula de fluido, de modo tapping AFM permite la obtención de imágenes de macromoléculas biológicas tales como proteínas en condiciones fisiológicamente pertinentes. -Modo de tocar AFM necesita un ajuste manual de la sonda y ajustes frecuentes de una multitud de parámetros de análisis que puede ser un reto para los usuarios sin experiencia. Para obtener imágenes de alta calidad, estos ajustes son los que más tiempo consume. PeakForce cuantitativa nanomecánico Asignación de propiedades (PF-QNM) produce una imagen mediante la medición de una respon vigorSE curva para cada punto de contacto con la muestra. Con el software ScanAsyst, PF-QNM se puede automatizar. Este software ajusta el punto de ajuste, frecuencia de accionamiento, velocidad de barrido, las ganancias, y otros parámetros importantes de escaneado automáticamente para una muestra dada. No sólo este proceso de proteger ambas sondas frágiles y muestras, se reduce significativamente el tiempo requerido para obtener imágenes de alta resolución. PF-QNM es compatible para el AFM de imágenes en el líquido; por lo tanto, tiene una amplia aplicación para obtener imágenes de materiales biológicamente relevantes. El método presentado en este trabajo se describe la aplicación de PF-QNM para obtener imágenes de una bacteriana fotorreceptor de luz roja, RpBphP3 (P3), a partir de la fotosíntesis R. palustris en su estado de luz adaptado. Usando este método, los dímeros de proteínas individuales de P3 y agregados de dímeros se han observado en una superficie de mica en presencia de un tampón de formación de imágenes. Con los ajustes apropiados a la superficie y / o concentración de la solución, este métodopuede aplicarse en general a otras macromoléculas biológicamente relevantes y materiales blandos.

Imágenes de AFM representativos de una proteína de fotorreceptores, P3, en su estado de luz adaptado se presentan en las Figuras 3 y 4. Un sustrato de mica recién escindido (Figura 3A) es una superficie adecuada, plana para la adsorción de proteínas. El cobro de una imagen de mica limpio como un control negativo es importante por varias razones. En primer lugar, asegura la célula líquido se limpia y sin materiales residuales de los experimentos anteriores se cont...

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Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

atomic-force-microscopy-red-light-photoreceptors-using-peakforce

Research

JoVE Journal

Engineering

11.6K vistas.  Northeastern Illinois University. A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface. 

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Preparation and Friction Force Microscopy Measurements of Immiscible, Opposing Polymer Brushes

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low friction at the interface. Nevertheless, these systems can be sensitive to wear due to interdigitation of the opposing brushes. In a recent publication, we have shown via molecular dynamics simulations and atomic force microscopy experiments, that using an immiscible polymer brush system terminating the substrate and the slider surfaces, respectively, can eliminate such interdigitation. As a consequence, wear in the contacts is reduced. Moreover, the friction force is two orders of magnitude lower compared to traditional miscible polymer brush systems. This newly proposed system therefore holds great potential for application in industry. Here, the methodology to construct an immiscible polymer brush system of two different brushes each solvated by their own preferred solvent is presented. The procedure how to graft poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) from a flat surface and poly(methyl methacrylate) (PMMA) from an atomic force microscopy (AFM) colloidal probe is described. PNIPAM is solvated in water and PMMA in acetophenone. Via friction force AFM measurements, it is shown that the friction for this system is indeed reduced by two orders of magnitude compared to the miscible system of PMMA on PMMA solvated in acetophenone.

The methodology to perform friction force microscopy experiments for contacting brushes is presented: Two polymer brushes that are grafted from (a) substrates and (b) colloidal probes are slid to show that, by using two contacting immiscible brush systems, friction in sliding contacts is reduced compared to miscible brush systems.

Preparación y Fricción Fuerza Microscopía mediciones de inmiscibles, opuestos polímero Cepillos

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low ...

