מחקר זה מומן על ידי מענק לא. 0723341 (כדי KGL) מן הקרן הלאומית למדע. גם אנחנו אסירי תודה על התרומות הניתנים על ידי תוכנית מחקר לתואר ראשון שפירו אחוות והמחלקה לפסיכולוגיה באוניברסיטת רנדולף, מייקון קולג&#39;. לבסוף, אנו מעריכים את תרומתו שיתופי קרייג של קינסלי במחקר זה ולעזור אמנדה Rzucidlo בהכנת R-MC מעבדה במאמר זה וידאו.

1. זיהוי דגם של בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר הצבאים קליפורניה (Peromyscus californicus) הוא מודל אידיאלי לחקור התגובות אבהי. כפי שאתם רואים, העכבר הזה החתנים את הגורים בדיוק כמו האמהות לעשות - הם אפילו להתכופף מעליהם, כך זה נראה כמו גורים הם אבות. התנהגותם של עכברים קליפורניה לעומת מינים של הסוג אותו, את העכבר צבי משותף (Peromyscus maniculatus) אשר מציג עניין מועט גורים, לעתים קרובות מנסה לברוח או אפילו לתקוף אותם. (ראה תרשים 1 לתמונות של מינים אלה אינטראקציה עם הגורים.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מודל מינים זוהה לאחר מכן הקבוצות השונות צריכים להיות מבוססים. במחקר זה, אבות ביולוגיים, בתולות ללא ניסיון הורות, ואת בתולות עם חשיפה מוגבלת הגור (הגור חשוף או אבות אומנת) של שני המינים משמשים כך מאפיינים מצד שני נטייה ורכש ניתן להעריך. במחקר זה בפרט אנו נחשפים גם כל הקבוצות עכבר צעצוע הגור כדי להבטיח את האינטראקציות החברתיות היו ספציפיים בתגובה גור ולא נציג לכל דבר להציב בכלוב (ראה תרשים 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני חקירת גורמי הנוירוביולוגי, חשוב לוודא מינים שנבחרו להציג הבדלים ברורים בהתנהגות של עניין. במחקר זה, גברים ממוקמות בתוך כלוב עם גור במשך חמש דקות ethogram התנהגות אבהית (ראה לוח 1 למשל של ethogram) משמש ציון התנהגויות כגון חביון הגישה הגור ואת כמות הזמן המושקע במגע עם הגור. אם התגובות אגרסיבי הם נצפו, גור הוא הסיר מיד. מפגשים אלה הם צילמו לעתים קרובות כל כך ניתוח התנהגות זהירה ניתן לבצע לאחר מכן. </li></ol> 2. הכנת רקמת המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זלוף סטנדרטי של כל עכבר (פרוטוקול מצורף), המוח מוסרים, כך שהם יכולים להיות מחולק באזור מסוים של ריבית (מוח מראות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר סטנדרטי אטלס המוח (הצג אטלס) משמש כדי לאתר את גרעין paraventricular בהיפותלמוס, אזור הידוע להיות עשיר בתאי ייצור neuropeptide עניין במחקר זה - הווסופרסין (AVP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הוא חסום אז רכוב על צ&#39;אק הקפאת כך הרקמה יקפא לפני שהוא מחולק עם microtome. המוח מחולק במצב לקצץ עד ציוני ספציפיים מזוהים, אז עובי מוח ספציפיים, 30 מיקרון במקרה הזה, מוגדר בסעיפים המוח המשמשים לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקים במוח ממוקמים בזהירות צלחות טוב מלא חיץ מלוחים פוספט (PBS); (פרוטוקול עבור PBS המצורפת; שים לב כי זוהי רק דוגמה אחת של פרוטוקול immunocytochemistry סטנדרטי). </li></ol> 3. Immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השלבים השונים של תהליך זה (ראה פרוטוקול מצורף), חשוב כישורים pipetting מדויק כדי להבטיח מדידות מדויקות של כימיקלים וחומרי גלם אחרים חשובה הטכניקה הזו (סטודנט pipetting להראות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצעד הראשון בתהליך זה הוא שטיפת מוח הכוללת החלפת PBS את צלחות גם שלוש עד חמש פעמים, בין לשטוף את הצלחות כל טוב