XHP ha sido apoyado por el Instituto Nacional de Salud (NIH) subvenciones del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIHK01AG024496) y el Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NIHR21HD056530).

1. Solución y preparación de los medios de comunicación <ol><li> Solución de revestimiento de gelatina: 0,1% (w / v) de gelatina en ddH2O, autoclave y se almacena a 4 º C. </li><li> Matrigel recubrimiento soluciones. Solución de archivo: lento deshielo Matrigel (10 ml) a 4 ° C durante la noche, añadir 10 ml de helado de DMEM o DMEM/F12, mezclar bien y alícuota de 1 ml / tubo por debajo de campana esterilizada cultivo de tejidos, almacenar a -20 ° C. Solución de trabajo: descongelación lenta 1 ml alícuota Matrigel a 4 ° C durante 1-2 horas, la transferencia de 14 ml DMEM frío o DMEM/F12 y mezcle bien bajo campana de cultivo de tejidos esterilizados inmediatamente antes del revestimiento. </li><li> Humanos laminina solución de recubrimiento: diluir 1 ml de solución humana laminina (0,5 mg / ml en Tris Buffered NaCl, almacenar a -80 ° C, descongelación lenta a 4 ° C durante 1-2 horas) con helado de DMEM o DMEM/F12 a 12,5 ml de solución de trabajo (40 pg / ml) bajo campana de cultivo de tejidos esterilizados inmediatamente antes del revestimiento. </li><li> El crecimiento de las soluciones madre de los factores (500-1000X): disolver el factor de crecimiento de 10 mg/ Ml en tampón esterilizada (0,5% de BSA, 1,0 mM DTT, 10% de glicerol, 1XPBS) y almacenar desde 50 hasta 100 l / tubo de alícuotas a -80 ° C. </li><li> Los medios de comunicación HESC: DMEM/F12 o KO-DMEM (80%), KO reemplazo de suero (20%), L-alanil-L-gln o L-Gln (2 mM), MEM aminoácidos no esenciales (MNAA, 1X), y β-mercaptoetanol (100 M), se filtra y se almacena a 4 ° C, suplementado con 20 ng / ml de bFGF antes de su uso. O sustitución de &quot;KO reemplazo de suero&quot;, con los componentes definidos: DMEM/F12 o KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln o L-Gln (2 mM), MNAA (1X), MEM aminoácidos esenciales (MEAA , 1X), y β-mercaptoetanol (100 M), se filtra y se almacena a 4 ° C, complementados con bFGF (20 ng / ml), la insulina humana (20 mg / ml), ácido ascórbico (50 mg / ml), humanos activina A (50 ng / ml), la albúmina humana / Albumax (10 mg / ml), y la transferrina humano (8 mg / ml) antes de su uso. </li><li> Los medios de comunicación HESC cardiaca diferenciación: DMEM/F12 (90%), FBS definido (10%), y L-alanil-L-Gln o L-gln (2 mM). </li><li> Medios que contienen nicotinamida (NAM): añadir NMañana a los medios de comunicación o los medios de comunicación HESC HESC cardiaca diferenciación a la concentración final de 10 mM, se filtra, se almacena a 4 º C y utilizar dentro de 2 semanas de preparación. </li></ol> 2. Placa de recubrimiento <ol><li> Placas de capa con la gelatina: añadir 2,5 ml / pocillo de solución de gelatina al 6 placas e incubar durante la noche en un 37 ° C humidificado incubadora. </li><li> Placas de capa con la laminina: chill recubiertos de gelatina y remover las placas de gelatina, añadir 2,5 ml / solución de revestimiento de laminina y Matrigel o humanos que trabajan para pre-enfriado gelatinizado placas de 6 pocillos y se incuba a 4 ° C durante la noche. </li></ol> 3. Pases y siembra hESCs indiferenciado bajo condiciones definidas <ol><li> Permita que las colonias de células madre crecen hasta 5-7 días de edad, y tener la placa de células madre a la cultura de microscopio de disección (pre-calentar la disección de la etapa a 37 ° C) por debajo de la disección de campana esterilizada. </li><li> Seleccione colonias células madre se dividan. Morfológicamente, estas colonias deben tener&gt; 75% hESCs indiferenciada (smtodas las células compactas), por lo general ligeramente opaca (no blanca amontonada células no, claro-las células diferenciadas), con borde definido bajo el microscopio de disección. Cuidado esquema de las colonias seleccionadas y eliminar la capa de fibroblastos diferenciados que rodea la colonia y todas las partes diferenciadas (si existe) de la colonia con el borde de la punta P2 pipeta o tirado capilares de vidrio. </li><li> Retire el papel viejo que contenga