Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

El siguiente protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Nueva Inglaterra. El siguiente protocolo es para la preparación de cultivos gliales de la médula espinal 4 de ratón adulto. 1. Preparación de las soluciones en una campana de cultivo bajo condiciones asépticas <ol><li> Preparar medios de cultivo: modificación del medio de Eagle (cDMEM) que contiene DMEM completo de Dulbecco (con 4,5 g / l de glucosa), 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina , 250 ng / ml de anfotericina B y 50 mM 2-mercaptoetanol (2-ME; véase el punto 1.1.1). Mezclar y filtrar esterilizar todos los demás componentes y luego añadir FBS. Almacenar los medios de cultivo a 4 ° C. <ol><li> Preparar 50 mM 2 ME-/ solución salina tamponada con fosfato solución madre (PBS): Añadir 100 ml de concentrado 2-ME (14,3 M) en 28,6 ml de PBS 1x, y esterilizar el filtro (la solución se puede almacenar a 4 ° C durante varios meses). TSE 1 ml de 2-ME solución de reserva por cada 1.000 ml de medio de cultivo. </li></ol></li><li> Preparación de los medios de gradiente de densidad <ol><li> Preparar una solución isotónica medios de gradiente de densidad de valores (por ejemplo, el 100% de Percoll) a partir de 1 parte de 10x PBS estéril regular y 9 partes de medios de gradiente de densidad estéril de valores (por ejemplo, Percoll). </li><li> Diluir los medios de gradiente de densidad de 100% (hecho en 1.2.1) con 1x regular de PBS estéril para hacer un medio de gradiente de densidad de 20% (por ejemplo, 10 ml de medio de gradiente de densidad de 100% con 40 ml de 1x PBS) y almacenarla en 4 o C. Llevar los medios de gradiente de densidad de 20% a temperatura ambiente (TA) antes de preparar el cultivo celular. </li></ol></li><li> Preparación de las soluciones del sistema de disociación de papaína NOTA: El sistema de disociación de papaína puede ser identificado en la Tabla de Materiales. Otros kits de disociación similares (incluyendo los reunidos en la casa) también se pueden utilizar. Todo Components deben ser estériles. <ol><li> Añadir 32 ml de solución salina equilibrada de Earle (EBSS) a la mezcla de inhibidor de ovomucoide (polvo). </li><li> Añadir 5 ml de EBSS a un vial de papaína (polvo). Coloque el vial de la papaína en un 37 ° C baño de agua durante 10 minutos o hasta que la papaína se disuelve. </li><li> Añadir 500 l de EBSS a un vial de DNasa (polvo). Mezclar suavemente. </li><li> Añadir 250 l de la solución de DNasa (arriba) al vial de la papaína. </li><li> Calcular la cantidad total de la mezcla de papaína / DNasa anterior es necesario (aproximadamente 800 l de mezcla de papaína / DNasa por ratón médula espinal) y transferir la mezcla necesaria en un tubo de 50 ml para la digestión del tejido (paso 3.2). Almacenar el sobrante en el vial original a 4 ° C durante al menos dos semanas. </li><li> Mantenga todos los componentes de los kits en hielo hasta que se necesite. </li></ol></li><li> Preparar tubos de recogida de la médula espinal: un tubo estéril de 15 ml con 5 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS; del sistema de papaína disociación,0; para la recogida de la médula espinal) y un tubo estéril de 15 ml con PBS 1x (para llenar la jeringa de 5 ml, véase el paso 2.4). Además, preparar una placa de Petri estéril (35 mm o 60 mm) con 5 ml de HBSS y mantenerlo en la campana de cultivo. </li></ol> 2. Colección de la médula espinal NOTA: Todo el equipo debe ser estéril. Realizar la recolección en un área designada aprobado por el IACUC. <ol><li> Obtener las siguientes herramientas para las médulas espinales de recolección de ratón: tijeras rectas afilados / romos de 18 cm quirúrgicos, un bisturí de 12 cm estándar (# 3 sólido), de acero al carbono hojas de bisturí estériles Nº 10, una pequeña decapitator animal, de 12 cm estándar curvada fórceps y una aguja 20G estéril unida a una jeringa de 5 ml. </li><li> La eutanasia a los animales con CO2 y desinfectar la cabeza de ratón y la región trasera con un 70% de etanol (EtOH). </li><li> Decapitar al animal con decapitator. Hacer una incisión longitudinal medio de la espalda baja para exponer la capa muscular. Haceruna transección limpia a través de la columna de vertebrados en el nivel de la cadera (también cortar a través de la capa muscular que cubre la columna de vertebrados) con las tijeras quirúrgicas estériles rectas (18 cm). </li><li> Colocar el animal en una hoja de fresca toallita desechable. Con cuidado, inserte la aguja G 20 (que se adjunta a una jeringa de 5 ml lleno de PBS 1x estéril (paso 1.4)) en la columna vertebral hacia el lado rostral. Mantenga el animal hacia abajo con fuerza y ​​empuje la jeringa rápidamente. Toda la médula espinal debe salir desde el extremo del cuello uterino. Recoger la médula espinal en el tubo que contiene 15 ml de HBSS. </li><li> Repita el paso 2.4 para el resto de los ratones. Entre cada animal, desinfectar todos los instrumentos utilizados con EtOH al 70%. NOTA: Por lo general, una sola placa de 12 pocillos se puede establecer por cada 4 médulas espinales de ratones (véase 4.3). </li></ol> 3. Preparación de la suspensión de células únicas Nota: Realice los pasos 3 y 4 en una campana de cultivo para mantener todo estéril. <ol><li> Transferir todos los cables de la columna vertebral en la placa de Petri que contiene HBSS-(paso 1.4). Cortar cada una de las médulas espinales en muchos, pequeños trozos finos con tijeras y pinzas estériles. Transferir el tejido de la médula espinal al tubo cónico de 50 ml que contiene la papaína preparado / mezcla de enzimas ADNasa (etapa 1.3.5) usando pinzas estériles o una pipeta ml 10 (evitar la adición de HBSS a la mezcla de enzimas, ya que esto va a diluir aún más la preparó solución de enzima y puede resultar en una disminución del rendimiento de la enzima). </li><li> Vortex el tubo suavemente para mezclar. Incubar el tubo a 37 ° C durante 1 h en un incubador / agitador con agitación orbital a 150 rpm. </li><li> Vortex el tubo de nuevo y vigoroso triturar la solución de enzima con el tejido usando una pipeta de 5 ml para promover aún más la disociación. </li><li> Transferir la suspensión celular en un tubo de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA. </li><li> Durante la centrifugación, mezclar 2,7 ml de EBSS con 300 l de reconstituido inh albúmina ovomucoidesolución ibitor (1.3.1) en un tubo estéril. Añadir 150 l de la solución de DNasa (etapa 1.3.3). </li><li> Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con la solución preparada anteriormente (paso 3.5). Vortex bien para romper el sedimento celular. </li><li> Añadir 3 ml de solución reconstituida albúmina ovomucoide inhibidor (etapa 1.4.1) a la suspensión celular. centrifugar las células a 70 xg durante 6 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante (que contiene fragmentos de membrana). </li></ol> 4. eliminación adicional de la mielina de la suspensión de células únicas <ol><li> Añadir 8 ml de medio de gradiente de densidad de 20% (preparado en la etapa 1.2.2) en el tubo que contiene el sedimento celular, vórtice suavemente para perturbar el sedimento, y centrifugar las células a 800 xg durante 30 min a TA sin frenado. Retire cuidadosamente la capa superior de los desechos (en su mayoría de mielina) y el sobrenadante, pero mantener el sedimento. </li><li> Para eliminar restos de la gradiente de densidad, se lavan las células por resuspending el sedimento celular con 8 ml de una cDMEM diluido (1 parte cDMEM y 2 partes HBSS). Centrifugar las células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y lavar las células de nuevo con la cDMEM diluido (arriba) de la misma manera. Mantener las células en hielo hasta la siembra de ellos. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en medio de cultivo (cDMEM suministra con 2-ME (preparado en el paso 1.1)). Para una placa de 12 pocillos, utilice 3 ml x 4 (número de ratones utilizados) + 2 ml = 14 ml de medios de comunicación. Esto asegurará que haya suficiente suspensión de células para toda la placa (12 pocillos) y proporcionará para pozos adicionales que se pueden utilizar para determinar el número promedio de células por pocillo y el contenido microglial de la cultura. Si se van a utilizar otros tipos de recipientes de cultivo, calcular el volumen total de medios de cultivo necesario proporcionalmente. </li><li> Añadir 1 ml de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. </li><li> Se incuban las células a 35,9 ° C con 5% de CO 2. </li><li&gt; Cambiar los medios de comunicación (quitar los viejos medios a través de aspiración) en D1 y luego cada 3 - 4 d a partir de entonces (normalmente cambiar el soporte de D: 1, 4, 8 y 11, y luego usar las células en el día 12). NOTA: En los días 1, el cultivo puede contener cantidades significativas de desechos debido a la mielina residuo desde el tejido de la médula espinal; por lo tanto, se recomienda cambiar los medios de comunicación en el día 1 (véase la discusión para más información). Los cultivos están listos para el tratamiento entre D 12 - 14. Las células son por lo general 80% de confluencia en D 12 y pueden ser de casi el 100% de confluencia de D 14. Por lo general, el D 12, hay cerca de 100.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos . </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> Figura 2:. Imágenes representativas de células gliales mixtas en diferentes momentos después del establecimiento de la cultura glia mixto glia mixtos médula espinal primarios se prepararon a partir de adultos C57BL / 6 ratones. imágenes representativasmostrar el progreso de la cultura gliales después de la siembra. Al día 1, algunas células se unen a la placa de cultivo, pero todavía están en su mayoría ronda. También hay muchas células flotantes y escombros significativa. Al día 4, la mayoría de las células están unidas a la placa de cultivo. Las células aparecen ramificada con los procesos visibles. Las células se distribuyen de forma esporádica y las culturas son aproximadamente 20-30% de confluencia en este momento. En el día 8, las culturas son entre un 50-60% de confluencia. Algunas áreas de las culturas tienen grandes parches de células. Otras áreas de las culturas tienen escasa crecimiento de las células. Algunas células dentro de los parches adquieren una apariencia &quot;cuadrado-como&quot;. Al día 12, los cultivos están en o por encima de 80% de confluencia (confluencia de 90% en la imagen que se muestra aquí). De células se encuentran en la fase logarítmica de crecimiento en este momento y entre los días 12-14 es el momento óptimo para el uso de las células de la glia para los experimentos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una</a>versión más grande de esta figura. <ol start="7"><li> Examinar el contenido de la microglia utilizando células de los pozos adicionales (paso 4.3) a través de células activadas por fluorescencia estándar (FACS) protocolo de tinción 11 usando la combinación de anti-ratón-CD45 y anticuerpos monoclonales anti-CD11b ratón. Células CD45 + CD11b + se identifican como microglia. </li></ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+icroglia:+isolation,+culturing+and+selected+applications.">Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications.</a> Curr Protoc Toxicol. , (2010).</li><li>Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+interleukin-1beta+by+interleukin-4+in+lipopolysaccharide-treated+mixed+glial+cultures:+microglial-dependent+effects.">Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects.</a> J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).</li><li>Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain.">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li><li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+/+v-myc+carrying+retrovirus.">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li><li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells.">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li><li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4.">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li><li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella.">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li><li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells.">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li><li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+Infiltrating+CD4(+)+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain.">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li><li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability,+tumor+necrosis+factor-alpha,+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia.">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).</li><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections.">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li><li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology.">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Es fundamental para llevar a cabo todos los pasos, incluyendo el cambio de horario, de manera coherente con el fin de obtener resultados reproducibles entre los experimentos medios de comunicación. Los siguientes pasos son particularmente críticos para obtener una excelente calidad de adultos glía mixta. La digestión enzimática es un aspecto importante de este protocolo. Es crucial que las piezas de tejido son bien digerido con el fin de obtener una suspensión de células individuales....