מונחות על כיסא נדנדה במשך 10 דקות (הצג סטודנט החלפת PBS והצבת לוחות היטב על נדנדה) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות המוח נחשפים אז לפתרון נוגדן ראשוני המאוחסן ב 4 ° C במשך הלילה על הנדנדה (תהליך להראות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לשטוף אחר, פרוסות המוח נחשפים נוגדנים משני במשך שעה אחת על הנדנדה בטמפרטורת החדר, לשטוף שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא המוח נחשפים פתרון Avitin-ביוטין קומפלקס להתכונן להדמיה של neurochemical חיובי תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור השלב הסופי להדמיה, המוח נחשפים DAB. זהו מוצר מסוכנים תמיד צריך להיות מטופל בזהירות. כפי שראינו כאן, פרוסות המוח מתחילים לקבל כהה מול העיניים (הצג התהליך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות החשיפה DAB, המוח לעבור סדרת האחרון של שוטף והם מכן הניח בזהירות על שקופיות מיקרוסקופ לספסל ואיפשר לו להתייבש במשך הלילה (להראות את המיקום של פרוסת המוח בשקופית, ראה פרוטוקול מצורף עבור שקופיות לספסל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקופיות נמחקים אז דרך סדרה של מים מזוקקים שוטף ואלכוהול, סוף סוף להיות שקוע Citrosolv בטרם coverslipped ומאוחסנים slidebox למשמרת (הצג את ההיבטים השונים של התהליך הזה, ראו קובץ מצורף על תהליך ניקוי). </li></ol> 4. Neuroquantification <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השקופיות התייבשו, הם יכולים להעריך עם תוכנת neuroquantification מיוחדים. הנה תוכנה Bioquant משמש לכמת את הווסופרסין חיובי תאים וסיבים בגרעין paraventricular של מוח עכבר (הצג התוכנה על המסך ... ואת המיקרוסקופ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזור מסוים של עניין מזוהה באמצעות אפשרויות המדידההתוכנה להקים את שדה הראייה עבור neuroquantification. חשוב גודל עקבי שדה הראייה היא לכמת עבור כל חיה (תלמיד להראות עושה את זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן מוכתם בקדרות הווסופרסין-immunoreactive גופי התא וסיבים ניכרות. מאחר שקשה לספור או לעקוב אחר זו רקמה, תכונה מיוחדת של תוכנה זו משתמשת thresholding אור כדי לקבוע את הסכום הכולל של רקמה צבעונית חיובי בתחום מסוים של ריבית. Thresholding זה אומר לנו כמה האזור שצוין הכלול הווסופרסין חיובי רקמות (להראות את הערך נתונים על מסך המחשב). </li></ol> 5. ניתוח התנהגותי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אחד או יותר של הצופה תהיה מניה קלטות, חשוב להקים בין rater אמינות להבטיח כי המשקיפים הם הבקיע את ההתנהגות באופן עקבי. במשך הפגישה הבקיע בפועל, גיליון הניקוד התנהגות צריכים להיות מוכנים, כדי לאפשר ניקוד קל של התנהגות במהלך הפגישות תצפית (ראה טבלה 2 למשל של מניה בגיליון האלקטרוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור התנהגויות שאינן התגובות אפיזודי מהירה, ניתוח microsequencing יכול לחשוף דקויות על התקדמות של תגובות ספציפיות. לדוגמה, טיפוח התנהגות מורכבת שרשרת של תגובות מהר מאוד. למרות אפשרות אחת היא פשוט להקליט את נוכחות ומשך הטיפוח, אחרת היא לתעד את השתלשלות האירועים המלווים את התגובה הזאת. באמצעות תוכנה זו microsequencing, משקיפים ציון נוכחות של התנהגות מסוימת בכל שנייה, כפי שתתבקש על ידי התוכנה (תוכנה להראות ווידאו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף נתונים, פרמטרים