Queremos agradecer a la Dra. Devin Gary por su visión y comentarios sobre el uso de células GRP.

Introducción En este protocolo se muestra cómo extraer, seleccionar y placa de precursores gliales restringidas (GRP), las células de la médula espinal de E13 fetos de ratones. Estas células son precursores de los primeros dentro de los linajes de células oligodendrocíticos y los astrocitos y se definen por su expresión de A2B5. En el medio de GRP suplementado con FGF-2, los GRPs A2B5 + comenzará expresar la temprana oligodendrocíticos linaje marcadores PDGFαR y 1,2 NG2. Estas células del linaje de oligodendrocitos pasar a través de una serie de distintas etapas fenotípicos, cada uno de ellos caracterizado por cambios morfológicos, así como la expresión de marcadores específicos a las etapas de desarrollo. Estas células precursoras se está estudiando actualmente como una fuente potencial de células basadas en enfoques terapéuticos en los trastornos de la materia blanca del sistema central nervioso, incluyendo la esclerosis múltiple, leucodistrofias y la leucomalacia periventricular (LPV) 3,4,5,6 </sa&gt;. Los estudios que utilizan cerebro humano derivado precursores de oligodendrocitos linaje han informado remielinización éxito en el cerebro de la modelo shiverer dysmyelination ratón así como en desmielinizadas modelos de médula espinal de roedores 6,7,8,9. Estas células precursoras gliales también se han utilizado en estudios de otros modelos de la sustancia blanca de enfermedades tales como la lesión de la médula espinal y la esclerosis lateral amiotrófica 10,11,12,13. Nuestro laboratorio ha desarrollado un postnatal temprano hipoxia-isquemia modelo de ratón con el que están evaluando la eficacia de estas células derivadas de la médula espinal GRP como un enfoque restaurativo en el LPV, la principal causa de la parálisis cerebral 14,15,16. También hay un cerebro de roedores derivado modelo OPC que ha sido ampliamente utilizado para el estudio de lesiones sustancia blanca ya que las células GRP tienen una tendencia a diferenciarse en la vía astrocítico 17. El fenotipo OPC ya ha entrado en la vía linaje de los oligodendrocitos, un fenómeno que parece irreversible. Sin embargo, estamos interesados ​​en evaluar la respuesta de un espectro más amplio de los progenitores de oligodendrocitos como GRPs y, posiblemente, incluso los derivados NEPs en E10.5. Por esta razón, hemos adoptado el modelo de la médula espinal deriva de GRP para nuestro trabajo. Además de la utilización de GRP para el reemplazo de células, la derivación de estas células de tipo salvaje y modelos transgénicos de roedores de las enfermedades de la sustancia blanca permite el estudio adicional en la diferenciación glial en condiciones normales y la enfermedad en una configuración en in vitro. Publicaciones previas muestran evidencia de la vulnerabilidad selectiva de las células del linaje oligodendrocíticos precursor de diversos factores de estrés externos, como la excitotoxicidad del glutamato dependiente de la maduración, el estrés oxidativo y los factores implicados en la neuroinflamación seleccionados 18,19. Nuestros estudios se han centrado en la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes al desarrollo de estas lesiones de sustancia blanca, la evaluación de la susceptibilidad de las células en elel espectro de linaje de los oligodendrocitos a insultar, así como el análisis de supuestos enfoques terapéuticos. Materiales Todos los procedimientos con animales se ajustan a la política de PHS y el IACUC JHU. Todos los procedimientos se debe realizar en una campana de flujo laminar a fin de mantener condiciones asépticas. Comúnmente disecciones se realizan en una campana de flujo horizontal y en el trabajo in vitro en una campana de flujo vertical. Todos los medios utilizados frío durante la disección. Los ratones usados ​​en nuestro estudio son un tipo salvaje cepa CD-1 y un transgénico GFP en un fondo C57/BL6. Un CD-1 presa de ratón produce normalmente 10 + fetos que son suficientes para semillas 1-2 T25 frascos. Típicamente, dos diques se sacrifican a la vez y fetales médulas espinales reunieron y se sembraron en un matraz T25 por presa. Una vez que las células han sido derivados que se pueden expandir y caracterizado in vitro para estudios posteriores. 