El dolor crónico es un problema de salud grave que afecta a aproximadamente 100 millones de adultos en los Estados Unidos, con un coste anual estimado de hasta $ 635 billón 1. La creciente evidencia ha indicado una contribución significativa de las células gliales de la médula espinal en el desarrollo del dolor neuropático, uno de los tipos más devastadores de dolor crónico 2. Un sistema adecuado de cultivo in vitro podría ayudar significativamente en la investigación aún más las funciones de las células gliales en los niveles celular y molecular. En la actualidad, los sistemas de cultivo in vitro gliales en utilizadas por los investigadores incluyen principalmente células gliales derivadas de tejidos corticales neonatales de ratón o rata cerebros y inmortalizados líneas de células gliales derivadas de ratón o rata neonatal células gliales primarios. células neonatales contienen un número significativo de células no diferenciadas que se pueden diferenciar aún más en las células gliales (astrocitos y microglia principalmente), proporcionando así unacélulas bundant para el uso experimental 3. Sin embargo, nuestro estudio anterior ha demostrado que las células gliales del cerebro neonatal respondieron significativamente diferente de las células gliales de la médula espinal para adultos a la estimulación de lipopolisacárido (LPS). Por ejemplo, la interleucina (IL) -4 muestran mejorada efectos inhibidores sobre el óxido nítrico inducida por LPS (NO) en la rata adulta glia médula espinal en comparación con células gliales del cerebro neonatal 4. Además, los perfiles de producción de quimioquinas tras la estimulación por un neuropéptido, la calcitonina péptido relacionado con el gen (CGRP), son indiscutiblemente diferente entre glia cerebro de ratón neonatal (métodos descritos en la Ref. 5) y de ratón adulto médula espinal glia (Figura 1). líneas celulares establecidas son fáciles de usar y de mantener y pueden proporcionar un gran número de células en un período de tiempo corto. En general, las líneas celulares inmortalizadas son generados ya sea usando un sistema de inmortalización mediada por virus (tales como la línea celular microglial ampliamente utilizado BV2) 6, 7 o después de THe identificación de transformación espontánea (tal como la línea celular de astrocitos C8-D1A y la línea celular microglial C8-B4) 8, 9 líneas celulares son excelentes en el estudio de las características moleculares de los astrocitos y microglia individualmente.; sin embargo, los resultados obtenidos de líneas celulares siempre requieren una validación adicional en las células primarias o en condiciones in vivo. También hay que señalar que no ha habido un informe de una línea celular glial que se deriva de un glia de la médula espinal de roedores. Para ayudar a la investigación de la función de las células gliales de la médula espinal en el desarrollo del dolor neuropático, un sistema de cultivo que se deriva de la médula espinal de ratón adulto se ha desarrollado mediante la adaptación de un método reportado previamente utilizado para generar de rata adulta cultivos gliales mixtos 4, 5 . El cultivo glial médula espinal de ratón se refinó aún más recientemente 10 y se describe en más detalle en este artículo. Adultas de la médula espinal mezclado culturas gliales cSe establecerá una con un ratón a partir de cepas seleccionadas que se adapten a las necesidades del estudio en particular, y las células se pueden mantener en cultivo durante hasta 21 días después del inicio del cultivo. Este método se puede utilizar en estudios de dolor neuropático, así como en las investigaciones de diversas enfermedades neurológicas que implican cambios patológicos en la médula espinal, tales como la esclerosis amiotrófica lateral (ALS), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) -asociado neuropatía sensorial, y múltiple la esclerosis (MS).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2053">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#8217;s media (DMEM) with 4.5g/L glucose</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-709F</td>
			<td style="width:1168px;">The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">L-Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Corning-Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-004-CI</td>
			<td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 &#181;g/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2-mercaptoethanol (2-ME)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Papain dissociation system</td>
			<td style="width:277px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td>Individual components of this kit can be purchased separately.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Percoll</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lab-line incubator/shaker&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Barstead/Lab-line</td>
			<td style="width:119px;">MaxQ4000&#160;</td>
			<td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L-9764</td>
			<td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IL-6 DuoSet ELISA&#160;</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY406</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY410</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY466</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555260</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse chemokine Q-Plex</td>
			<td style="width:277px;">Quansys Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">120251MS</td>
			<td>This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">17-0451</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">11-0112</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Accuri C6 flow cytometer</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD Accuri C6&#160;</td>
			<td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:277px;">Tree Star, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo7.6.5</td>
			<td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