flotante células diferenciadas separadas por aspiración. Lavar con los medios de comunicación células madre (sin bFGF) una vez. Añadir 3 ml / media células madre y fresco que contiene 20 ng / ml de bFGF. </li><li> Cortar las colonias células madre indiferenciadas en trozos pequeños, y separar con la punta de pipeta estéril o un vaso tirado capilar. </li><li> Piscina los medios de comunicación que contiene piezas sueltas de colonias en un tubo cónico de 50 ml. Lavar la placa una vez con 1 ml / medios de comunicación, así células madre que contiene 20 ng / ml de bFGF y la piscina juntos. </li><li> Aspirar la solución de Matrigel o laminina humanos de las nuevas placas recubiertas. Alícuota de 4 ml / h, asíESC medios de comunicación que contiene piezas de colonia a una placa de 6 pocillos. Suavemente la placa de transferencia a la incubadora sin agitar y permitir que la colonia de semillas piezas durante la noche sin molestar a humidificado en una incubadora a 37 ° C con una atmósfera de 5% de CO 2. </li></ol> 4. Inducción cardíaca de hESCs el marco del Sistema de cultivo definido con Nicotinamida <ol><li> En el día 3 después de la siembra, eliminar la mayor parte de los antiguos medios de cada pocillo de la placa y dejar los medios de comunicación suficiente para permitir que las colonias de células madre que se sumerge (nunca permita que hESCs se seque). Reemplazar con 4 ml / media células madre y fresco que contiene 20 ng / ml de bFGF y 10 mM de nicotinamida (NOAL). </li><li> Reemplazar los viejos medios con los medios de células madre fresco que contiene 20 ng / ml de bFGF y 10 mM NOAL cada dos días, y permitir cardiaca inducida por las colonias de células madre crecen hasta 80-10 días. Al exponer a los NOAL, todas las células dentro de la colonia va a sufrir cambios de la morfología de grandes células diferenciadas que se siguen multiplicando. Las colonias aumentarán de tamaño, y por 80-10 días, und células se empiezan a acumularse en algunas zonas de las colonias. </li></ol> 5. La diferenciación continua cardíaco en cultivo en suspensión <ol><li> Tome la placa de células madre a la cultura de microscopio de disección (pre-calentar la disección de la etapa a 37 ° C) por debajo de la disección de campana esterilizada. Cuidado esquema de las colonias y retirar la capa de fibroblastos que rodean la colonia (las células diferenciadas emigraron de la colonia) con el borde de la punta P2 pipeta estéril o se tira capilar de vidrio. </li><li> Eliminar los viejos medios que contienen células de fibroblastos flotante desprendido por aspiración. Lavar con los medios de comunicación células madre (sin bFGF) una vez. Añadir 3 ml / medios de comunicación y nuevas células madre (sin bFGF). </li><li> Cortar las colonias células madre cardiacas inducidas en trozos pequeños, y separar con la punta de pipeta estéril o un vaso tirado capilar. </li><li> Piscina los medios de comunicación que contiene piezas sueltas de colonias en un tubo cónico de 50 ml. Lavar la placa una vez con 1 ml / medios de comunicación y células madre (sin bFGF) y la piscina juntos. </li><li> Alícuota de 4 ml / y medio libre de suero células madre que contiene piezas de colonias en una placa de ultra bajo de 6 pocillos y se incuban en apego a 37 ° C humidificado incubadora para permitir la flotación grupos celulares (cardioblastos) para formar durante 4-5 días. </li></ol> 6. Vencer a la maduración de los cardiomiocitos en Cultura fenotipo adhesivo <ol><li> Piscina los medios de comunicación que contiene cardioblastos flotante en un tubo cónico de 50 ml. Centrifugar a 1400 rpm durante 5 min. Aspirar los medios de comunicación antiguos como todo lo que pueda y agregue la misma cantidad de células madre a los medios de comunicación fresca diferenciación cardiaca que contiene 10 mM NAM. </li><li> Pipeta de arriba a abajo para mezclar cardioblastos flotante y alícuota de 4 ml / pocillo para placas de 6 pocillos. La transferencia de las placas a un 37 ° C humidificado incubadora para permitir que cardioblastos adjuntar toda la noche. </li><li> Vuelva a colocar los medios de comunicación células madre cardíacas diferenciación que contiene 10 mM NOAL cada dos días. </li><li> En el día 8, reemplace con los medios de células madre sin diferenciación cardíaca NAM, y continúan reemplazando a HESC cardiaca diferenciación de los medios de comunicación eotro día. Cardiomiocitos golpes comenzarán a aparecer en alrededor de 1-2 semanas de cultivo continuo después de la retirada de los NOAL y el incremento en el número con el tiempo, y podría mantener las contracciones fuertes y rítmicas durante más de 3 meses. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Nicotinamida (NOAL) se vuelve suficiente para inducir hESCs mantiene en el sistema de cultivo definido para la transición de la pluripotencia exclusivamente a un fenotipo cardiomesodermal (Fig. 2B). Tras la exposición de hESCs indiferenciada a NAM, todas las células dentro de la colonia va a sufrir cambios de la morfología de grandes células diferenciadas que disminuye la expresión de Oct-4 y comienzan a expresar el factor de transcripción específicos cardíacos (CSX) Nkx2.5 y α actinina, de acuerdo con un fenotipo cardiomesoderm (Fig. 2B). Estas células diferenciadas que se multiplican y las colonias aumentan de tamaño. Aumento de la intensidad se Nkx2.5se observa generalmente en las áreas de las colonias, donde las células comienzan a acumularse (Fig. 2B). Después individual, la hESCs NAM-tratada se forma flotante grupos celulares (cardioblastos) en un cultivo en suspensión para continuar con el proceso de diferenciación cardiaca. Después de permitir la cardioblastos para fijar y seguir con el tratamiento de NOAL durante 1 semana, los cardiomiocitos golpes comenzarán a aparecer en alrededor de 1-2 semanas de cultivo continuo después de la retirada de los NOAL con un aumento drástico en la eficiencia, en comparación con espontánea multi-linaje diferenciación de hESCs sin tratamiento durante el mismo período (Fig. 2C). Las células dentro de los grupos golpes cardiomiocitos se expresan marcadores característicos de los cardiomiocitos, incluyendo Nkx2.5 y α-actinina (Fig. 2C). Las contracciones de los cardiomiocitos golpes fueron confirmados por los perfiles eléctricos a ser fuertes, rítmicos, bien coordinada y bien arrastrado, con impulsos regulares una reminiscencia de la p-QRS-T-complejos de vista de los electrodos de superficie corporal en los electrocardiogramas clínicos (Fig. 2C, también ver el video). Los cardiomiocitos podría conservar su contractilidad fuerte por más de 3 meses. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" /> Figura 1. Planes generales del enfoque convencional frente a pequeñas moléculas de inducción de enfoque para la diferenciación de las células madre pluripotentes a células especializadas funcional. (A) Un esquema del enfoque convencional con múltiples linaje inclinación de las células madre pluripotentes a través de la diferenciación espontánea capa germinal. (B) Un esquema de un buen control de inducción eficiente de las células madre pluripotentes exclusivamente a un linaje particular clínicamente relevantes por la simple provisión de moléculas pequeñas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" /> Figura 2. Nicotinamida induce especificación linaje cardíaco directo de la pluripotencia bajo condiciones definidas y la progresión hacia la paliza cardiomiocitos. (A) Esquema que muestra de la línea de tiempo del protocolo de diferenciación dirigida cardiaca de hESCs. (B) Tras la exposición de hESCs indiferenciada a la nicotinamida (NOAL) bajo el sistema de cultivo definidos, gran diferencia octubre-4 (rojo), las células negativas dentro de la colonia comenzaron a surgir, en comparación con el modelo de tratado (DMSO) hESCs como control. NAM-inducida por las células octubre-4-negativos comenzaron a expresar Nkx2.5 (verde) y α-actinina (rojo), de acuerdo con la diferenciación cardíaca temprana. Aumento progresivo de la intensidad de Nkx2.5 se observó por lo general en las áreas de la colonia en donde las células empezaron a acumularse. Todas las células se indican con DAPI de sus núcleos (azul). (C) NAM-cardíaca inducida comprometidos hESCs cardiomiocitos dado golpes con un aumento drástico en la eficiencia, según la evaluación de los