1. Preparación de los Medios de Comunicación y Frascos <ul type="disc"><li> GRPmedio se utiliza como medio de disección: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x; Invitrogen), N2 (100x; Invitrogen), suplementos y albúmina sérica bovina (BSA; 0,5% w / v). </li><li> Disociación medio: igual que el medio de la disección. </li><li> El medio de cultivo: medio GRP + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) y heparina (1 mg / ml, Sigma). </li><li> PLL / laminina revestidos o 75 cm 2 25 cm 2 frascos (T75 o T25). </li><li> Matraces de cultivo de tejidos (75 cm 2, Falcon) se recubrieron con 15-20μg/ml poli-L-lisina (PLL; Sigma) en H 2 O destilada, se incuban a 37 ° C durante 1 hora luego aspirada. Los matraces se lavaron con PBS 1X reviste entonces con 15-20 mg / ml de laminina (Sigma) en PBS a 37 ° C durante 1 hora, a continuación, aspirados y fresco PBS o medios añadido hasta que las células están listas para ser chapado. Después del recubrimiento, matraces nunca debe dejarse secar pero se puede mantener en PBS o medio a 4 ° C durante períodos breves antes de su uso. </li></ul> 2. Instrumentos y otros material <ul type="disc"><li> Placas de Petri: 4 por represas: 3 placas de Petri para la disección (75 mm), un plato de 20 mm para la recogida de los cordones espinales cosechados. </li><li> Tijeras grandes (43 mm de operación tijera, Roboz) y pinzas de tejidos para abrir el abdomen de la presa s. </li><li> Pequeña tijera para disecar el útero y la eliminación de los fetos (15 mm Micro Tijeras de disección, Roboz). </li><li> Micro Tijeras de disección de primavera (6 mm) para diseccionar la médula espinal de los fetos. </li><li> Micro pinza de disección en ángulo para el anclaje del cuerpo de la presa y el feto durante la cirugía y más tarde la eliminación de la médula espinal, una vez expuesta. </li><li> 40 o 70 micrómetros filtro de células para eliminar los desechos celulares antes de chapado. </li><li> 0,05% de tripsina precalentada a 37 ° C. </li><li> 10 mg / ml de ADNasa 1 (Sigma), preparado como un stock de 100x (1 g / ml). </li><li> Bio-Hazard bolsa para cadáveres de animales. </li><li> 15 y 50 ml tubos de centrifugación para el procesamiento de extraer la médula espinal. </li></ul> 3. La determinación de temporizado Pregnancy Presas embarazadas del ratón o bien se ordenó a partir de fuentes comerciales que especifican la entrega en el día embrionario E12 o E13 del desarrollo del feto o el embarazo determina en casa. En resumen, dos mujeres se colocan junto a un macho en el final de la tarde y dejó toda la noche juntos. Al día siguiente las hembras se observó la presencia de la clavija de moco vaginal localizado. El tapón de moco es sólo una indicación de que se haya producido tan apareamiento animales se pesaron diariamente posteriormente para controlar la tasa de aumento de peso. El día se observa el tapón mucoso se define como un día embrionario (E1). 4. Derivación del tejido <ol><li> Trabajar bajo una campana de flujo horizontal para mantener las condiciones asépticas. </li><li> Rociar abajo de la campana y el área de trabajo con etanol al 70%. </li><li> Autoclave instrumentos o spray generosamente con etanol al 70%. </li><li> Preparar los instrumentos, medios, y un microscopio para su uso. </li><li> Verter 20 ml de medio de disección en frío en el estéril di Petrish. </li><li> Anestesie animal con hidrato de cloral (500 mg / kg) administrado por vía intraperitoneal (IP), seguido por dislocación cervical o decapitación. </li><li> Rocíe la zona abdominal de la madre con el 70-90% de etanol (desinfección) </li><li> Abra el abdomen con tijeras grandes y pinzas. <ol type="a"><li> En CD1 y C57/BL6 cepas: Por lo general, los fetos de 8 a 14 será en el interior del útero. El número de fetos es dependiente de la cepa. </li></ol></li><li> Extraer el útero de ratón incluyendo los cachorros y el lugar en medio fresco disección en frío en una placa de Petri limpia para lavar la sangre y los restos de tejido de un feto. </li><li> Extraiga cada feto desde el cuerno uterino y separarlos de la embrionaria saco y la placenta con las tijeras pequeñas. Transferencia de los fetos extraídos en el medio de disección fresco en una nueva placa de Petri. <ol type="a"><li> La disección medio debe estar a temperatura baja para reducir la actividad metabólica y preservar la viabilidad de las células derivadas. </li><li> Trabajar a partir de ahora con dos pinzas ymicro-tijeras de disección de primavera. </li></ol></li><li> Trabajando bajo microscopio de disección, corte la piel a lo largo de la médula espinal con las tijeras quirúrgicas y micro exfoliación de la piel para dejar al descubierto la médula espinal. </li><li> Transecto la médula espinal con las tijeras de microcirugía aproximadamente C1 y al comienzo de la cola. </li><li> Retire la médula espinal con unas pinzas romas, asegurar que todos los huesos y los cartílagos se retiran y se transfiere al 3 de placa de Petri de la disección de mediano plazo. </li><li> Para evitar el crecimiento excesivo de tejido meníngeo en cultivos celulares posteriores tratan de eliminar la mayor cantidad de las meninges como sea posible de la médula espinal. Debido a las nacientes sobresalen nervios periféricos esto es más difícil que la eliminación de tejido de cerebro meníngea extraído. </li><li> Una vez que se han eliminado las meninges, transferir médulas espinales a 20 mm de placa de Petri </li><li> Limpiar a fondo por pulverización el