של עניין נקבעים ואת עשרות התנהגות המתאימה מנותחים. דוגמאות ניתן משך הזמן המושקע הכולל של במגע עם הגור, או מספר הפרעות ברצף הטיפוח (להראות מחשב עם גיליון התפשטות עם הנתונים שהוזנו עבור כל חיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התנהגות הבקיע חשוב מאשרים כי שני מינים הציג אסטרטגיות תגובה שונות להתנהגות של עניין במחקר. במקרה זה העכברים צבי קליפורניה צריך להפגין התנהגות אבהית יותר מאשר עכברים צבי משותף. בנוסף, אמצעים התנהגותיים שונים יכולים להיות מתואמים עם אמצעים המוח כדי לקבל תצוגה מושכלות יותר של השפעות הרלוונטיים. </li></ol> 6. נציג תוצאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאמת את המודל, הנתונים צריכים עולה בבירור כי שני המינים שונה ביצע לגבי התנהגות של עניין. כאן תוכלו לראות כי פ הזכרים californicus בילו זמן רב יותר הטיפוח ואת כורעת על הגורים, שני סימני ההיכר של התגובות אבהי (ראה תרשים 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לקבוע אם המשתנה neurobiologial עניין חשוב בתגובות אבהי, כמות הווסופרסין (AVP) חיובי רקמות היה לכמת עבור מספר אזורים במוח הרלוונטיים; כפי שניתן לראות, פ אבהי בעלי חיים californicus היה רקמת יותר החיסונית חיובי בכמה אזורים אלה במוח. (ראה איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחקר קשור באמצעות ניתוח microsequencing, זה היה שיערו כי האב עכברים קליפורניה היו מפגינים חרדה פחות מאשר עמיתיהם בתולה שלהם, ולפיכך, כאשר הם נחשפים ריח טורף, האבות הפגינו פחות הפרעות ברצף הטיפוח מאשר החיות בתולה (ראה תרשים 6). </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig1.jpg" /> איור 1: (א) זכר עכברים קליפורניה מציג תגובות אבהי כלפי הגור זר conspecific. (ב) עכבר צבי זכר מציג גישה זהירה (מתיחה להשתתף) ותגובת הימנעות בנוכחות זר conspecific הגור. הערה: הערכות אלה אינטראקציה חברתית, אם גבר מפגין תגובות אגרסיביות כלפי הגור, הנסיינים מיד להכות את החלק העליון של הכלוב כדי להסיח את דעתם של גברים. בשלב זה הפגישה מסתיימת ואת הגור מוסר, נבדק עבור כל הפצעים וחזר האם. במעבדה שלנו, זה רק לעתים נדירות הוא ציין עם פ הזכרים californicus אבל מדי פעם הוא ציין עם פ maniculatus; תצפית קרובה התערבות מיידית, עם זאת, למנוע את התרחשות הנזק לבעלי החיים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig2.jpg" /> איור 2: עכבר קליפורניה אינטראקציה עם עכבר צעצוע, רוב ניסה ללעוס גירויים אלה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig3.jpg" /> איור 3: עיצוב ניסיוני של המחקר, היו כ 6 חיות בכל קבוצה עבור כל מין. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig4.jpg" /> איור 4: גרפי של תהליך immunocytochemistry. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig5.jpg" /> תאנהיור 5 תגובות אבהי קליפורניה ועכברים צבי;. התגובות אבהי יותר (החתן, לכרוע, גישה מהירה יותר) נצפו עכברים קליפורניה. למתוח עוד משתתפת (תגובת הלחץ) נצפו עכברים צבי. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig6.jpg" /> איור 6. Immunoreactivity וזופרסין באזורי מוח שונים של שני המינים. העכברים קליפורניה היה מכתים יותר בתאי PVN וסיבים. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig7.jpg" /> איור 7: אבי האב עכברים קליפורניה הציג שיבושים פחות רצפים הטיפוח שלהם בנוכחות של ריח טורף מאשר הקבוצות הגור, חשוף בתולה.