Ha sido bien aceptado que la médula espinal respuestas gliales contribuyen significativamente al desarrollo del dolor neuropático. Información relativa a las actividades tremenda gliales en los niveles celular y molecular ha sido obtenida a través de los sistemas de cultivo celular in vitro. Los sistemas in vitro utilizados, incluyen principalmente la glía primaria derivada de tejido cortical cerebral neonatal y líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, estos sistemas no siempre son representativas de las características de las células gliales de la médula espinal in vivo. Con el fin de investigar más a fondo el papel de las células gliales de la médula espinal en el desarrollo de los nervios periféricos del dolor neuropático inducido por lesión usando un sistema de cultivo que mejor refleja la condición in vivo, nuestro laboratorio ha desarrollado un método para establecer la médula espinal primaria cultivos gliales mixtos a partir de ratones adultos. Brevemente, las médulas espinales se recogen de los ratones adultos y procesados ​​a través de la digestión con papaína seguido de la eliminación de la mielina con un densdad-gradiente medio. Suspensiones de células individuales se cultivan en medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (cDMEM) suplementado con 2-mercaptoetanol (2-ME) en 35,9 o C. Estas condiciones de cultivo fueron optimizadas específicamente para el crecimiento de las células gliales mixtos. En estas condiciones, las células están listas para ser utilizado para la experimentación entre 12 - 14 d (células son por lo general en la fase de registro durante este tiempo) después del establecimiento del cultivo (D 0) y pueden ser mantenidos en condiciones de cultivo hasta D 21. Este sistema de cultivo se puede utilizar para investigar las respuestas de las células gliales de la médula espinal a la estimulación con diversas sustancias y agentes. Además del dolor neuropático, este sistema puede ser utilizado para estudiar las respuestas gliales en otras enfermedades que implican cambios patológicos de las células gliales de la médula espinal.

