XHP, Ulusal Sağlık (NIH), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIHK01AG024496) ve Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (NIHR21HD056530) hibe Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

1. Çözüm ve Medya Hazırlık <ol><li> Jelatin kaplama çözümü:% 0.1 (w / v) 4 GKD 2 O, otoklava jelatin ve mağaza ° C </li><li> Matrigel kaplama çözümleri. Stok çözelti: 4 ° C gecede, 10 ml buz DMEM veya DMEM/F12 ekleyin, iyice karıştırın ve kısım 1 ml / tüp, steril doku kültürü kaputu altında -20 mağaza ° C. yavaş çözülme Matrigel (10 ml) Çalışma çözüm: yavaş çözülme 1 ml Matrigel kısım, 4 ° C 14 ml soğutulmuş DMEM veya DMEM/F12 1-2 saat, transferi ve kaplama hemen önce steril doku kültürü başlık altında iyice karıştırın. </li><li> İnsan laminin kaplama çözümü: seyreltik 1 ml insan laminin çözüm buz DMEM veya DMEM/F12 için (Tris 0.5 mg / ml -80 mağaza, NaCl Tamponlu ° C, 1-2 saat 4 ° C yavaş çözülme) 12.5 ml çalışma solüsyonu (40 mg / ml) steril doku kültürü başlık altında yer kaplama hemen önce. </li><li> Büyüme faktörü stok solüsyonları (500-1000X): 10 mg büyüme faktörü çözülürSteril tampon / ml (% 0.5 BSA, 1.0 mM DTT,% 10 gliserol, 1XPBS) ve -80 ° C 50-100 ul / tüp alikotları olarak depolamak </li><li> HESC medya: DMEM/F12 veya KO-DMEM (% 80), KO, serum değişimi (% 20), L-alanyl-L-gln &#39;ya da L-gln (2 mM), MEM aminoasitlerin (MNAA 1X) ve β-mercaptoethanol (100 mcM), filtre edilmiş ve 4 mağaza ° C, kullanmadan önce 20 ng / ml bFGF ile desteklenebilir. Veya tanımlanmış bileşenleri ile &quot;KO serum yerine&quot; yerine: DMEM/F12 veya KO-DMEM (% 100), L-alanyl-L-gln &#39;ya da L-gln (2 mM), MNAA (1X), MEM, esansiyel amino asitler (MEAA 1X) ve β-mercaptoethanol (100 mcM), filtre edilmiş ve 4 mağaza bFGF (20 ng / ml) ile desteklenmiş ° C, insan insülini (20 mg / ml), askorbik asit (50 mg / ml), insan aktivin A (50 ng / ml), insan albümin / Albumax (10 mg / ml), ve insan transferrin (8 mg / ml) Kullanmadan önce. </li><li> HESC kalp farklılaşma medya: DMEM/F12 (% 90), tanımlanan FBS (% 10) ve L-alanyl-L-gln &#39;ya da L-gln (2 mM). </li><li> Medya içeren nikotinamid (NAM): add NHESC medya veya 10 mM son konsantrasyon, 4 filtre, mağaza ° C ve 2 hafta içinde hazırlık kullanın. HESC kalp farklılaşma medya AM </li></ol> 2. Plakası Kaplama <ol><li> Coat tabak-jelatin: add ml / 6 kuyucuğu jelatin çözüm 2.5 ve 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör bir gece inkübe edin. </li><li> Coat laminin plakalar: chill jelatin kaplı plakalar ve jelatin kaldırmak, 2.5 ml / pre-soğuk, iyi Matrigel ya da insan laminin kaplama çalışma çözeltisi 4 ° C gecede 6 kuyucuğu ve inkübe jelatinize. </li></ol> 3. Tanımlanmış koşullar altında ayrım yapılmamış hESC Pasajlanması ve Yayımlamak <ol><li> HESC kolonileri 5-7 gün eski büyümesine olanak ve diseksiyon mikroskobu (önceden sıcak sahne diseksiyon 37 ° C) sterilize kaput diseksiyon altında hESC kültür plaka almak. </li><li> HESC koloniler bölünebilir seçin. Morfolojik, bu koloniler (sm&gt;% 75 farklılaşmamış hESC olmalıdırgenellikle hafif opak kenarı ile diseksiyon mikroskobu altında tanımlanan tüm kompakt hücreleri), (beyaz tüylü-up hücreleri, açık diferansiye hücreler). Dikkatle seçilen koloniler anahat ve P2 steril pipet ucu kenarı ile koloni veya cam kapiller çekti (varsa) koloni çevreleyen farklılaştırılmış fibroblast tabakası ve tüm farklılaşmış parçaları kaldırmak. </li><li> Aspire kayan müstakil farklılaşmış hücre içeren eski medya çıkarın. Bir kez hESC medya (bFGF olmadan) ile yıkayın. Ekle / 3 ml 20 ng / ml bFGF içeren taze hESC medya. </li><li> Farklılaşmamış hESC koloniler küçük parçalar halinde kesin, ve steril pipet veya kapiller çekti cam ile ayırmak. </li><li> 50 ml konik boru birlikte müstakil koloni parçaları içeren medya Havuzu. 