<ol>
	<li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol.">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li><li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa.">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing.">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li><li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa:+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks,+mutagenesis+screens,+and+mouse+backcrosses.">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm.">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li><li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL/6+mice.">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization.">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li><li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates.">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li><li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing.">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li><li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity.">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li><li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserving,+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation.">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מאמר זה דן שלושה מרכיבים חיוניים חשב להיות קריטי עבור ביצוע מוצלח של התנהגות חקירות מדעי המוח: (1) מודל החיה נציג תקף; (2) פרוטוקול immunocytochemistry מדויק ורגיש; ו (3) ניתוח ביותר (תצפית סטטיסטית ) של שני הנתונים התנהגות המוח. טעויות בקטגוריה אחת יהיה בהחלט לסכן את התוצאות של המחקר כולו. לפיכך, לאחר בזהירות בבחירת מודל בעל חיים מתאים, מאמץ ניכר צריכה להיות מופנית כלפי הטייס בודק את נהלי התנהגות היסטולוגית כדי להבטיח את התנהגותם יקויימו אמין במחקר, ואחריו עיבוד מוצלח של המוח. כפי שהוזכר קודם לכן, השימוש מינים השוואתי לזהות מנגנוני הנוירוביולוגי התגובה מסוים הוא גישה מתודולוגית יקר כי טכניקה זו אינה דורשת הנדסה גנטית או מניפולציה כירורגית כואבת. לכן, זו הגישה המתודולוגית מנצל פחות מאוים, בעלי חיים שלמים. השימוש וריאציות הטבעי של החיות, לעומת זאת, מתחזקת על ידי שילוב של סביבות טבעיות, כמו גם אם הם שוכנו חיות במעבדה. יתר על כן, אם במחקרי מעבדה ניתן להרחיב את השדה כדי להמשיך לאמת את האותנטיות של הבדלי המינים בהתנהגות של עניין, הצעד הבא זה מומלץ. למרות גישה השוואתית מציע יתרונות רבים, מגבלה טבעו המתאם של הנתונים, וכתוצאה מכך, טכניקות נוספות כגון מניפולציות תרופתי צריך לשמש נוספת לאמת את התפקיד של מערכות הנוירוביולוגי ממוקד התנהגות של עניין. לאחר הנסיינים מרגיש בטוח לגבי הנהלים התנהגותיים, היסטולוגית ו סטטיסטית, יש להיזהר כך את תנאי המחיה של בעלי החיים נשארים קבועים לכל הקבוצות למעט, כמובן, עבור מניפולציה הניסוי. שינויים במשתנים כגון לוחות זמנים של אור, רמות רעש, מטפלים, רמות לחות וריחות במעבדה יכולה להיות השפעה משמעותית על התגובות הנוירוביולוגי של החיות. במאמר זה הנוגדן העיקרי ששימש לצורך זיהוי של הווסופרסין אבל נוגדנים ראשוניים אחרים יכולים לשמש שפע של neurochemicals שונים של עניין. אם הניסוי עובד עם נוגדן חדש, חשוב לבצע מחקרים על מנת לקבוע את טיטרציה דילול אופטימלי של הנוגדן החדש. פעמים רבות נוגדן רב מדי משמש (כפי שהוצע על ידי הספק), וכתוצאה מכך רקמה כהה מדי כדי לבדל את האות; יתרה מזאת, שימוש מופרז הנוגדן הוא יקר מאוד. לבסוף, אם יותר מאשר ניתוח סטטיסטי יחיד יכול לשמש כדי לספק בתצוגות חלופיות ופירושים של הנתונים, הם צריכים להיות מנוצל. במחקר זה בפרט, הכללית מודלים ליניאריים, מתאמי, ומנתח דרוג ממדי שימשו כדי לספק תצוגות אינפורמטיבי ביותר של הנתונים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מתחם המשקפת מיקרוסקופ </td><td> Motic </td><td> BA400 </td><td></td></tr><tr><td> החיים BIOQUANT המדע תוכנה </td><td> תמונה BioQuant ניתוח Corporation </td><td> גרסה 8.40.20 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Microm </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex מסוף כונן Easy-Load L / S (משאבה זלוף) </td><td> קול, בן הזוג Instrument החברה </td><td> 7518-00 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Cell ובכן תרבות Cluster (בתרבית רקמה מטופלים; לא זועמת קלקר, סטרילי) </td><td> קורנינג שחקן המשנה </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope שקופיות 25x75x1mm </td><td> גלובוס מדעיים, Inc </td><td> 1324W </td><td></td></tr><tr><td> 22x50mm No.1 פליטת כיסוי </td><td> גלובוס מדעיים, Inc </td><td> 1414-1410 </td><td></td></tr><tr><td> Non-סטרילי 3mL בוגר גדול העברת pipettes Bulb </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 70962-9 </td><td> &amp;nbps; </td></tr><tr><td> Alconox אבקת דטרגנט </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן כלוריד </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S9888-1 ק&quot;ג </td><td> CAS 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Monobasic סודיום פוספט </td><td> ספקטרום </td><td> SO130 </td><td> CAS 10049-21-5 </td></tr><tr><td> סודיום פוספט Dibasic Dihydrate </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 30412 </td><td> CAS 10028-24-7 </td></tr><tr><td> טריטון X </td><td> ספקטרום </td><td> TR135 </td><td> CAS 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Permount </td><td> דיג </td><td> SP15-500 </td><td> CAS 108-88-3 </td></tr><tr><td> כרום סולפט האשלגן </td><td> סיגמא </td><td> C-5926 </td><td> CAS 7788-99-0 </td></tr><tr><td> CitriSolv </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 22-143975 </td><td></td></tr><tr><td> , אתנול גבוהה Den.Poly בקבוקים, 200 הוכחה, 24 ליטר 1 x </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200CSPP </td><td></td></tr><tr><td> עיזים רגיל סרום </td><td> וקטור </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> הארנב נגד הווסופרסין אנליטי ספציפי מגיב </td><td> Immunostar, Inc </td><td> 20069 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated נגד ארנב IgG (H + L) זיקה-מטוהרים </td><td> וקטור </td><td> BA-1000 </td><td></td></tr><tr><td> עלית רגיל Vectastain ABC Kit </td><td> וקטור </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> התשתית DAB peroxidase Kit </td><td> וקטור </td><td> SK-4100 </td><td></td></tr><tr><td> לטין Unflavored מקורי (4-לספור מעטפות) 1 עוז תיבת </td><td> נוקס </td><td></td><td> רכישה בחנות המכולת המקומית </td></tr><tr><td> מימן פראוקסיד 3% </td><td> CareOne </td><td></td><td> הרכישה בבית המרקחת המקומי </td></tr><tr><td> מלבין </td><td> Clorox </td><td></td><td> רכישה בחנות המכולת המקומית </td></tr></tbody></table>

