Esta investigación fue financiada por la beca no. 0723341 (a KGL) de la Fundación Nacional de Ciencias. También estamos agradecidos por las contribuciones aportadas por el Programa de Becas de Pregrado Schapiro Investigación y el Departamento de Psicología de Randolph-Macon College. Finalmente, agradecemos las contribuciones de colaboración Craig Kinsley en esta investigación y ayudar a Amanda Rzucidlo en la preparación del laboratorio de I-MC para este artículo de vídeo.

1. Identificación del modelo animal <ol><li> El ratón ciervo California (Peromyscus californicus) es un modelo ideal para explorar las respuestas paternas. Como puede ver, este ratón novios a los cachorros al igual que las mamás hacer - incluso agacharse sobre ellos para que se vea como los cachorros son de enfermería. El comportamiento de los ratones en comparación con California es una especie del mismo género, el ratón ciervo común (Peromyscus maniculatus) que muestra poco interés en los cachorros, a menudo tratando de escapar o incluso atacarlas. (Ver Figura 1 para las fotos de estas especies que interactúan con los cachorros.) </li><li> Una vez que el modelo de las especies ha sido identificado entonces los distintos grupos deben ser establecidos. En este estudio, los padres biológicos, vírgenes sin experiencia en crianza de los hijos, y las vírgenes con una exposición limitada cachorro (cachorros expuestos o padres de crianza) de ambas especies se utilizan de modo que las características paternas tanto predispuesto y adquiridas pueden ser evaluados. En este estudio en particular que también están expuestos todos los grupos a un ratón de juguete cachorro para asegurar que las interacciones sociales son específicas de un cachorro y no una respuesta a la representante de cualquier cosa puesta en la jaula (ver Figura 2). </li><li> Antes de investigar los factores neurobiológicos, es importante para confirmar que las especies seleccionadas presentan claras diferencias en la conducta de interés. En este estudio, los hombres se colocan en una jaula con un cachorro de cinco minutos y un etograma conducta paterna (véase el cuadro 1, por ejemplo, de etograma) se utiliza para las conductas puntuación como la latencia de acercarse a la cría y la cantidad de tiempo pasado en contacto con el cachorro. Si se observan las respuestas agresivas, el cachorro se elimina inmediatamente. Estas sesiones suelen ser grabadas en vídeo por lo que un cuidadoso análisis de comportamiento puede ser llevado a cabo posteriormente. </li></ol> 2. Preparación de tejido cerebral <ol><li> Después de una perfusión normal de los ratones (protocolo adjunto), el cerebro se eliminan de manera que se puede seccionar en el área específica de interés (del cerebro muestran). </li><li> Un estándar de cerebro de ratón atlas (atlas muestra) se utiliza para localizar el núcleo paraventricular en el hipotálamo, un área conocida por ser rica en células que producen el neuropéptido de interés en este estudio - la vasopresina (AVP). </li><li> El cerebro es entonces bloqueada y se monta en un mandril de congelación para que el tejido se congela antes de ser seccionada con el microtomo. El cerebro está seccionado en un modo de recortar hasta puntos de referencia específicos se identifican, entonces el espesor específicas del cerebro y de 30 micrones, en este caso, se establece para las secciones de cerebro que se utilizan para el análisis. </li><li> Las secciones del cerebro son cuidadosamente colocadas en placas llenas de tampón fosfato salino (PBS); (protocolo de PBS adjunta, por favor, tenga en cuenta que esto es sólo un ejemplo de un protocolo de inmunocitoquímica estándar). </li></ol> 3. Inmunocitoquímica <ol><li> A lo largo de las distintas etapas de este proceso (véase el protocolo adjunto), es importante tener conocimientos precisos de pipeteo para asegurar mediciones precisas de los productos químicos y otros ingredientes importantes de esta técnica (pipeteado muestran los alumnos). </li><li> El primer paso en este proceso es