1 ml / birlikte 20 ng / ml bFGF ve havuz içeren iyi hESC medya plaka ile bir kez yıkayın. </li><li> Taze kaplı plakalar Matrigel veya insan laminin çözüm aspire. Kısım 4 ml / h6 plaka koloni parçaları içeren ESC medya. Hafifçe sallayarak inkübatör plaka transfer ve% 5 CO2 atmosferi ile nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatör bozmadan koloni adet tohum gecede izin. </li></ol> 4. Nikotinamid ile Tanımlı Kültür Sistem altında hESC Kardiyak İndüksiyon <ol><li> Tohumlama sonra 3. günde, plakanın her kuyudan en eski medya kaldırmak ve hESC koloniler (hESC dışarı kuru asla izin) sokulmasına izin verecek kadar medya bırakın. 20 ng / ml bFGF ve 10 mM nikotinamid (NAM) içeren 4 / ml taze hESC medya ile değiştirin. </li><li> 20 ng / ml bFGF ve 10 mM NAM her gün taze hESC içeren medya eski medya değiştirin ve kalp-kaynaklı hESC koloniler gün 8-10 büyümesine olanak. NAM maruz üzerine, koloninin içindeki tüm hücreleri çoğalmaya devam edecek büyük bir farklılaşmış hücre morfoloji değişiklikleri uğrayacaktır. Koloniler, boyutu ve günde 8-10 oranında artacakd hücreleri bazı alanlarda koloniler yığmak başlayacak. </li></ol> 5. Süspansiyon Kültürü Sürekli Kardiyak Farklılaşma <ol><li> HESC kültür plakasına diseksiyon sterilize kaput altında mikroskop diseksiyon (ön-sıcak sahne diseksiyon 37 ° C) alın. Koloniler dikkatle anahat ve P2 steril pipet ucu kenarı ile koloni çevreleyen fibroblast tabakası (farklılaşmış hücrelerin koloni göç) kaldırmak veya cam kapiller çekti. </li><li> Aspire kayan müstakil fibroblast hücreleri içeren eski medya çıkarın. Bir kez hESC medya (bFGF olmadan) ile yıkayın. 3 ml / iyi taze hESC medya (bFGF olmadan) ekleyin. </li><li> Kalp-kaynaklı hESC koloniler küçük parçalar halinde kesin, ve steril pipet veya kapiller çekti cam ile ayırmak. </li><li> 50 ml konik boru birlikte müstakil koloni parçaları içeren medya Havuzu. Plaka birlikte 1 ml / iyi hESC medya (bFGF olmadan) ve yüzme havuzu ile bir kez yıkayın. </li><li> Kısım 4 ml / 37 6-kuyu, ultra eklenti plaka ve inkübe koloni adet içeren serum serbest hESC medya ° C inkübatör yüzen hücre kümeleri (cardioblasts), 4-5 gün için form izin nemlendirilmelidir. </li></ol> 6. Yapıştırıcı Kültür kardiyomiyosit Fenotip Olgunlaşma Dayak <ol><li> 50 ml konik bir tüp içinde yüzen cardioblasts bir arada içeren medya Havuzu. 1400 devirde 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Mümkün olduğu kadar çok eski medya aspire ve 10 mM NAM içeren taze hESC kalp farklılaşma medya eşit miktarda ekleyebilirsiniz. </li><li> 4 ml / 6 kuyucuğu kayan cardioblasts ve kısım karıştırmak için pipet ve aşağı yukarı. 37 plakalar transfer ° C nemlendirilmiş inkübatör cardioblasts gecede takmak için izin verecek. </li><li> HESC kalp farklılaşma medya içeren 10 mM NAM her gün değiştirin. </li><li> 8 gün, NAM olmadan hESC kalp farklılaşma medya ile değiştirin ve hESC kalp farklılaşma medya e değiştirmeye devam ediyorçok başka bir gün. Dayak kardiyomiyositlerde NAM çekilmesinden sonra sürekli ekiminin yaklaşık 1-2 hafta içinde görünür ve zamanla sayıları artış başlayacak ve 3 ay boyunca güçlü ve ritmik kasılmaları korumak olabilir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Nikotinamid (NAM), özel bir cardiomesodermal fenotip (Şekil 2B) pluripotency geçiş için belirlenen kültür sistemi muhafaza hESC neden için yeterli oluşturulur . NAM için farklılaşmamış hESC maruz kalması üzerine, koloninin içindeki tüm hücreleri Ekim-4 ifadesi aşağı düzenler