using a comparative species approach to investigate the neurobiology of paternal responses

המטרה של מדעי המוח ההתנהגותיים היא לזהות גורמים הנוירוביולוגי הבסיסית המווסתים התנהגויות מסוימות. שימוש במודלים של בעלי חיים כדי להשיג מטרה זו, אסטרטגיות מתודולוגיים רבים דורשים טכניקות פולשניות כדי לתפעל את עוצמת ההתנהגות של עניין (למשל, שיטות הנגע, מניפולציות תרופתי, טכניקות microdialysis, מהונדסים גנטית בבעלי חיים). ניצול הגישה זן השוואתית מאפשר לחוקרים לנצל טבעי ההבדלים באסטרטגיות בתגובה הקיימים מינים קרובים. במעבדה שלנו, אנו משתמשים שני מינים של הסוג Peromyscus שונים בתגובות אבהי. עכבר צבי זכר קליפורניה (Peromyscus californicus) מציג את התגובות של ההורים כמו הנקבה בעוד בן דודו שלו, את העכבר צבי משותף (Peromyscus maniculatus) מוצגים כמעט ללא תגובות וטיפוח / הורים בנוכחות של גורים. עניין ספציפי במאמר זה הוא חקר הגורמים הנוירוביולוגי הקשורים התגובות החברתיות affiliative הוצגו על ידי העכבר קליפורניה אבהי צבי. בגלל הגישה ההתנהגותית המוח הוא רב פנים, מרכיבים את המפתח הבא של המחקר יטופלו בקצרה: זיהוי של זנים המתאימים לסוג זה של מחקר, איסוף נתונים לניתוח התנהגותי; הכנה חתך של המוח; הצעדים הבסיסיים המעורבים immunocytochemistry עבור כימות immunoreactivity-הווסופרסין, שימוש בתוכנות הדמייה לכמת את רקמת המוח, שימוש בניתוח וידאו microsequencing להבקיע התנהגות, ולבסוף, ניתוחים סטטיסטיים מתאימים כדי לספק את הפירושים הודיע ​​ביותר של ממצאי המחקר.