el lavado de los cerebros que implica la sustitución de la PBS en los pocillos tres a cinco veces, entre cada lavado los platos y se colocan en un agitador durante 10 minutos (mostrar estudiante reemplazar PBS y la colocación de placas de rockeros) . </li><li> Los cortes de cerebro se exponen a la solución de anticuerpo primario y se almacenan a 4 ° C durante la noche en la mecedora (proceso de show). </li><li> Después de otro lavado, las rodajas de cerebro están expuestos a un anticuerpo secundario durante una hora en el agitador a temperatura ambiente, luego se lava de nuevo. </li><li> A continuación, el cerebro está expuesto a una solución compleja Avitin-biotina para prepararse para la visualización de las células neuroquímicos-positivo. </li><li> Para la etapa de visualización final, el cerebro está expuesto a DAB. Este es un producto peligroso y siempre debe ser manejado con precaución. Como se ve aquí, las rodajas de cerebro comienzan a llegar más oscuro ante sus ojos (mostrar el proceso). </li><li> Tras la exposición de DAB, el cerebro de pasar por la última serie de lavados y luego se colocan cuidadosamente en el microscopio subbed y se deja secar durante la noche (muestran la colocación de una porción del cerebro en un portaobjetos, ver archivo adjunto para el protocolo de diapositivas subbed). </li><li> Los portaobjetos se aclaró a través de una serie de lavados de agua destilada y alcohol, finalmente quedar sumergido en Citrosolv antes de ser cubreobjetos y se almacena en un Slidebox para su custodia (mostrar los distintos aspectos de este proceso, véase el documento adjunto para el proceso de compensación). </li></ol> 4. Neuroquantification <ol><li> Después de las diapositivas se han secado, pueden ser evaluados con un software especializado neuroquantification. Aquí Bioquant software se utiliza para cuantificar las células vasopresina-positivas y las fibras en el núcleo paraventricular del cerebro del ratón (mostrará el software en la pantalla ... y el microscopio). </li><li> El área específica de interés se identifica con las opciones de medicióndel software para establecer el campo visual para neuroquantification. Es importante que un tamaño uniforme del campo visual se cuantifica para cada animal (los estudiantes muestran cómo hacer esto). </li><li> Aquí la oscura manchada vasopresina-inmunorreactiva cuerpos de las células y las fibras son evidentes. Debido a que es difícil contar o rastrear este tejido, una característica especial de este software utiliza la luz de umbral para determinar la cantidad total de tejido con tinción positiva en el área específica de interés. Este umbral nos dice qué parte de la zona especificada contiene vasopresina tejido positivo (muestra el valor de los datos en la pantalla del ordenador). </li></ol> 5. Análisis del comportamiento <ol><li> Si más de un observador será anotar los videos, es importante para establecer confiabilidad entre los evaluadores para asegurar que los observadores están marcando el comportamiento de una manera consistente. Para la sesión de puntuación actual, una hoja de scoring de comportamiento debe estar preparado para permitir la fácil puntuación de la conducta durante las sesiones de observación (véase el cuadro 2, por ejemplo, la puntuación de hoja de cálculo). </li><li> Por conductas que no son rápidos respuestas episódica, un análisis de microsecuenciación puede revelar las sutilezas de la progresión de las respuestas específicas. Por ejemplo, el aseo comportamiento consiste en una cadena de respuestas muy rápidas. Aunque es una opción para grabar sólo la presencia y duración de la preparación, otro es el de documentar la cadena de acontecimientos que acompaña a esta respuesta. El uso de este software microsecuenciación, los observadores de puntuación de la presencia de un comportamiento particular en cada segundo, como lo solicite el software (software de demostración y de vídeo). </li><li> Tras la recogida de datos, los parámetros de interés se determinan y los resultados del