área con 70-90% de etanol. </li><li> Los siguientes pasos para la disociación se debe hacer rápidamente para mantener launa alta viabilidad de los tejidos de la médula espinal derivada. </li></ol> 5. Cultura Establecimiento <ol><li> Tripsina debe ser pre-calentado por lo menos durante 30 minutos en un 37 ° CH 2 O-baño. Una alícuota apropiada debe ser retirado de la población para reducir la exposición de las acciones a las fluctuaciones de temperatura. </li><li> Transferir los cordones espinales cosechadas a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenía 10 ml pre-calentado tripsina (0,05%; Calidad Biologicals) y 100 l ADNasa (10 mg / ml) y se tritura brevemente. </li><li> Incubar en 37 ° CH 2 O-baño durante 10 minutos. </li><li> Se tritura y se incuba durante otros 10 minutos. </li><li> Añadir 5 ml de medio de GRP (definido más arriba) y se centrifuga durante 5 min a 1000 rpm. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender precipitado con 10 ml de medio de GRP y añadir DNAsa-1 (10 mg / ml, Sigma). </li><li> Incubar en 37 ° CH 2 O-baño durante 10 minutos. </li><li> Centrifugar 5 min a 1000 rpm y aspirar sobrenadante. </li><li> Resuspender el pellet con frecuenciash medio de GRP entonces filtro de residuos con un 40 a 70 micras filtro de células. </li><li> Placa de PLL / laminina recubierto frascos de 25 cm2 (T25) y se incuba a 37 ° C, 95% de humedad y 5% de CO 2. </li><li> 100% de cambio en los medios de comunicación tras día. </li><li> En este punto, GRPs han unido y comenzó a extender los procesos. </li></ol> 6. Immunopanning la población GRP <ol><li> Placa de tejido de la médula espinal en el PLL / laminina frascos revestidos hasta el frasco es 85-90% confluente o alrededor de una semana. </li><li> Cosecha células por raspado matraz con un policía de caucho o con 0,05% de tripsina, se tritura bien pero con suavidad, centrifugar a 1000 rpm durante 5 min y se resuspende el sedimento a fondo con 3 ml de medio de GRP. </li><li> Transferir 1 ml cada una a 3 frascos T25 o 3 ml de un frasco de T75 añade un volumen adecuado de medio para cubrir por completo las células y permitir que los matraces a alcanzar el 80-90% de confluencia. </li><li> Cambiar los medios de comunicación cada dos días, antes si a medio agota rápidamente. </li><li> Escudo bacteriológicas Peplatos tri (75 mm) durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo IgM anti-ratón (Southern Biotech), 10 mg / ml en PBS. </li><li> Aspire el exceso de tampón y lavar los platos de Petri 3x con PBS. </li><li> Añadir A2B5 anticuerpo (Millipore) a una concentración de 5 mg / ml diluido en PBS y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). </li><li> Lavar las placas 3 veces con PBS nuevo y se añaden 8 ml de medio de GRP para evitar el secado de la placa. </li><li> Transferir 5 ml de medio de Fibra de placas de Petri y las células de la cosecha de PRFV por raspado de frascos con un policía de goma para extraer todas las células </li><li> Triturar una breve suspensión de células para disgregar los grumos y transferir 5 ml de suspensión de células a las placas revestidas A2B5 bacteriológicos de Petri. </li><li> Incubar 1 hora a temperatura ambiente sin agitación. </li><li> Después de 1 hora y media de aspirado y lavado de las placas de 8x con PBS. </li><li> Raspe suavemente las células con un policía de goma en 2 ml de medio GRP luego se transfieren a PLL / laminina placas recubiertas o frascos con el volumen apropiado de medio de GRP. </li&gt; </ol> 7. Congelación y almacenamiento de las células derivadas de <ol><li> Las células se recolectan a partir de un 85-90% confluentes T25 o T75 frasco con 2 ml de tripsina 0,05%. </li><li> La tripsina se diluye y se inactiva con medio 8ml stock de GRP y se centrifuga a 1000 rpm durante 5 min. </li><li> Los pellets de T25 matraces se resuspendieron en 1 ml de medio de congelación de GRP, (GRP medio suplementado con 10% (v / v) de DMSO y, opcionalmente, FBS al 20%). Los gránulos más grandes de frascos T75 se diluyó dos veces. </li><li> Las suspensiones celulares de 1,5 a 3 x 10 10,11,12,13 células se transfieren a viales criogénicos (Nalgene) y se almacenó durante la noche en un recipiente criogénico (Nalgene) que contiene isopropanol a -80 ° C a congelar lentamente durante la noche. </li><li> Después de una noche congelar las células se transfieren a las cajas de congelador y almacenado de 6 meses a 1 año a -80 ° C oa más largo plazo en N (l). Las células descongeladas son típicamente 60-80% viables dependiendo en gran medida la calidad del revestimiento PLL / laminina. </li></ol&gt; 8. Los resultados representativos De CO 2 no se utiliza para anestesiar al animal, debido a los posibles efectos aguas abajo de la viabilidad de los fetos y en última instancia, las células derivadas. Además, será muy difícil de eliminar totalmente las meninges de la médula espinal durante el