BS con el apoyo de la Universidad de Milán-Bicocca Programa de Formación de Investigadores Student Summer; investigación fue financiada con fondos del Ministerio de Salud y el Ministerio italiano de Educación, Universidad e Investigación y la Fundación Humanitas de GC italiano; Agradecemos a Michael VG Latronico para la lectura crítica del manuscrito.

1. Mantenimiento del alimentador-libre y Propagación de líneas de células humanas iPS <ol><li> Preparar los platos revestidos con Matrigel. Descongelar un vial de matriz ESC-cualificado humana en hielo durante una hora y se diluye en 25 medio DMEM-F12 ml. Añadir 1 ml a cada placa de 35 mm (o cantidades equivalentes por unidad de superficie si se utilizan otros platos), manteniendo todo en hielo y asegurar que todas las placas y los tubos son pre-enfriado. Cubrir las placas con papel de aluminio. </li></ol> Nota: las concentraciones de valores Matrigel variar según el lote. Instrucciones de dilución se indican en la hoja de datos. <ol start="2"><li> Mantener las placas en hielo durante la noche y eliminar de hielo al día siguiente. Las placas se pueden mantener en la nevera durante hasta una semana antes de usar. </li><li> Preparar el medio completo mTESR1 (o descongelar un vial de medio Nutristem) y la H-ESM (medio de ESC humana) de acuerdo con la tabla de abajo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> CONC FINAL </td><td> PARA 500 ​​ml </td></tr><tr><td> Knockout sustitución Serum (KSR) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> MEM aminoácidos no esenciales </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> La penicilina-estreptomicina </td><td> 100 U / ml - 0,1 mg / ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> 0,1 mM </td><td> 900 l </td></tr><tr><td> B27 Suplemento - sin Vitamina </td><td> 1% </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Suplemento N2 </td><td> 1% </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> - </td><td> 370 ml </td></tr></tbody></table> Medio de archivo se puede almacenar a 4 ° C durante no más de 2 semanas. Para preparar el medio de crecimiento, se agrega FGF básico sólo beforla alimentación de correo a una concentración final de 20 ng / ml. </li></ol> Nota: H-ESM completa condicionada a fibroblastos embrionarios de ratón se puede usar en lugar de mTESR1 o Nutristem de células iPS. <ol start="4"><li> Colocar las placas recubiertas en un incubador a 37 ° C durante 30 min a 2 horas antes de pases. </li><li> Las células deben ser pasados ​​aproximadamente cada 5 días, incluso si no han llegado a la confluencia. Las colonias no deben tocarse. </li><li> Reemplazar medio de crecimiento con 1 ml de dispasa (1 mg / ml, se disuelven a partir de un mg / ml de caldo de 10 en PBS). </li><li> Retire diferenciar áreas con tirados pipetas Pasteur de vidrio. Las áreas que deben ser eliminados incluyen estructuras como cráteres o quístico en el centro de las colonias, y cualquier área donde las células se han separado de las colonias y aplanados y parecen estar migrando hacia el exterior. </li><li> Incubar a 37 ° C bajo una campana de cultivo hasta que las fronteras de colonias se vuelven más brillantes y comienzan a separar (por lo general alrededor de 5-7 minutos). Discard dispasa. Lavar con 1 ml de H-ESM y desechar. </li><li> En 1 ml H-ESM, use un elevador celular (espátula espátula) para colonias cosecha y recoger en un tubo de 15 ml Eppendorf. Enjuague con 1 ml H-ESM y añadir al tubo. Gira a 1.000 rcf durante 4 min y retirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de medio de crecimiento pre-calentado (ya sea mTESR1 o Nutristem). Evite romper los grumos demasiado - pipetear arriba y hacia abajo a menos de 6-8x. Determinar el número de células debe ser presentado y eliminar las células innecesarias (por lo general dilución 1:4 ó 1:5), por ejemplo para 2 placas a 01:05, eliminar 600 l, a continuación, añadir 1,6 ml de medio