comportamiento apropiado analizados. Ejemplos pueden ser la duración total del tiempo pasado en contacto con el cachorro, o el número de interrupciones en la secuencia de preparación (mostrar ordenador con hoja de cálculo con los datos introducidos por cada animal). </li><li> Una vez que la conducta se califica, es importante para confirmar que las dos especies exhiben diferentes estrategias de respuesta para la conducta de interés en el estudio. En este caso los ratones ciervo de California deben mostrar un comportamiento más paternal que los ratones ciervo común. Además, varias medidas del comportamiento pueden ser correlacionadas con las medidas del cerebro para obtener una visión más informada de las influencias relevantes. </li></ol> 6. Los resultados representativos: <ol><li> Para validar el modelo, los datos deben indicar claramente que las dos especies realiza de forma diferente con respecto a la conducta de interés. Aquí se ve que el P. hombres californicus pasado más tiempo de aseo y en cuclillas sobre los cachorros, dos señas de identidad de las respuestas paternas (ver Figura 4). </li><li> Con el fin de determinar si la variable de interés neurobiologial es importante en las respuestas paternas, la cantidad de vasopresina (AVP), tejido positivo se cuantificó por varias áreas cerebrales relevantes, como puede verse, el paternal P. animales californicus había tejido más inmunes positivos en varias de estas áreas del cerebro. (Ver Figura 5). </li><li> En un estudio relacionado con el análisis de microsecuenciación, se planteó la hipótesis de que los ratones paterna California se muestran menos ansiedad que sus homólogos de la Virgen, en consecuencia, cuando se expone al olor de un depredador, los padres mostraron menos interrupciones en la secuencia de preparación de los animales vírgenes (véase la Figura 6). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig1.jpg" /> Figura 1: (A) Hombre de California ratones con respuesta paterna hacia la misma especie alienígena cachorro. (B) ratón ciervo macho mostrando una actitud prudente (tramo de asistir) y la respuesta de evitación de la presencia de un extranjero cachorro misma especie. Nota: En estas evaluaciones la interacción social, si un varón presenta las respuestas agresivas hacia el cachorro, los experimentadores de inmediato golpeó la parte superior de la jaula para distraer a los hombres. En este momento se termina la sesión y el cachorro se retira, inspeccionada por cualquier herida y regresó a la madre. En nuestro laboratorio, esto rara vez se observa con P. californicus, pero los hombres se observa ocasionalmente con P. maniculatus, observación e intervención inmediata, sin embargo, evitar que se produzcan daños a los animales. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig2.jpg" /> Figura 2: Un ratón California interactuar con un ratón de juguete, la mayoría trató de masticar estos estímulos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig3.jpg" /> Figura 3: El diseño experimental del estudio, había alrededor de 6 animales en cada grupo para cada especie. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig4.jpg" /> Figura 4: Gráfico del proceso de inmunocitoquímica. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig5.jpg" /> HigoUre 5 respuestas Paternal en el California y los ratones ciervo;. respuestas más paternal (el novio, agacharse, más rápido de aproximación) se observaron en los ratones California. Más tramo asiste (respuesta al estrés) se observaron en los ratones de los ciervos. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig6.jpg" /> Figura 6. Inmunorreactividad vasopresina en distintas áreas cerebrales de ambas especies. Los ratones de California había más manchas en las células y las fibras de PVN. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig7.jpg" /> Figura 7: Paternal ratones California mostraron menos interrupciones en sus secuencias de limpieza en la presencia de olor de un depredador que los grupos de títeres expuestos y virgen.