ve kalp spesifik transkripsiyon faktörü (Csx) Nkx2.5 ve α-ifade etmeye başlayacak bu büyük farklılaşmış hücre morfoloji değişiklikleri uğrayacaktır aktinin, bir cardiomesoderm fenotip (Şekil 2B) ile uyumlu. Bu farklılaşmış hücreler çoğalmaya devam edecek ve koloniler boyutu artırmak. Nkx2.5, Artan yoğunluğugenellikle hücreler (Şekil 2B) yığmak başlayan koloniler alanlarda gözlenebilir. Müstakil sonra, NAM-tedavi hESC kalp farklılaşma sürecine devam etmek için bir süspansiyon kültürü yüzen hücre kümeleri (cardioblasts) oluşturacaktır. Cardioblasts takmak için izin ve NAM ile 1 hafta boyunca tedavi devam ettikten sonra, dayak kardiyomiyositlerde kendiliğinden çok-dizi farklılaşma ile karşılaştırıldığında ciddi bir verimlilik artışı ile NAM çekilmesinden sonra sürekli ekiminin yaklaşık 1-2 hafta içinde görünmeye başlayacaktır aynı zaman diliminde (Şekil 2C) üzerinden tedavi olmadan hESC. Dayak kardiyomiyosit kümeler içinde hücreler, Nkx2.5 ve α-aktinin (Şekil 2C) de dahil olmak üzere kardiyomiyositlerinin karakteristik belirteçleri , ifade edecektir. Dayak kardiyomiyositlerde kasılmaları p anımsatan düzenli dürtüleri ile, güçlü, ritmik, iyi koordine edilmiş ve iyi sürüklenen elektrik profilleri tarafından teyit edildi-QRS-T-kompleksleri klinik elektrokardiyogram vücut yüzey elektrotları (Şekil 2C, aynı zamanda Video bakınız) . Kardiyomiyositlerde 3 ay boyunca güçlü kontraktilite elinde tutabilirdi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" /> Şekil 1. Özel fonksiyonel hücrelerine karşı insan pluripotent kök hücreleri farklılaşma için küçük molekül-indüksiyon yaklaşımı karşısında geleneksel yaklaşım, genel şemaları. (A) spontan germ tabakası farklılaşma ile insan pluripotent kök hücreleri çok soyundan eğim kullanılarak geleneksel yaklaşım şematik. (B) insan pluripotent kök hücrelerin sadece küçük moleküllerin basit bir hükmün belirli bir klinik ile ilgili soy iyi kontrollü verimli indüksiyon şematik . <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" /> Şekil 2. Nikotinamid ve kardiyomiyositlerde yenerek doğru ilerlemesi tanımlanmış koşullar altında pluripotency doğrudan kalp soy özellikleri neden olur. (A) hESC yönlendirilmiş kalp farklılaşma protokol zaman çizgisi resmeden şematik. (B) farklılaşmamış hESC tanımlanan kültür sistemi altında Nikotinamid (NAM) maruz kalma üzerine büyük farklılaştırılmış Eki-4 koloni içinde (kırmızı) negatif hücrelerin kontrol mock-tedavi (DMSO) hESC göre ortaya çıkmaya başladı. NAM-uyarılan Ekim-4-negatif hücrelerin erken kalp farklılaşma ile tutarlı ifade Nkx2.5 (yeşil) ve α-aktinin (kırmızı), başladı. Nkx2.5, aşamalı artan yoğunluğu, genellikle hücrelerin yığmak başladı koloninin alanlarda gözlendi. Tüm hücreler kendi çekirdeğinin DAPI boyama (mavi) ile gösterilir. (C) NAM bağlı kalp-taahhüt hESC hücre clus tarafından değerlendirilir, verimlilikte ciddi bir artış ile yenerek kardiyomiyositlerde verdiritmik kasılmalar (bkz. elektrofizyolojik profili ve Videolar) ve Nkx2.5 (yeşil) ve α-aktinin (kırmızı) immünopozitif görüntülenir ters. Kalp kasları sözleşme temsilcisi temsilcisi büyük dayak kardiyomiyosit kümeleri ve yüksek güç görüntüler Faz görüntüleri (ilgili videoları görmek) gösterilmiştir. Oklar elektrofizyolojik kayıt için kullanılan büyük bir dayak kardiyomiyosit küme gösterir. Elektrofizyolojik profil atan kardiyomiyositlerde klinik elektrokardiyogram görülen p-QRS-T-kompleksleri anımsatan Düzenli, sürüklenen, ritmik dürtülerini gösterir. Ölçek çubuklar: 0.1 mm. Videolar: NAM-indüklenen hESC ayırt kardiyomiyositlerde Akit. Videolar 1 ve 2 gösterisi temsilcisi büyük eklenti sonra 1 ve 3 ay içinde kardiyomiyosit kümeleri yenerek Video 3 ve 4 göstermek temsilcisi yüksek güçte kalp kaslarının sözleşme Video 5 typica gösterirl küçük dayak kardiyomiyosit küme kendiliğinden kontrol olarak NAM tedavi olmadan hESC ayırt. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Video 1 izlemek için tıklayınız.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Video 2 izlemek için buraya tıklayın.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Video 3 izlemek için tıklayınız.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Video 4 izlemek için tıklayınız.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Video 5 izlemek için buraya tıklayın.</a>

<ol>
	<li>Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+tissue+engineering:+a+review.">Myocardial tissue engineering: a review.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).</li><li>Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart.">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453, 322-329 (2008).</li><li>Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+repair.">Human embryonic stem cells and cardiac repair.</a> Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells.">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li><li>J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. , 282-1145 (1998).</li><li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li><li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes.">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li><li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson's+disease.">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li><li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells.">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li><li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells.">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature Methods. 2, 185-190 (2005).</li><li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells.">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li><li>Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+integration+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).</li><li>Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infracted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).</li><li>Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+improves+myocardial+performance+in+infarcted+rat+hearts.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).</li><li>Akazawa, H., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+transcription+factor+Csx/Nkx2-5:+Its+role+in+cardiac+development+and+diseases.">Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases.</a> Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).</li><li>Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142, 375-386 (2010).</li><li>Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+a+direct+reprogramming+strategy.">Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy.</a> Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).</li><li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li><li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li><li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence.">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem Cells. 28, 704-712 (2010).</li><li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -. J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres.">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li><li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Yazarlar, çatışan çıkarlar beyan ederim. XHP Xcelthera kurucusu. XHP ve EYS hESC ile ilgili fikri mülkiyet var.