Investigación

Ingeniería

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Investigando individual molécula de adhesión por espectroscopia de fuerza atómica

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve geologic seals and allow CO2 to escape. However, the dissolution processes at reservoir conditions are poorly understood. Thus, time-resolved experiments are needed to observe and predict the nature and rate of dissolution at the pore scale. Synchrotron fast tomography is a method of taking high-resolution time-resolved images of complex pore structures much more quickly than traditional &#181;-CT. The Diamond Lightsource Pink Beam was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 hours. The images were segmented and the porosity and permeability were measured using image analysis and network extraction. Porosity increased uniformly along the length of the sample; however, the rate of increase of both porosity and permeability slowed at later times.

Synchrotron fast tomography was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 h.

Dinámica de los poros a escala embalse condición de imagen de la Reacción en carbonatos Uso de Sincrotrón Tomografía rápida

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Resolución de imagen subnanométrica con modulación de amplitud en microscopía de fuerza atómica en Líquido

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

An Efficient Method for Selective Desalination of Radioactive Iodine Anions by Using Gold Nanoparticles-Embedded Membrane Filter

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ion-selective removal of radioactive iodines. By using citrate-stabilized gold nanoparticles (mean diameter: 13 nm) and cellulose acetate membranes, gold nanoparticle-embedded cellulose acetate membranes (Au-CAM) have easily been fabricated. The nano-adsorbents on Au-CAM were highly stable in the presence of high concentration of inorganic salts and organic molecules. The iodide ions in aqueous solutions could rapidly be captured by this engineered membrane. Through a filtration process using an Au-CAM containing filter unit, excellent removal efficiency (&gt;99%) as well as ion-selective desalination result was achieved in a short time. Moreover, Au-CAM provided good reusability without significant decrease of its performances. These results suggested that the present technology using the engineered hybrid membrane will be a promising process for the large-scale decontamination of radioactive iodine from liquid wastes.

An efficient method for the rapid and ion-selective desalination of radioactive iodine in several aqueous solutions is described by using gold nanoparticles-immobilized cellulose acetate membrane filters.

Un método eficiente para la desalinización selectiva de aniones de yodo radiactivo mediante el uso de filtro de membrana incorporado en nanopartículas de oro

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ...

Surface Mapping of Earth-like Exoplanets using Single Point Light Curves

Spatially resolving exoplanet features from single-point observations is essential for evaluating the potential habitability of exoplanets. The ultimate goal of this protocol is to determine whether these planetary worlds harbor geological features and/or climate systems. We present a method of extracting information from multi-wavelength single-point light curves and retrieving surface maps. It uses singular value decomposition (SVD) to separate sources that contribute to light curve variations and infer the existence of partially cloudy climate systems. Through analysis of the time series obtained from SVD, physical attributions of principal components (PCs) could be inferred without assumptions of any spectral properties. Combining with viewing geometry, it is feasible to reconstruct surface maps if one of the PCs are found to contain surface information. Degeneracy originated from convolution of the pixel geometry and spectrum information determines the quality of reconstructed surface maps, which requires the introduction of regularization. For the purpose of demonstrating the protocol, multi-wavelength light curves of Earth, which serves as a proxy exoplanet, are analyzed. Comparison between the results and the ground truth is presented to show the performance and limitation of the protocol. This work provides a benchmark for future generalization of exoplanet applications.

The protocol extracts information from light curves of exoplanets and constructs their surface maps. It uses light curves of Earth, which serves as a proxy exoplanet, to demonstrate the approach.

Mapeo de superficie de exoplanetas similares a la Tierra mediante curvas de luz de un solo punto

Spatially resolving exoplanet features from single-point observations is essential for evaluating the potential habitability of exoplanets. The ultimate ...

Optimizing Magnetic Force Microscopy Resolution and Sensitivity to Visualize Nanoscale Magnetic Domains