fresco. </li><li> Retire Matrigel a partir de placas. Las células de ubicación gota a gota, distribuir de manera uniforme sobre la placa. Evite agitar el tubo en exceso, ya que esto hará que las células se muevan hacia el centro. </li><li> Lave tubo con 1 ml de medio y se dividen entre las placas. El volumen final en cada placa debe ser de 1,5 ml de -2. </li><li> Cambio de medio cada día, excepto para el día después de pases. A pesar de que esideal para cambiar el medio todos los días, este puede ser cambiado de vez en cuando a una frecuencia de una vez cada dos días si han pasado más de 2-3 días desde el último paso sin afectar potencial de pluripotencia o diferenciación. </li><li> Si la línea celular debe ser congelado, volver a suspender en lugar de 1-2 ml de medio de congelación mFreSR utilizando una pipeta y colocar 2 1 ml / criovial. Viales lugar en una Caja criogénica a -80 ° C y la transferencia de nitrógeno líquido en 3-4 días. </li></ol> Nota: Manual microdisección de células iPS debe realizarse bajo un microscopio estereoscópico. Un (FIV) estación de trabajo en la fertilización in vitro (por ejemplo, una estación de trabajo de FIV Ksystem) integrado con un estereomicroscopio permite la manipulación de las células en condiciones estériles, mientras que se mantienen en un área de superficie calentada. Si esto no está disponible, un microscopio estereoscópico se puede mover bajo una campana de flujo laminar regular. 2. Cuerpos embrioides Agregación y Cardiac Induction <ol><li> Prepara-20 EBM medio de acuerdo con la siguiente tabla. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> CONC FINAL </td><td> PARA 500 ​​ml </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal (origen América del Sur) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Aminoácidos no esenciales MEM </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> La penicilina - estreptomicina </td><td> 100 U - 0,1 mg / ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> 50um </td><td> 450 l </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 ml </td></tr></tbody></table> Uso de FBS de origen América del Sur es crítico para la determinación de la eficiencia de diferenciación: el empleo de otros tipos de sueros puede afectarel proceso de diferenciación. Para preparar un EBM-20, ácido ascórbico complemento completo (AA) a una concentración final de 50 g / ml. Medio de crecimiento completo se puede almacenar a 4 ° C durante no más de una semana. </li><li> Cosecha iPS colonias como se describe anteriormente (pasos 1.6 a 1.9). </li><li> Resuspender suavemente en 1 ml EBM-20 con una pipeta de 2. Evite romper los grumos demasiado - pipetear arriba y abajo no más de 2 a 3 veces, comprobando el tamaño de las colonias bajo el microscopio estereoscópico. Placa en placas de fijación ultra-bajas en proporción de 1:1 (por ejemplo, un plato de 35 mm, utilice 1 pocillo de una placa de 6 pocillos). Enjuague tubo con 1 ml EBM-20 y añadir al plato. </li></ol> Nota: El tamaño de las colonias afecta el proceso de diferenciación, el control de la eficiencia y el momento de la inducción cardiaca. La agregación de EBs homogénea de tamaño se ha demostrado para reducir la variabilidad observada durante la diferenciación. <ol start="4"><li> El día 3, cambie EBM-20 una vez que el uso de un microscopio para evitar volver aremoción de EBS. Mantenga la pipeta cerca del borde de la placa, y retire medio. </li><li> En el día 7, el interruptor de EBs a placas recubiertas con 0,1% de gelatina y se coloca previamente a 37 ° C durante 30 min. Si es necesario, la gelatina se puede quitar y placas se dejaron bajo una campana de cultivo de células S / N. Añadir 35-40 CE por placa de 35 mm. </li><li> Compruebe EBS por golpear a las zonas y el cambio EBM-20 dos veces por semana. Marque donde se encuentran las zonas batiendo en la parte superior de la cubierta de plato, para facilitar que la localización bajo el