clusters celularestros que aparecen contracciones rítmicas (ver perfil electrofisiológicos y los videos), y immunopositive para Nkx2.5 (verde) y α-actinina (rojo). Imágenes de la fase de grupos representativos grandes golpes de cardiomiocitos y imágenes de mayor poder de representación de contratación músculos cardíacos se muestran (ver también videos correspondientes). Las flechas indican el grupo superando a cardiomiocitos de grandes dimensiones utilizados para el registro electrofisiológico. Perfil electrofisiológico de los cardiomiocitos superando los programas regulares, los impulsos incorporado, rítmica que recuerda a la p-QRS-T-complejos visto en los electrocardiogramas clínicos. Las barras de escala: 0,1 mm. Videos: la contratación de los cardiomiocitos diferenciados de NAM-inducida hESCs. Videos 1 y 2 muestran gran representante de vídeo superando las agrupaciones de los cardiomiocitos en alrededor de 1 y 3 meses después de la unión. Vídeo 3 y 4 muestran representante de contracción de los músculos cardíacos con mayor potencia. 5 muestra una typical pequeño grupo de cardiomiocitos diferenciados de latir espontáneamente sin tratamiento hESCs MNOAL como control. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Haga clic aquí para ver el video 1.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Haga clic aquí para ver el video 2.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Haga clic aquí para ver el video 3.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Haga clic aquí para ver 4 Video.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Haga clic aquí para ver el video 5.</a>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Los autores declaran conflictos de intereses. XHP es el fundador de Xcelthera. XHP y EYS tienen propiedades intelectuales relacionadas con hESCs.

Uno de los mayores desafíos tanto para el estudio del desarrollo y la traducción clínica ha sido la forma de encauzar el potencial de diferenciación gama de pluripotentes células madre humanas a un fenotipo deseado de manera eficiente y predecible. A pesar de estas células pueden diferenciarse espontáneamente in vitro en células de todas las capas germinales por pasando por una etapa de agregado de varios linajes, en células madre de origen multi-linaje agregados (cuerpos embrioides), sólo una fracción muy pequeña de células (&lt;2%) en forma espontánea diferenciarse en cardiomiocitos 13-15 (Fig. 1A). Inmunoselección siguientes, la población enriquecida de cardiomiocitos fueron capaces de funcionar como marcapasos biológicos para rescatar a la función de un miocardio dañado mecánicamente y electrónicamente después de la inyección en el corazón de los modelos animales 13. En modelos de roedores infartado, injertado células madre derivadas de progenies cardiaca fueron capaces de sobrevivir y madurar hasta 12 semanas, y en parte remuscularize el corazón herido y mejorar la función contráctil 14,15. Sin embargo, la ineficiencia en la generación de humanos cometidas células cardíacas a través de multi-linaje diferenciación de las células pluripotentes y el alto riesgo del trasplante de tumorigenicidad siguientes han dificultado la traducción de otro ensayo clínico. El desarrollo de estrategias para canalizar el potencial de diferenciación gama de hESCs pluripotentes exclusivamente y de manera predecible a un fenotipo cardíaco es vital para aprovechar el poder de la biología de células madre en el campo del corazón. A fin de lograr de manera uniforme la conversión de las células madre pluripotentes a un linaje particular, se empleó un sistema de cultivo definido capaz de asegurar la proliferación de hESCs indiferenciada para identificar las condiciones para un buen control de inducción eficiente de hESCs pluripotentes exclusivamente a un determinado linaje clínicamente relevantes por la simple provisión de pequeñas moléculas (Fig. 1B). Hemos encontrado que la nicotinamida cardíaca inducida por el compromiso de linaje directo de phESCs luripotent en la cultura que se define más avanzado para vencer a los cardiomiocitos de alta eficiencia (Fig. 2). Nkx2.5 es un factor de transcripción homeobox conservado