procedimiento de derivación, pero la combinación de medio de GRP y immunopanning eliminará estas células de crecimiento rápido. Del mismo modo, la médula espinal entera se cosecha a pesar de una mayor concentración ventral de la población GRP debido a su origen en la médula espinal ventral y dorsal, la migración de 20. Sin embargo el medio GRP selecciona para el fenotipo de GRP y que la población se maximiza por A2B5 immunopanning. Después de enchapado tejidos de la médula espinal, los cultivos in vitro se incuban durante dos pasajes, o alrededor de una semana. Después de 2 días en cultivo, las células de diferentes morfologías se puede observar en los matraces de cultivo de tejidos que indican el heteroheterogeneidad de la población, pero el medio GRP selecciona para el fenotipo de GRP. Estas células son una combinación de A2B5 + GRP, E-NCAM + precursores neuronales restringidas (PNR) y nestin + y A2B5-neuroepiteliales y células, posiblemente, la fibronectina + meníngeos. Además, los fenotipos más maduras pueden estar presentes marcadores que expresan incluyendo doublecortin y Tuj1 para linaje neuronal, para GFAP astrocitos y PDGFaR y Galc para linaje oligo A fin de maximizar una población altamente enriquecido de GRP de la piscina de partida heterogéneos (Figura 1A), las células pueden ser doble immunopanned para seleccionar y eliminar los NCAM-E + células seguido por la selección para la A2B5 + población de GRP vez densidad celular ha aumentado hasta aproximadamente 85-90% de confluencia en frascos T75. Estas células GRP mantener su capacidad de convertirse en astrocitos pesar de estar en un medio que selecciona para el fenotipo oligodendrocitos tan posterior A2B5 immunopanning puede ser necesario para mantener una población altamente enriquecido de GRP. Immunopanning Generrendimientos aliado hasta un 95% A2B5 + células pero para un rendimiento aún mayor A2B5 perlas magnéticas conjugadas (Miltenyi Biotec Corp.) se puede utilizar para proporcionar un rendimiento de hasta 97%. Vigilancia en las culturas de mantenimiento GRP como cambios en los medios regulares minimizar la proliferación de tipos de células no-GRP. Incluso en ausencia de BMP-4 los astrocitos pueden todavía ser encontrados y el agotamiento de los medios de comunicación, en particular, parece inducir la diferenciación a un fenotipo astrocitos. Aunque el suplemento B27 contiene triyodotironina hormona (T3), no ha habido ninguna tendencia observada para diferenciarse en oligodendrocitos en la población de GRP, sólo cuando los niveles más altos de T3 se añaden al medio de este fenómeno se produce. Sin embargo, un T3 libre B27 suplemento puede ser sustituido si hay una preocupación por la contaminación por los oligodendrocitos maduros (Figura 1B). Estas células GRP pueden ser fácilmente identificados por su morfología de soma pequeño con 2 o 3 procesos cortos pero para la detección de otros tipos de células que pueden estar presentes, immunocytochemistry se puede realizar para los anteriormente nombrados marcadores comunes de desarrollo y tipo de células específicas. Hay normalmente será una pequeña población persistente de A2B5 células que son neuroepitelial (NEP) y capaz de convertirse en cualquiera de GRP o PNR. Afortunadamente, las células más largos se mantienen en el medio de GRP es más probable que el medio se selecciona para el fenotipo de GRP. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" /> Figura 1. Una) chapados en las células de la médula espinal de morfología heterogénea se observan después de 2 días en cultivo. B) Immunopanning maximiza una altamente enriquecido de GRP población de la piscina de partida heterogénea.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-permeable+AMPA/kainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors.">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li><li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia.">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li><li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+white+matter:+clinical+and+pathophysiological+aspects.">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li><li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripotential+glial-restricted+precursor+(GRP)+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord:+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function.">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li><li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord.">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li><li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins.">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li><li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li><li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter.">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li><li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li></ol>