Este método se puede usar para preparar células gliales mixtos a partir de los dos ratones y ratas. El número total de células medio por pocillo en una placa de 12 pocillos en D-12 después del inicio del cultivo debe ser relativamente estable, con alrededor de 100.000 células por pocillo cuando las células se derivan de la médula espinal de ratón. Las células gliales obtenidas a partir de este método se pueden utilizar en experimentos diseñados para examinar las respuestas gl...

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Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

El desarrollo del dolor neuropático implica cambios patológicos de las células gliales de la médula espinal. Se carece de un sistema de cultivo glial fiable derivada de tejido de la médula espinal adulta y diseñado para el estudio de estas células in vitro. Por lo tanto, se muestra aquí cómo establecer cultivos mixtos gliales primarios a partir de tejido de médula espinal de ratón adulto.

Preparación de mezcla de culturas gliales primarios de ratón adulto espinal tejido del cordón

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

preparation-primary-mixed-glial-cultures-from-adult-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K vistas.  University of New England.  El desarrollo del dolor neuropático implica cambios patológicos de las células gliales de la médula espinal. Se carece de un sistema de cultivo glial fiable derivada de tejido de la médula espinal adulta y diseñado para el estudio de estas células in vitro. Por lo tanto, se muestra aquí cómo establecer cultivos mixtos gliales primarios a partir de tejido de médula espinal de ratón adulto. 

Video: Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

Modelo electromagnético controlado de cabeza cerrada de lesión cerebral traumática leve en ratones

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...