evolutivamente indispensable para el desarrollo cardiaco normal y las mutaciones del gen están asociadas con las enfermedades humanas cardiopatías congénitas (CC), el defecto de nacimiento más comunes humanos 16. Expresión de Nkx2.5 es el marcador más precoz de las células precursoras del corazón en todos los vertebrados examinado hasta ahora, y es esencial para la tabicación cardíaca adecuada y la formación / maduración del sistema de conducción eléctrica 16. En los vertebrados, el inicio y el patrón de expresión a principios Nkx2.5 coinciden grosso modo con el tiempo y el área de especificación cardiaca en la embriogénesis temprana, y Nkx2.5 gen se sigue expresando a través del desarrollo en el corazón 16. En nuestro modelo de células madre, el MNOAL pareció provocar la inducción cardiaca directa de hESCs pluripotentes mediante la promoción de la expresión de la cardíacos específicos transcripción Nkx2.5 factor en un proceso que podría emular a la especificación de cardiomesoderm del epiblasto pluripotente en cardiogénesis embriones humanos. Los estudios futuros se muestran las moléculas de control genético y epigenético en el desarrollo del corazón humano, como alternativa, lo que puede allanar el camino para pequeñas moléculas mediada por el control directo y la modulación de las células madre pluripotentes destino al derivar linajes clínicamente relevantes para las terapias regenerativas. Sin tratamiento NAM, hESCs &lt;2% se someterá a la diferenciación espontánea a vencer a los cardiomiocitos 12-15. Con el tratamiento NAM, hemos sido capaces de generar&gt; 95% de precursores embrionarias cardíaca y&gt; 50% de los cardiomiocitos paliza de hESCs mantenido bajo una cultura de definir en un proceso que podría emular el desarrollo humano corazón embrionario 12. Recientemente, se conoce cardiaca genes que determinan el destino se han utilizado para transdiferenciarse fibroblastos de ratón en el post-natal cardiomiocitos golpes con una baja eficiencia de &lt;0,5% 17, 18 &lt;/ Sup&gt;. Sin embargo, la reprogramación de células somáticas han sido históricamente asociada con la expresión del gen anormal y la senescencia acelerada con la utilidad terapéutica deterioro 19-21. Finalmente, el protocolo se estableció aquí se limita a hESCs pluripotentes derivadas de la masa celular interna (ICM) o epiblasto del blastocisto 4,5 humana, no puede aplicarse a las células pluripotentes, incluyendo CES animal se originó, derivados de los CES a principios de mórula (de ocho células)-etapa 22 embriones y las células reprogramadas artificialmente 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 356231 </td><td> Factor de reducción del crecimiento </td></tr><tr><td> Humanos laminina </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nicotinamida </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out de reemplazo de suero </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM solución de aminoácidos no esenciales (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM ácidos solución de aminoácidos (MEAA, 100 veces) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Transferrina humana </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Humanos bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> La insulina humana </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Humanos activina A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> FBS se define </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-y ultra placa de fijación </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-y las placas </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Hasta la fecha, la falta de una adecuada fuente de células humanas cardiaca ha sido el gran retroceso en la regeneración del miocardio humano, ya sea a base de células de trasplante cardíaco o por ingeniería de tejidos 1-3. Cardiomiocitos diferenciados convertido en terminales poco después del nacimiento y pierden su capacidad de proliferar. No hay evidencia de que células madre / progenitoras derivadas de otras fuentes, tales como la médula ósea o la sangre del cordón umbilical, son capaces de dar lugar a las células contráctiles del músculo