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	<li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol.">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li><li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa.">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing.">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li><li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa:+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks,+mutagenesis+screens,+and+mouse+backcrosses.">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm.">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li><li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL/6+mice.">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization.">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li><li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates.">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li><li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing.">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li><li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity.">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li><li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserving,+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation.">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este artículo analiza tres componentes esenciales piensa que son críticos para la ejecución exitosa de las investigaciones del comportamiento neurociencia: (1) un modelo animal representativos y válidos, (2) un protocolo de inmunocitoquímica precisos y sensibles, y (3) la mayoría de los análisis (observación y estadística ) tanto de los datos sobre el comportamiento y el cerebro. Errores en una sola categoría con toda seguridad, comprometer los resultados de todo el estudio. Por lo tanto, después de una cuidadosa selección del modelo animal adecuado, un considerable esfuerzo debe dirigirse a la prueba piloto de los procedimientos conductuales e histológicos para asegurar que el comportamiento será fiable observados en el estudio, seguido por el tratamiento con éxito de los cerebros. Como se mencionó anteriormente, el uso de especies comparativo para identificar los mecanismos neurobiológicos de una respuesta particular es un enfoque metodológico valioso porque esta técnica no requiere de la ingeniería genética o dolorosas manipulaciones quirúrgicas. Por lo tanto, este enfoque metodológico utiliza menos amenazados, los animales intactos. El uso de las variaciones naturales de los animales, sin embargo, se ve reforzado por la incorporación de los recursos naturales-como los entornos, incluso si los animales se encuentran en el laboratorio. Además, si los estudios de laboratorio se puede extender al campo para validar la autenticidad de las diferencias entre especies en la conducta de interés, el siguiente paso es recomendable. Aunque el enfoque comparativo ofrece muchas ventajas, una limitación es el carácter correlativo de los datos y, en consecuencia, las técnicas adicionales, tales como las manipulaciones farmacológicas deben ser utilizados para validar aún más la función de objetivo sistemas neurobiológicos de la conducta de interés. Una vez que los experimentadores tener confianza en los procedimientos conductuales, histológicos y estadísticos, se debe tener cuidado para que las condiciones de vida de los animales se mantienen constantes para todos los grupos excepto, por supuesto, para la manipulación experimental. Cambios en variables tales como los horarios de luz, los niveles de ruido, los cuidadores, los niveles de humedad y los olores en el laboratorio podría tener efectos significativos en las respuestas de los animales neurobiológica. En este artículo, el anticuerpo primario se utilizó para la detección de la vasopresina, pero otros anticuerpos primarios se pueden utilizar para una gran cantidad de neurotransmisores diferentes de interés. Si el experimentador está trabajando con un nuevo anticuerpo, es importante llevar a cabo estudios de valoración para determinar la dilución óptima del anticuerpo nuevo. Muchas veces los anticuerpos se utiliza demasiado (según lo sugerido por el fabricante), lo que resulta en el tejido que está demasiado oscuro para distinguir la señal, además, el uso excesivo de los anticuerpos es muy caro. Por último, si hay más de un análisis estadístico solo se puede utilizar para proporcionar puntos de vista alternativos y las interpretaciones de los datos, que deben ser utilizados. En este estudio en particular, los modelos lineales generales, correlación y análisis de escalamiento multidimensional se utiliza para proporcionar los puntos de vista más informativo de los datos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Microscopio compuesto binocular </td><td> Motic </td><td> BA400 </td><td></td></tr><tr><td> La vida Bioquant Software Ciencia </td><td> Imagen Bioquant Analysis Corporation </td><td> Versión 8.40.20 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Microm </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex consola Easy Drive de carga L / S (bomba de perfusión) </td><td> Cole-Parmer Instrumento Empresa </td><td> 7518-00 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Celular Bueno Grupo Cultura (cultivo de tejidos tratados, apirógena poliestireno, estéril) </td><td> Corning Costar </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> Diapositivas 25x75x1mm microscopio </td><td> Globo de la Ciencia, Inc. </td><td> 1324W </td><td></td></tr><tr><td> 22x50mm No.1 cubreobjetos </td><td> Globo de la Ciencia, Inc. </td><td> 1414-1410 </td><td></td></tr><tr><td> No estéril 3 ml Graduado grandes pipetas de transferencia Bombilla </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 70962-9 </td><td> &amp;nbps; </td></tr><tr><td> Alconox detergente en polvo </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9888-1kg </td><td> CAS 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio monobásico </td><td> Espectro </td><td> SO130 </td><td> CAS 10049-21-5 </td></tr><tr><td> Fosfato sódico dibásico dihidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 30412 </td><td> CAS 10028-24-7 </td></tr><tr><td> Triton X </td><td> Espectro </td><td> TR135 </td><td> CAS 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Permount </td><td> Pescador </td><td> SP15-500 </td><td> CAS 108-88-3 </td></tr><tr><td> El cromo sulfato de potasio </td><td> Sigma </td><td> C-5926 </td><td> CAS 7788-99-0 </td></tr><tr><td> CitriSolv </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-143975 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol, Botellas Den.Poly alta, 200 pruebas, 24 x 1 litro </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200CSPP </td><td></td></tr><tr><td> Suero normal de cabra </td><td> Vector </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Conejo contra la vasopresina analito reactivos específicos </td><td> Immunostar, Inc. </td><td> 20069 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilado anti-conejo IgG (H + L) purificado por afinidad </td><td> Vector </td><td> BA-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Elite estándar Vectastain ABC Kit </td><td> Vector </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Peroxidasa DAB sustrato Kit </td><td> Vector </td><td> SK-4100 </td><td></td></tr><tr><td> Original de gelatina sin sabor (4-contar sobres) 1-oz caja </td><td> Knox </td><td></td><td> Compra en la tienda de comestibles </td></tr><tr><td> 3% de peróxido de hidrógeno </td><td> CareOne </td><td></td><td> Compra en farmacia local </td></tr><tr><td> Blanqueador </td><td> Clorox </td><td></td><td> Compra en la tienda de comestibles </td></tr></tbody></table>