microscopio estereoscópico. Áreas contratantes deben aparecer después de unos 10 a 20 días. </li><li> Cuando las áreas con contracción espontánea aparecen, cambian a medio y EBM-2 (preparar como EBM-20, con un 2% de SFB en su lugar) y aíslan como se describe a continuación en la sección 3. </li><li> Continúe revisando otros ámbitos por golpear y cambiar medio dos veces por semana hasta que se necesitan áreas batiendo para experimentos adicionales. </li></ol> Nota: la eficiencia del proceso de diferenciación es altamente dependientevarios factores, el más importante de los cuales son las líneas celulares específicas y el lote de suero utilizadas para inducir la diferenciación cardiaca. Para obtener el máximo rendimiento, las líneas celulares de prueba para posibles cardiomiogénico y varios lotes de suero. 3. Vencer a las áreas de aislamiento y Cultura <ol><li> Recubrir las placas de 12 pocillos (4 cm 2) o las placas de interés, con 5 mg / cm 2 fibronectina, diluido en PBS para hacer un volumen suficiente para cubrir toda la superficie por completo (300 l total por pocillo en placas de 12 pocillos). Mantenga descubierto en campana de cultivo de células y dejar secar. Las placas pueden ser envueltos y se almacenaron a 4 ° CO / N. </li><li> Retire área usando un vaso superando sacó pipeta Pasteur y el bisturí, según sea necesario. Transferencia a placas recubiertas con fibronectina con una pipeta de 1 ml. </li><li> Añadir 1 ml EBM-2. </li><li> Tacha la placa para indicar las áreas en las que se eliminaron las células y cambiar el medio. Las placas se pueden mantener durante un máximo de 1 mes, ya que otras áreas pueden empezar a bcomer más tarde. </li></ol> Nota: Si se necesitan grupos pequeños golpeando, pipetear el área explantada arriba y abajo varias veces bajo el microscopio estereoscópico, hasta que se rompe en pedazos más pequeños. Esto dará lugar a racimos de unas pocas células latiendo (ver la película 3). <ol start="5"><li> Cambio de medio dos veces a la semana hasta que esté listo para el análisis. </li></ol> Nota: Los cardiomiocitos obtenidos a partir de este protocolo poseen características morfológicas y funcionales del feto-como; maduración hacia un fenotipo adulto-como se puede obtener mediante el aumento del tiempo en cultivo para diferenciar aún más estas células. 4. Soltero Vencer celdas de aislamiento y análisis <ol><li> Escudo diapositivas 2-cámara (4 cm Área 2) u otros soportes adecuados con 5 g / cm 2 fibronectina diluido en PBS suficiente para cubrir toda la superficie de cultivo. Si se utiliza un soporte de vidrio, la capa con la laminina y la fibronectina (5 g / cm &lt;sup&gt; 2 cada uno). </li><li> Retire área batiendo con una pipeta Pasteur / bisturí de las placas de la sección 3. </li><li> Usando una pipeta de 1 ml, las células de transferencia a un tubo de 15 ml que contiene 500 l de colagenasa II (480 U / ml en PBS con Mg y Ca) y se incuba 15 min a 37 ° C, agitando el tubo una vez durante la incubación. </li><li> Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 200. Si cualquier grupo permanecen, traslado al fresco colagenasa II y repita el paso 4.3. </li><li> Repita el paso 4.4 hasta que no haya grumos grandes se quedan. </li><li> Desactivar la colagenasa con 3 ml EBM-2 (sin AA). El tubo se puede dejar bajo el capó de un estante calentado hasta que otros tubos están listos. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (diluido a partir de un stock de 0,5% en 1X PBS) y se incuba a 37 ° C durante 5 min. Se combinan las fracciones de digestión de la misma muestra inicial. </li><li> Inactivar la tripsina con 4 ml EBM-2 (sin AA). Pasar las células a través de una aguja 18G en una jeringa de 2,5 ml no más than de 7x. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1 ml EBM-2 por pocillo y la placa. Las células se pueden utilizar para los análisis funcionales y morfológicas 2-3 días después de la siembra. </li></ol>