Magnetic force microscopy (MFM) enables mapping local magnetic fields across a sample surface with nanoscale resolution. To perform MFM, an atomic force microscopy (AFM) probe whose tip has been magnetized vertically (i.e., perpendicular to the probe cantilever) is oscillated at a fixed height above the sample surface. The resultant shifts in the oscillation phase or frequency, which are proportional to the magnitude and sign of the vertical magnetic force gradient at each pixel location, are then tracked and mapped. Although the spatial resolution and sensitivity of the technique increases with decreasing lift height above the surface, this seemingly straightforward path to improved MFM images is complicated by considerations such as minimizing topographical artifacts due to shorter range van der Waals forces, increasing the oscillation amplitude to further improve sensitivity, and the presence of surface contaminants (in particular water due to humidity under ambient conditions). In addition, due to the orientation of the probe's magnetic dipole moment, MFM is intrinsically more sensitive to samples with an out-of-plane magnetization vector. Here, high-resolution topographical and magnetic phase images of single and bicomponent nanomagnet artificial spin-ice (ASI) arrays obtained in an inert (argon) atmosphere glovebox with &lt;0.1 ppm O2 and H2O are reported. Optimization of lift height and drive amplitude for high resolution and sensitivity while simultaneously avoiding the introduction of topographical artifacts is discussed, and detection of the stray magnetic fields emanating from either end of the nanoscale bar magnets (~250 nm long and &lt;100 nm wide) aligned in the plane of the ASI sample surface is shown. Likewise, using the example of a Ni-Mn-Ga magnetic shape memory alloy (MSMA), MFM is demonstrated in an inert atmosphere with magnetic phase sensitivity capable of resolving a series of adjacent magnetic domains each ~200 nm wide.

Magnetic force microscopy (MFM) employs a vertically magnetized atomic force microscopy probe to measure sample topography and local magnetic field strength with nanoscale resolution. Optimizing MFM spatial resolution and sensitivity requires balancing decreasing lift height against increasing drive (oscillation) amplitude, and benefits from operating in an inert atmosphere glovebox.

Optimización de la resolución y sensibilidad de la microscopía de fuerza magnética para visualizar dominios magnéticos a nanoescala

Magnetic force microscopy (MFM) enables mapping local magnetic fields across a sample surface with nanoscale resolution. To perform MFM, an atomic force ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Matrices de voladizo activo paralelo en AFMS para permitir inspecciones de alto rendimiento

Active Probe Atomic Force Microscopy with Quattro-Parallel Cantilever Arrays for High-Throughput Large-Scale Sample Inspection

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. However, due to their limited imaging throughput, AFMs have not been widely adopted for large-scale inspection purposes. Researchers have developed high-speed AFM systems to record dynamic process videos in chemical and biological reactions at tens of frames per second, at the cost of a small imaging area of up to several square micrometers. In contrast, inspecting large-scale nanofabricated structures, such as semiconductor wafers, requires nanoscale spatial resolution imaging of a static sample over hundreds of square centimeters with high productivity. Conventional AFMs use a single passive cantilever probe with an optical beam deflection system, which can only collect one pixel at a time during AFM imaging, resulting in low imaging throughput. This work utilizes an array of active cantilevers with embedded piezoresistive sensors and thermomechanical actuators, which allows simultaneous multi-cantilever operation in parallel operation for increased imaging throughput. When combined with large-range nano-positioners and proper control algorithms, each cantilever can be individually controlled to capture multiple AFM images. With data-driven post-processing algorithms, the images can be stitched together, and defect detection can be performed by comparing them to the desired geometry. This paper introduces principles of the custom AFM using the active cantilever arrays, followed by a discussion on practical experiment considerations for inspection applications. Selected example images of silicon calibration grating, highly-oriented pyrolytic graphite, and extreme ultraviolet lithography masks are captured using an array of four active cantilevers (&#34;Quattro&#34;) with a 125 &#181;m tip separation distance. With more engineering integration, this high-throughput, large-scale imaging tool can provide 3D metrological data for extreme ultraviolet (EUV) masks, chemical mechanical planarization (CMP) inspection, failure analysis, displays, thin-film step measurements, roughness measurement dies, and laser-engraved dry gas seal grooves.

Autor destacado: Introducción a la microscopía de fuerza atómica de sonda activa con matrices de voladizo cuattro-paralelo

Large-scale sample inspection with nanoscale resolution has a wide range of applications, especially for nanofabricated semiconductor wafers. Atomic force microscopes can be a great tool for this purpose, but are limited by their imaging speed. This work utilizes parallel active cantilever arrays in AFMs to enable high-throughput and large-scale inspections.

Microscopía de fuerza atómica de sonda activa con matrices en voladizo cuatór-paralelas para la inspección de muestras a gran escala de alto rendimiento

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. ...