Este estudio fue financiado por el Instituto Nacional de Salud [P30HD024061 NICHD (PTA), NINDS K08NS063956 (AF), y R01NS028208 (MVJ)] y la Fundación de Neurología Infantil. El contenido de este informe son de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Salud, DHHS. Los autores no tienen conflictos de interés relevante para este estudio.

<p class="jove_content"&gt; Trastornos de la materia blanca del sistema central nervioso incluyen un gran número de causas, incluyendo las causas genéticas, inflamatorias, isquémica y tóxica<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. Aunque la esclerosis múltiple y vasculopatías son la principal causa de la enfermedad de la materia blanca en los adultos, leucomalacia periventricular asociada a la prematuridad es la causa más común de lesión de la sustancia blanca en la población infantil. Con el fin de definir con mayor precisión los mecanismos de la enfermedad de estudio del linaje de células ofoligodendrocytic, que se ven muy afectados por el insulto perinatal, es necesario. GRPs fueron aisladas de la médula espinal de embriones de roedores y han demostrado ser tripotential en la naturaleza, dando lugar a oligodendrocitos y dos poblaciones distintas astrocitos, pero no se diferencian en neuronas<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. Del mismo modo, las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) derivados de nervio óptico de rata y en el cerebro postnatal tardía o principios de embriones de rata se ha demostrado que madurar y convertirse en oligodendrocitos que funcionan en las condiciones adecuadas de los medios de comunicación<sup&gt; 27,28</sup&gt;. Además, fetal o adulta humana derivada OPC han sido más manipulado en los fenotipos de oligodendrocitos más maduros<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Células GRP se han aislado tanto de la médula espinal de ratas E13.5 y E12-13.5 en los ratones. En las diferencias de rata se han reportado entre las células GRP-dorsal y ventral derivado-en su respuesta a las condiciones que promuevan la generación de oligodendrocitos, astrocitos o ventral, con derivados de GRPs que presenta una mayor tendencia a diferenciarse en los fenotipos más maduros<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. Esto es puede ser debido a la migración ventral a dorsal de las células GRP nacientes, que podrían ser menos receptivos a las señales de diferenciación. Immunopanning permite la subpoblación que expresa A2B5 que ser aislado y se recoge para el mantenimiento de la cultura.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nuestras culturas GRP de ratón se derivan de tejido total de la médula espinal que produce una población heterogénea, agrupado de células de las cuales las células de PRFV son seleccionados por química (medio) y las técnicas basadas en anticuerpos. Aunque nuestros estudios han utilizado las derivadas de la médula espinal de ratones células GRP, que recientemente ha sido informado de la obtención de células progenitoras derivadas del cerebro del ratón de oligodendrocitos que también son capaces de transformarse en oligodendrocitos maduros<sup&gt; 31</sup&gt;. Aquí las células derivadas inicialmente se cultivaron como oligospheres que el uso del medio de cultivo apropiado son manipulados en un PDGFαR enriquecida +, la población de OPC<sup&gt; 31</sup&gt;. Nuestros estudios se han centrado en el efecto de nuestro modelo de insulto hipóxico-isquémica en las células en el espectro de linaje de los oligodendrocitos del A2B5 + y PDGFαR-GRP precursores de la proteína básica de mielina (MBP expresar XXX oligodendrocitos maduros. De hecho, nuestro<em&gt; In vitro</emCaracterización&gt; ha demostrado que estas células inmaduras GRP madura en las células que expresan MBP, ya sea en monocultivo o en co-cultivos con las neuronas corticales. Estas células pueden ser manipuladas en cultivo en vías de diferenciación específicos para el estudio de los mecanismos implicados en la lesión perinatal materia blanca. Hay varios modelos de ratones de enfermedades de la sustancia blanca que implican las células del linaje de los oligodendrocitos y la disponibilidad de esta población permite una exhaustiva investigación sobre los mecanismos que provocan la lesión, así como para explorar la utilidad de las posibles opciones de terapia celular.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> DMEM / F12 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> HR-FGF-básico </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> Tripsina (0,05%) con EDTA </td><td> De calidad biológica, Inc. </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina HBr </td><td> Sigma </td><td> P1274-25MG </td></tr><tr><td> La laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020-1mg </td></tr><tr><td> DNasa 1 </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