<ol>
	<li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases:+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function.">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li><li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circulation Research. 111, 344-358 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132, 537-543 (2008).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+iPS+cells.">A fresh look at iPS cells.</a> Cell. 137, 13-17 (2009).</li><li>Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+models+for+genetic+cardiovascular+disorders.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders.</a> Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li><li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465, 808-812 (2012).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).</li><li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome.">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells.">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes.">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li></ol>

No hay interés económico alguno.

Las células madre pluripotentes tienen el potencial de diferenciarse espontáneamente en los CM, aunque con baja eficiencia y alta variabilidad entre líneas. Por consiguiente, el desarrollo de métodos de inducción novedosos se ha centrado en la mejora de la eficiencia del proceso y avanzar hacia protocolos más definidos. Sin embargo, la mayoría de estos nuevos métodos de diferenciación son bastante complejos, que requieren condiciones elaboradas cultura, control preciso del tiempo y la concentración de los reac...

Históricamente, la investigación de los mecanismos genéticos y moleculares de conducción desarrollo humano y la enfermedad se ha basado en la generación de modelos animales genéticamente modificados. Sin embargo, numerosos fenotipos humanos no pueden ser replicados con éxito en ratones, principalmente a causa de las diferencias biológicas existentes entre las dos especies. Por otra parte, el acceso a los tejidos humanos puede ser limitada y con frecuencia no permita que el material suficiente para obtener por estudios experimentales en profundidad. El campo de la biología cardiovascular sufre de estas dos limitaciones: la fisiología del corazón humano es significativamente diferente de la del ratón, y una cantidad significativa de tejido del corazón es accesible solamente post mortem o durante una cirugía de corazón. Encontrar una fuente óptima para la diferenciación funcional de los CM humana por lo tanto se ha convertido en un tema central en la biología cardiovascular, y se ha hecho un gran esfuerzo para hacer frente a este problema. Se han propuesto diversos tipos de células, itales como grapas de mioblastos esqueléticos, células locales cardíacos madre, células mononucleares de médula ósea, progenitoras endoteliales, y células madre mesenquimales. Sin embargo, los datos obtenidos usando estas células no han sido consistentes 4. La obtención de células madre embrionarias (ESC) primero 5 y el descubrimiento revolucionario de la madre (iPS) a las células pluripotentes inducidas por Yamanaka y Thomson 6,7 después parecía ofrecer soluciones: estas células tienen la capacidad de crecer indefinidamente y el potencial de dar la altura de todos los derivados de células de las tres capas germinales, incluyendo los CM. El uso de células iPS ofrece otras ventajas: ser derivados a partir de células adultas autólogas, que llevan el mismo genoma que el individuo o paciente de la que se derivan. Por lo tanto, permiten el desarrollo de modelos in vitro que facilitan la investigación de enfermedades genéticas humanas y los mecanismos de desarrollo. En virtud de esta característica, las células iPS pueden øvercome problemas relacionados con el rechazo inmunológico y las cuestiones éticas 8. Por estas razones, a pesar de que los CES aún representan el estándar de oro en el campo de la biología de células madre, los investigadores en todo el mundo se está moviendo más hacia la tecnología de células iPS. células iPS ahora se están empleando para modelar enfermedades humanas in vitro para varias condiciones, incluyendo trastornos cardiovasculares congénitos 9,10. Recientemente, la aplicación de modelado de la enfermedad de células iPS se ha realizado durante monogénicas trastornos cardíacos (por ejemplo, síndromes de QT largo, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica) y patologías en las que los defectos cardíacos son parte de un complejo fenotipo (es decir, Leopard y síndromes Timothy, cardiomiopatía dilatada). Estos informes confirman que las células iPS de pacientes específicos que se diferencian en los CM presentan características fenotípicas y funcionales similares a la enfermedad in vivo. Sin embargo, hayquedan muchos retos para mejorar la eficacia de la inducción de las células iPS en el linaje cardiaco. La generación espontánea de los CM de CME humanas a través de la formación de agregados llamados cuerpos embrioides (EB) han probado con éxito 17. Desde este descubrimiento, se han propuesto muchos otros métodos. Muchos grupos han mejorado considerablemente la eficiencia del protocolo de diferenciación y se han movido hacia los reactivos de cultivo químicamente definidos y de productos animales libres (ver Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) para una revisión exhaustiva de todos los métodos existentes 3 ). Sin embargo, el método clásico basado en EB agregación todavía representa el más comúnmente empleado para la realización de estudios funcionales y la investigación de mecanismos de la enfermedad. Nuestro protocolo propuesto se basa en la agregación de las células iPS en EBs y cultivo en presencia de suero y ácido ascórbico, que se ha demostrado para mejorar el proceso de diferenciación cardiaca y para positively afectar a la maduración de estas células 18,19. En este artículo vamos a ir a través de esta metodología en detalle y mostraremos cómo utilizar iPS alimentador libres de líneas celulares para la generación específica del paciente CM iPS derivadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Media and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ESC-qualified Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Thaw the 5 ml bottle at 4 &deg;C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 &deg;C .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0896-2MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (no Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-515F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (with Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Bio Sera</td>
			<td>XC-S2067/500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, neutral protease, grade II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 &deg;C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA, 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4176</td>
			<td>Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (origin South America)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 &deg;C, heat-inactivate at 56 &deg;C for 30 min, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA, 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td>Make stock at 1% in water, store at -20 &deg;C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 &deg;C. Do not keep complete medium at 4 &deg;C for more than 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutristem hESC XF</td>
			<td>Stemgent from Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C O/N, aliquot and store at -20 &deg;C until use. Aliquots may be kept at 4 &deg;C for no more than a week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5853</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td>Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 &deg;C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dishes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353043</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177380</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, ultra-low-attachment surface</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3471</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>304622</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes, 230 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>612-1702</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Workstation</td>
			<td>KSystem, by Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ1500 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human cardiomyocytes: a differentiation protocol from feeder-free human induced pluripotent stem cells