using a comparative species approach to investigate the neurobiology of paternal responses

Uno de los objetivos de la neurociencia del comportamiento es identificar los factores neurobiológicos subyacentes que regulan los comportamientos específicos. El uso de modelos animales para lograr este objetivo, muchas de las estrategias metodológicas requieren técnicas invasivas para manipular la intensidad de la conducta de interés (por ejemplo, los métodos de la lesión, las manipulaciones farmacológicas, técnicas de microdiálisis, por ingeniería genética, modelos animales). La utilización de un enfoque comparativo de las especies permite a los investigadores para aprovechar de forma natural las diferencias en las estrategias de respuesta que existen en especies estrechamente relacionadas. En nuestro laboratorio, se utilizan dos especies del género Peromyscus que difieren en las respuestas paternas. El macho del ratón California ciervos (Peromyscus californicus) presenta las mismas respuestas los padres como de la hembra, mientras que su primo, el ratón ciervo común (Peromyscus maniculatus) presenta prácticamente ninguna respuesta crianza / padres en la presencia de las crías. De especial interés en este artículo es una exploración de los factores neurobiológicos asociados a las respuestas de afiliación social, exhibidas por el ratón venado paterna California. Debido a que el comportamiento enfoque de la neurociencia es multifacético, los siguientes componentes clave del estudio va a tratar brevemente: la identificación de especies apropiadas para este tipo de investigación, recopilación de datos para el análisis del comportamiento, la preparación y la sección del cerebro, los pasos básicos que intervienen en inmunocitoquímica para la cuantificación de la vasopresina-inmunoreactividad, el uso de la neuroimagen software para cuantificar el tejido cerebral, el uso de un análisis de vídeo microsecuenciación de puntuación de la conducta y, por último, los análisis estadísticos adecuados para proporcionar las interpretaciones más informado de los resultados de la investigación.

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Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

El enfoque comparativo permite neurocientíficos especie de comportamiento para explorar diversos factores neurobiológicos asociados con comportamientos específicos vistos como característica de un modelo animal específico. Aprovechando naturales diferencias de comportamiento entre especies estrechamente relacionadas, esta técnica no requiere técnicas invasivas para manipular la expresión de la conducta.

Con un enfoque comparativo de especies para la Investigación de Neurobiología de las respuestas Paternal

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K vistas.  Randolph-Macon College. El enfoque comparativo permite neurocientíficos especie de comportamiento para explorar diversos factores neurobiológicos asociados con comportamientos específicos vistos como característica de un modelo animal específico. Aprovechando naturales diferencias de comportamiento entre especies estrechamente relacionadas, esta técnica no requiere técnicas invasivas para manipular la expresión de la conducta.

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Grabaciones multielectrodo matriz del epitelio vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Investigación

Neurociencias

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Grabación de las respuestas de comportamiento a la reflexión en el cangrejo de río

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

La medición del valor subjetivo de las opciones arriesgado y ambiguo utilizando Economía Experimental y Métodos funcionales de resonancia magnética

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This complex behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. As in many organisms, previous fighting experience influences the fighting strategy of flies and the outcome of later contests: losing a fight increases the probability of losing later contests, revealing &#34;loser&#34; effects that likely involve learning and memory 2-4. The learning and memory that accompanies expression of complex social behaviors like aggression, is sensitive to pre-test handling of animals 5,6. Many experimental procedures are used in different laboratories to study aggression 7-9, however, no routinely used protocol that excludes handling of flies is currently available. Here, we report a new behavioral apparatus that eliminates handling of flies, using instead their innate negative geotactic responses to move animals into or out of fighting chambers. In this protocol, small circular fight arenas containing a food cup are divided into two equal halves by a removable plastic slider prior to introduction of flies. Flies enter chambers from their home isolation vials via sliding chamber doors and geotaxis. Upon removal of plastic sliders, flies are free to interact. After specified time periods, flies are separated again by sliders for subsequent experimentation. All of this is done easily without handling of individual flies. This apparatus offers a novel approach to study aggression and the associated learning and memory, including the formation of &#34;loser&#34; effects in fly fights. In addition, this new general-purpose behavioral apparatus can be employed to study other social behaviors of flies and should, in general, be of interest for investigating experience-related changes in fundamental behavioral processes.

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the &quot;Loser&quot; Effect in Drosophila melanogaster

During fruit fly fights, the behavioral patterns observed, fight dynamics, and associated learning and memory are influenced by experimental conditions. The protocol presented here describes a novel procedure that entirely eliminates handling of flies during experiments. This improves fight dynamics and allows formation of strong &#34;loser&#34; effects.

Un nuevo enfoque que elimina el manejo para el estudio de la agresión y el efecto &quot;Loser&quot; en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

Raya de ensayo para estudiar la actividad de atracción o repulsión de un sustrato de proteína usando las neuronas del hipocampo disociadas

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel Behavioral Ensayo para investigar las respuestas gustativas de individual, libre de movimiento abejorros (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...