Watch this Scientific Journal Video about Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses at JoVE.com

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

הגישה מינים השוואתי מאפשר מדעני מוח התנהגותיים לחקור הנוירוביולוגי גורמים שונים הקשורים התנהגויות מסוימות כאל מאפיין של הדגם בעל חיים מסוים. ניצול טבעי ההבדלים בהתנהגות בין מינים קרובים, טכניקה זו אינה דורשת טכניקות פולשניות כדי לתפעל את הביטוי של התנהגות.

באמצעות גישה המינים השוואתי לחקירת לנוירוביולוגיה התגובות של אבי האב

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

using-comparative-species-approach-to-investigate-neurobiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Views.  Randolph-Macon College. הגישה מינים השוואתי מאפשר מדעני מוח התנהגותיים לחקור הנוירוביולוגי גורמים שונים הקשורים התנהגויות מסוימות כאל מאפיין של הדגם בעל חיים מסוים. ניצול טבעי ההבדלים בהתנהגות בין מינים קרובים, טכניקה זו אינה דורשת טכניקות פולשניות כדי לתפעל את הביטוי של התנהגות.

Video: Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

מערך Multielectrode הקלטות של האפיתל Vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

הקלטה תגובות התנהגותיות כדי השתקפות של סרטן הנהרות

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

מדידת הערך סובייקטיבי של אפשרויות מסוכנות ושנויות במחלוקת באמצעות כלכלה ניסויית ושיטות MRI פונקציונליות

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

Photostimulation לייזר לסריקת של מעגלים מוח קדמי ממוקדים Optogenetically

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This complex behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. As in many organisms, previous fighting experience influences the fighting strategy of flies and the outcome of later contests: losing a fight increases the probability of losing later contests, revealing &#34;loser&#34; effects that likely involve learning and memory 2-4. The learning and memory that accompanies expression of complex social behaviors like aggression, is sensitive to pre-test handling of animals 5,6. Many experimental procedures are used in different laboratories to study aggression 7-9, however, no routinely used protocol that excludes handling of flies is currently available. Here, we report a new behavioral apparatus that eliminates handling of flies, using instead their innate negative geotactic responses to move animals into or out of fighting chambers. In this protocol, small circular fight arenas containing a food cup are divided into two equal halves by a removable plastic slider prior to introduction of flies. Flies enter chambers from their home isolation vials via sliding chamber doors and geotaxis. Upon removal of plastic sliders, flies are free to interact. After specified time periods, flies are separated again by sliders for subsequent experimentation. All of this is done easily without handling of individual flies. This apparatus offers a novel approach to study aggression and the associated learning and memory, including the formation of &#34;loser&#34; effects in fly fights. In addition, this new general-purpose behavioral apparatus can be employed to study other social behaviors of flies and should, in general, be of interest for investigating experience-related changes in fundamental behavioral processes.

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the &quot;Loser&quot; Effect in Drosophila melanogaster

During fruit fly fights, the behavioral patterns observed, fight dynamics, and associated learning and memory are influenced by experimental conditions. The protocol presented here describes a novel procedure that entirely eliminates handling of flies during experiments. This improves fight dynamics and allows formation of strong &#34;loser&#34; effects.

גישה חדשה שמבטל טיפול לחקר תוקפנות והשפעת &quot;לוזר&quot; ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

Assay רומן ההתנהגות לחקור תגובות Gustatory של הפרט, חופשי-נע דבורים Bumble (<em&gt; בומבוס האדמה</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...