del corazón después del trasplante de corazón en el 1-3. La necesidad de regenerar o reparar el daño del músculo cardiaco no se ha cumplido con la terapia con células madre adultas, ya sea endógeno o mediante la entrega de células 1-3. La genéticamente estable células madre embrionarias humanas (hESCs) tienen la capacidad de expansión ilimitada y sin restricciones de plasticidad, ofreciendo una reserva pluripotentes en derivación in vitro de grandes cantidades de células somáticas humanas que están restringidos al linaje en la necesidadde reparación y regeneración 4,5. Debido a la prevalencia de las enfermedades cardiovasculares en todo el mundo y la aguda escasez de órganos donados, hay un gran interés en las terapias de células madre basado en el desarrollo como un enfoque alternativo. Sin embargo, la forma de encauzar el potencial de diferenciación gama de hESCs pluripotentes de manera eficiente y previsible a un fenotipo deseado ha sido un gran reto tanto para el estudio del desarrollo y la traducción clínica. Los enfoques convencionales se basan en múltiples linajes de células pluripotentes inclinación a través de la diferenciación espontánea capa germinal, dando lugar a ineficiencia e incontrolable linaje compromiso de que a menudo es seguida por la heterogeneidad fenotípica y la inestabilidad, por lo tanto, un alto riesgo de carcinogénesis 6-8 (ver un esquema de fig. 1A). Además, sin definir los suplementos biológicos extranjeros / animal y / o alimentadores que han sido tradicionalmente utilizados para el aislamiento, la expansión y diferenciación de hESCs puede hacer uso directo de tales células especializaciónzed injertos en pacientes con problemas 9.11. Para superar estos obstáculos, hemos resuelto los elementos de un sistema de cultivo definido necesaria y suficiente para sostener el epiblasto pluripotence de hESCs, sirviendo como una plataforma para la derivación de novo de hESCs clínicamente adecuado y eficaz dirección de hESCs tal manera uniforme hacia linajes clínicamente relevantes por pequeñas moléculas 12 (ver un esquema de la figura. 1B). Después de la selección de una variedad de pequeñas moléculas y factores de crecimiento, se encontró que tales condiciones definidas prestados nicotinamida (NOAL), suficiente para inducir la especificación de cardiomesoderm directa de hESCs pluripotentes que más progresó a cardioblastos que generan cardiomiocitos humanos golpes con una alta eficiencia (Fig. 2 ). Hemos definido las condiciones para la inducción de cardioblastos directa de hESCs pluripotentes sin la intervención de múltiples etapas linaje cuerpo embrioides, lo que permite un buen control de derivación eficaz de ungran cantidad de células cardíacas humanas a través del espectro de las etapas del desarrollo de terapias basadas en células.

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Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Hemos establecido un protocolo para la inducción de cardioblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de células progenitoras cardiacas humanas y funcionales cardiovasculares cardiomiocitos para su reparación.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

efficient-derivation-human-cardiac-precursors-cardiomyocytes-from

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K vistas.  San Diego Regenerative Medicine Institute. Hemos establecido un protocolo para la inducción de cardioblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de células progenitoras cardiacas humanas y funcionales cardiovasculares cardiomiocitos para su reparación.

Video: Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Investigación

Biología

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelación y descongelación células estaminales embrionarias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfección y Nucleofecting Humanos células madre pluripotentes inducidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Preparación de las células embrionarias de fibroblastos de ratón adecuados para el cultivo de células estaminales embrionarias humanas pluripotentes inducidas, y

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...