Con el fin de investigar los hechos de conducir el desarrollo del corazón y determinar los mecanismos moleculares que conducen a enfermedades del miocardio en los seres humanos, es fundamental primero para generar cardiomiocitos humanos funcionales (CM). El uso de estas células en el descubrimiento de fármacos y estudios de toxicología también sería altamente beneficioso, permitiendo que las nuevas moléculas farmacológicas para el tratamiento de trastornos cardíacos que ser validado pre-clínicamente en las células de origen humano. De las posibles fuentes de CM, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) se encuentran entre los más prometedores, ya que se pueden derivar directamente de tejido del paciente fácilmente accesibles y poseen una capacidad intrínseca para dar lugar a todos los tipos de células del cuerpo 1. Se han propuesto varios métodos para la diferenciación de las células iPS en los CM, que van desde los clásicos cuerpos embrioides (EB) enfoque de agregación de química definida protocolos de 2,3. En este artículo se propone un protocolo basado en EBS y mostrar cómo esta metod se puede emplear para generar de manera eficiente las células CM-como funcionales a partir de células iPS alimentador-libres.

En nuestros estudios hemos generado los CM de varias líneas de células iPS. Estas líneas se generaron inicialmente en una capa de alimentación MEF pero se colocaron inmediatamente en Matrigel usando un medio definido (ya sea mTESR1 o Nutristem). Varios ensayos se utilizaron para verificar el mantenimiento de las propiedades morfológicas, la expresión de marcadores típicos de células pluripotentes (OCT-4, SSEA4 y TRA1-60) y su estabilidad genoma (Figura 1). La inducci...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Las células madre pluripotentes, cualquiera de las células madre pluripotentes embrionarias o inducidas (iPS), constituyen una valiosa fuente de células diferenciadas humanas, incluyendo cardiomiocitos. Aquí, nos centraremos en la inducción cardiaca de las células iPS, que muestra cómo usarlos para obtener cardiomiocitos humanos funcionales a través de un protocolo de los organismos con sede en embrioide.

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

generation-human-cardiomyocytes-differentiation-protocol-from-feeder

Research

JoVE Journal

Biology

21.2K vistas.  Humanitas Clinical and Research Center, Italy. Las células madre pluripotentes, cualquiera de las células madre pluripotentes embrionarias o inducidas (iPS), constituyen una valiosa fuente de células diferenciadas humanas, incluyendo cardiomiocitos. Aquí, nos centraremos en la inducción cardiaca de las células iPS, que muestra cómo usarlos para obtener cardiomiocitos humanos funcionales a través de un protocolo de los organismos con sede en embrioide.

Video: Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos humanos con los Lentivirus Stemgent Humanos TF Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Investigación

Biología

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfección y Nucleofecting Humanos células madre pluripotentes inducidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.

Generación y mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas por primates derivadas de la orina

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

Caracterización de los antígenos de superficie y la capacidad de proliferación en las MSC que impulsan hiPSC

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are restricted by limited donation, quality variations, and biosafety, the past 10 years have seen a great rise in efforts to generate MSCs from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Past and recent efforts in the differentiation of hiPSCs into MSCs have been centered around two culture methodologies: (1) the formation of embryoid bodies (EBs) and (2) the use of monolayer culture. This protocol describes these two representative methods in deriving MSC from hiPSCs. Each method presents its advantages and disadvantages, including time, cost, cell proliferation ability, the expression of MSC markers, and their capability of differentiation in vitro. This protocol demonstrates that both methods can derive mature and functional MSCs from hiPSCs. The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation, while the EB method is characterized by lower time consumption.

Autor destacado: Avances en iPSCs e investigación de enfermedades genéticas 

This protocol describes and compares two representative methods for differentiating hiPSCs into mesenchymal stromal cells (MSCs). The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation. The embryoid bodies (EBs) method is characterized by lower time consumption.

Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...