derivation of glial restricted precursors from e13 mice

Este es un protocolo para la derivación de los precursores gliales restringidas (GRP), las células de la médula espinal de E13 fetos de ratones. Estas células son precursores de los primeros dentro del linaje de células oligodendrocíticos. Recientemente, estas células han sido estudiadas como fuente potencial de las terapias de restauración en las enfermedades de la sustancia blanca. Leucomalacia periventricular (LPV) es la principal causa de la no-enfermedad genética materia blanca en la infancia y afecta hasta un 50% de los recién nacidos extremadamente prematuros. Los datos sugieren una mayor susceptibilidad del cerebro en desarrollo a la hipoxia-isquemia, estrés oxidativo y excitotoxicidad que se dirige selectivamente la materia blanca naciente. Gliales precursores restringidos (GRP), las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) y oligodendrocitos inmaduros (preOL) parecen ser los principales actores en el desarrollo de LPV y son objeto de continuar los estudios. Además, estudios previos han identificado un subgrupo de tejido del SNC que ha aumentado la susceptibilidad a la excitotoxicidad del glutamato comoasí como un patrón de desarrollo a esta susceptibilidad. Nuestro laboratorio está investigando el papel de los progenitores de oligodendrocitos en las células de CVP y el uso en la etapa de Fibra de desarrollo. Nosotros utilizamos estas células derivadas de PRFV en varios paradigmas experimentales para probar su respuesta para seleccionar las tensiones en consonancia con LPV. Células GRP puede ser manipulado in vitro en los OPC y preOL de experimentos de trasplante con los modelos de ratón de CVP y en modelos in vitro de PVL-como insultos como hipoxia-isquemia. Mediante el uso de células cultivadas y en estudios in vitro no se reduce la variabilidad entre los experimentos que facilita la interpretación de los datos. Las células cultivadas también permite el enriquecimiento de la población de GRP y reducir al mínimo el impacto de la contaminación de las células de no-GRP fenotipo.

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Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Este protocolo describe la derivación de gliales Precursores restringidos de fetales médulas espinales y mantuvieron in vitro ya sea para el trasplante o para el estudio de linaje oligodendrocíticos.

Derivación de los precursores gliales restringidas de los ratones E13

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

derivation-of-glial-restricted-precursors-from-e13-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K vistas.  Johns Hopkins University. Este protocolo describe la derivación de gliales Precursores restringidos de fetales médulas espinales y mantuvieron in vitro ya sea para el trasplante o para el estudio de linaje oligodendrocíticos.

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Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Investigación

Neurociencias

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Preparación de mezcla de culturas gliales primarios de ratón adulto espinal tejido del cordón

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Derivación de las leptomeninges de explantes de culturas postmortem Humanos Los donantes de cerebro

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en precursores corticales interneurona

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

Implantación de la cánula en la Cisterna Magna de roedores

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

Grabación espacial restringido a oscilaciones en el hipocampo de ratones de comportarse

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic trasplante de precursores de interneurona en cerebros de ratón Postnatal temprana

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...