Gelişimsel çalışma ve klinik çeviri için en büyük zorluklardan biri, verimli ve öngörülebilir bir insan pluripotent kök hücrelerinin istenen bir fenotip geniş bir farklılaşma potansiyeli nasıl kanal olmuştur. Bu hücrelerde, bir multi-dizi toplama aşamasında giderek tüm germ hücrelerine in vitro kendiliğinden ayırt rağmen hESC elde edilen sadece çok soyundan agrega (embriyoid organları), hücreler çok küçük bir fraksiyonu (&lt;% 2) kendiliğinden kardiyomiyositlerde 13-15 (Şekil 1A) farklılaşırlar. Aşağıdaki immunoselection kardiyomiyositlerinin zenginleştirilmiş popülasyonları hayvan modellerinde 13 kalp içine enjeksiyonunu takiben, mekanik ve elektronik hasarlı miyokard fonksiyonu kurtarmak için biyolojik kalp pili olarak çalışması için başardık . Kemirgen enfarkte modelleri, engrafted hESC elde edilen kardiyak yavrularıyla hayatta ve 12 hafta kadar olgun ve kısmen remuscularyaralı kalp kasılma fonksiyonu 14,15 ize ve geliştirmek. Ancak, çok soyundan pluripotent hücreler farklılaşma ve Tümör Gelişimi aşağıdaki nakli yüksek risk ile insan kalp-taahhüt hücreleri üreten verimsizlik, ileri klinik çeviri engellemiştir. Sadece kalp fenotip ve öngörülebilir pluripotent hESC geniş bir farklılaşma potansiyeli kanal stratejileri geliştirme harnessing kalp alanında hESC biyoloji güç için hayati önem taşımaktadır. Belirli bir soydan insan pluripotent kök hücrelerinin düzgün bir dönüşüm elde etmek için, biz, sadece klinik olarak ilgili soy belirli bir pluripotent hESC iyi kontrollü verimli indüksiyonu için koşulları tanımlamak için farklılaşmamış hESC yayılması sigortalanması yeteneğine tanımlanmış bir kültür sistemi istihdam küçük moleküllerin basit bir hüküm (Şekil 1B) . Biz doğrudan p o nikotinamid bağlı kalp-dizi taahhüdüdaha yüksek verimlilik (Şekil 2) kardiyomiyositlerde yenerek ilerledikçe belirlenen kültür altında luripotent hESC. Nkx2.5 insan konjenital kalp hastalığı (KKH), en yaygın insan doğuştan gelen bir kusur 16 ile ilişkili olan genin normal kalp gelişimi ve mutasyonlar için vazgeçilmez bir evolutionally korunmuş homeobox transkripsiyon faktörü. Şimdiye kadar incelenen tüm omurgalıların İfadesi Nkx2.5 kalp habercisi hücreler için erken işaretleyici ve uygun kalp septasyon ve oluşumu / elektrik iletim sisteminin 16 olgunlaşması için gereklidir. Omurgalılarda, erken Nkx2.5 ifade başlangıçlı ve desen kabaca erken embriyogenez kalp şartname zamanlaması ve alanı ile örtüşmektedir ve Nkx2.5 gen kalp 16 geliştirilmesi yoluyla ifade edilmesi devam eder. HESC modeli, NAM, kalp-özel transcri ifade teşvik ederek pluripotent hESC doğrudan kalp indüksiyon tetiklemek için ortaya çıktıption faktör Nkx2.5 insan embriyonik cardiogenesis pluripotent epiblast cardiomesoderm özellikleri taklit edebilecek bir süreç. Gelecek çalışmalar, alternatif olarak rejeneratif tedaviler için klinik ile ilgili soy kaynaklanan küçük molekül aracılı hESC pluripotent kaderini doğrudan kontrolü ve modülasyon için önünü hangi insan kalp gelişiminde genetik ve epigenetik kontrol moleküller ortaya koyacaktır. NAM tedaviye gerek kalmadan, &lt;% 2 hESC kardiyomiyositlerde 12-15 yenerek kendiliğinden farklılaşma uğrayacaktır. NAM tedavi ile, insan embriyonik kalp gelişimi 12 taklit edebilecek bir süreç tanımlamak kültürün etkisi altında muhafaza hESC&gt;% 95&gt;% 50 embriyonik kalp öncüleri ve dayak kardiyomiyositlerde oluşturmak mümkün olmuştur. Son zamanlarda, bilinen kalp-kaderini belirleyen genlerin &lt;0.5% 17, 18 gibi düşük bir verimlilik ile doğum sonrası dayak kardiyomiyositlerde içine fare fibroblastlar transdifferentiate kullanılmıştır &lt;/&gt; Destek. Ancak, reprogrammed somatik hücre tarihsel anormal gen ekspresyonu ve engelli terapötik yarar 19-21 ile hızlandırılmış yaşlanması ile ilişkili olmuştur. Son olarak, burada kurulan protokol, iç hücre kütlesinden (ICM) veya 4,5 insan blastosist epiblast elde edilen pluripotent hESC sınırlıdır önceki morula elde edilen hayvansal kaynaklı EKH, EKH dahil olmak üzere diğer pluripotent hücreler için geçerli olmayabilir (sekiz-cell)-dönem embriyoların 22, ve yapay reprogrammed hücreler 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Biyobilim BD </td><td> 356231 </td><td> Düşük büyüme faktörü </td></tr><tr><td> İnsan laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nikotinamid </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out serum değiştirme </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM gerekli olmayan amino asit solüsyonu (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM amino asitler çözümü (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Insan insülini </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan aktivin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Tanımlı FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-sıra, ultra eklenti plaka </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-plaka </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Bugüne kadar, uygun bir insan kalp hücresi kaynağı eksikliği, ya da hücre tabanlı nakli veya kalp doku mühendisliği 1-3, yenileyici insan miyokardın en büyük gerileme olmuştur . Kardiyomiyositlerde doğumdan kısa süre sonra ölümcül diferansiye olur ve tomurcuklanmaya yeteneğini kaybeder. , Kemik iliği veya kordon kanı diğer kaynaklardan elde edilen kök / progenitör hücreler, kalp içine 1-3 nakli sonrası kontraktil kalp kası hücreleri yol açmaları mümkün olduğunu, hiçbir kanıt yoktur. Hasar gören kalp kası yeniden veya onarım ihtiyacı, yetişkin kök hücre tedavisi, ya endojen veya 1-3 hücre teslim yoluyla karşılanmaktadır olmamıştır . Genetik istikrarlı bir insan embriyonik kök hücreleri (hESC) pluripotent, ihtiyaç soy sınırlı olan insan somatik hücre büyük malzemeleri, in vitro türetme için bir rezervuar proffering, sınırsız genişleme yeteneği ve sınırsız plastisiteonarım ve yenilenme 4,5. Donör organların sıkıntısı, dünya çapında ve akut kardiyovasküler hastalık yaygınlığı nedeniyle, alternatif bir yaklaşım olarak gelişmekte olan hESC tabanlı tedaviler yoğun ilgi var. Ancak, istenen bir fenotip pluripotent hESC geniş bir farklılaşma potansiyelinin verimli ve öngörülebilir bir kanal nasıl gelişim çalışma ve klinik çeviri için önemli bir sorun olmuştur. Geleneksel yaklaşımlar genellikle fenotipik heterojenite ve istikrarsızlık, dolayısıyla Tümör Gelişimi 6-8 riski yüksek (bkz. şematik bir takip verimsiz ve kontrol edilemeyen bir soy-taahhüt, pluripotent hücrelerin spontan germ tabakası farklılaşma ile çok soyundan eğim güveniyor Şekil 1A). Buna ek olarak, tanımsız / yabancı hayvan biyolojik takviyeleri ve / veya izolasyon, genişlemesi ve hESC farklılaşma için genellikle kullanılan besleyiciler doğrudan kullanımı gibi hücre-speciali yapabilir9-11 sorunlu hastalarda zed greft. Bu engellerin üstesinden gelebilmek için, biz de novo klinik uygun hESC türetme için bir platform olarak hizmet hESC epiblast pluripotence sürdürülmesi için gerekli ve yeterli tanımlanmış bir kültür sistemi unsurlarının çözülmesi ve etkili bir klinik ile ilgili soy doğru düzgün gibi hESC yönetmenlik var küçük moleküller tarafından 12 (Şekil şematik bir bakın. 1B). Küçük moleküller ve büyüme faktörleri çok çeşitli tarama sonra, söz konusu tanımlanmış koşullar nikotinamid (NAM) (Şekil 2, daha yüksek verimlilik ile üretilen insan yenerek kardiyomiyositlerde cardioblasts ilerledi pluripotent hESC doğrudan cardiomesoderm özellikleri ikna etmek için yeterli hale bulundu .) Biz bir iyi-kontrollü verimli türetme sağlayan, bir çok soyundan embriyoid vücut sahne olmadan doğrudan cardioblasts pluripotent hESC indüksiyonu için koşullar tanımlananhücre tabanlı tedavi için gelişim evreleri yelpazesinde insan kalp hücrelerinin büyük kaynağı.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction at JoVE.com

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

efficient-derivation-human-cardiac-precursors-cardiomyocytes-from

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K Görüntüleme.  San Diego Regenerative Medicine Institute. Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.