La financiación para el Dr. Thornton de Pfizer Limited se agradece.

1. Recolección, almacenamiento y preparación de los líquidos de lavado broncoalveolar y suero <ol><li> Recoger el suero de las muestras de sangre sin tratar al permitir que la sangre coagule a 4 ° C, y el suero como almacén de alícuotas a -20 ° C antes de su uso. Los líquidos de lavado broncoalveolar (LBA) también se debe almacenar en alícuotas a -20 ° C. Nota: El almacenamiento de suero y BAL como alícuotas limita el potencial de la degradación del antígeno diana por repetidos de congelación-descongelación de las muestras durante las pruebas de repetición. </li><li> Descongelar las muestras y se mezclan las muestras de suero y BAL bien y centrifugue durante 1 min a 14.000 rpm. </li><li> Para las pruebas de rutina de muestras de suero humano, diluir el suero 01:01 (v / v) con medio de cultivo tisular (MTC). MTC consta de medio RPMI-1640, 10% (v / v) de suero fetal de ternera, 1% (v / v) de 200 mM de L-glutamina solución, y azida de sodio (0,02% w / v) como conservante. El medio se prepara de antemano y se puede almacenar a 4 ° C durante varios meses. Echar 100 l de la diluted suero a la LFD. </li><li> Por BAL fluidos humanos, y para los fluidos de BAL de los modelos animales, se aplican 100 l de muestra pura a la LFD, sin pre-tratamiento. </li><li> Para el suero de los modelos animales, diluir suero 1:2 (v / v) con tampón fosfato salino que contiene 4% (w / v) de EDTA, el calor para 3min en un baño de agua hirviendo, de centrifugación durante 5 min a 14.000 rpm, y se aplican 100 l de sobrenadante ordenada al dispositivo LFD. </li></ol> 2. La aplicación de suero y BAL en el dispositivo de flujo lateral <ol><li> Almacenar los dispositivos de flujo lateral a temperatura ambiente (23 ° C). A esta temperatura, los dispositivos son estables durante 12 meses. Retire los dispositivos de las bolsas y colocar en una superficie plana. </li><li> Usando una punta de pipeta estéril, se aplican 100 l de pre-tratado muestra de suero o BAL ordenada al puerto de liberación del dispositivo. </li><li> Permitir el ensayo para ejecutar durante 15 minutos a temperatura ambiente, momento en el cual los resultados de las pruebas debe ser registrada. Nota: En cuestión de segundos el líquido se hace a traES a migrar por acción capilar a lo largo de la membrana de nitrocelulosa en la ventana de observación. </li></ol> 3. Registrar e interpretar los resultados LFD <ol><li> El LFD consta de una línea de control interno (indicado por la letra C en la carcasa de plástico) y una línea de prueba (indicado por la letra T). La línea de control siempre debe aparecer independientemente de antígeno de Aspergillus en la muestra de suero o BAL. Esto demuestra que el ensayo ha funcionar correctamente. </li><li> Si el antígeno de Aspergillus está presente en la muestra de suero o BAL, la línea de prueba aparecerá también dentro de 15 minutos de aplicación de la muestra. Debido a la intensidad de la línea de prueba es proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra de Aspergillus, la línea de prueba puede aparecer como un positivo débil (+), una moderada positivo (+ +) o como una fuerte positivo (+ + +) . Sin embargo, cualquier línea de prueba positiva, independientemente de la intensidad, que indicaría la presencia de antígeno de Aspergillus en la muestra. En ªla ausencia del antígeno e de Aspergillus, ninguna línea de prueba aparecerá, y el resultado se registrará como negativo (-). </li></ol> 4. Los resultados representativos Ejemplos representativos de negativos, positivo débil, positivo moderado, y fuertes resultados positivos LFD con muestras de BAL y el suero se muestra en la Figura 1. Los resultados de las pruebas de antígeno-positivas UDF (débil y fuerte) o negativas las pruebas de LFD con BAL fluidos de la leucemia mieloide aguda (LMA) de los pacientes diagnosticados de acuerdo a la EORTC / MSG criterios de diagnóstico se muestran en la Tabla 1. Se incluyen en esta tabla son los correspondientes clínica y micológica (galactomanano y la cultura) de datos, y los resultados de una prueba de Aspergillus PCR específica desarrollada en el St. Bartholomew Hospital de 8, para cada paciente. El diagnóstico de la enfermedad se basa en los factores del huésped (neutropenia, el uso prolongado de corticoides, el tratamiento con otros reconocidos de células T immunosuppressants), criterios clínicos y la positividad de GM para BAL (en este caso definida como un valor de índice de GM&gt; 0,8). En el 2002 EORTC / MSG directrices 10, 12 pacientes, 13 y 16 fueron diagnosticados con &quot;posible&quot; IA sobre la base de los factores del huésped y los criterios clínicos o de positividad de GM. De acuerdo con la versión revisada (2008) EORTC / MSG directrices 2, factores del huésped y la positividad de GM por sí solos o factores del huésped y los criterios clínicos por sí solos no indican &quot;posible&quot; infección micótica invasiva, a menos acompañada de la evidencia de los datos clínicos y micología, respectivamente. Paciente 6 fue diagnosticado con &quot;probable&quot; IA, con los dos años 2002 y 2008 debido a las directrices de los factores del huésped, las características clínicas mayores y menores y la positividad de GM. Tenga en cuenta que, si bien ni la LFD, ni los ensayos de PCR están actualmente incluidas en las directrices de EORTC / MSG, hay un fuerte acuerdo entre los dos ensayos y la prueba comercial de galactomanano que indican la presencia de antígeno de Aspergillus y el ácido nucleico en la muestra de BAL<html> s de los pacientes 6 y 12. Los resultados adicionales de los ensayos demuestran la eficacia de los ensayos LFD y PCR en el diagnóstico de IPA se pueden encontrar en Johnson et al 8. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3721/3721fig1.jpg" /> Figura 1. Negativo (línea de control) y positivo (el control y la línea de la prueba) los resultados de las pruebas de LFD con suero y BAL. Las intensidades de las reacciones de prueba de línea son proporcionales a las concentraciones del antígeno diana en las muestras de suero y BAL. Las reacciones suelen oscilar entre débil (+) a través de moderada (+ +) a fuerte (+ + +). Independientemente de la intensidad de prueba de línea, las tres reacciones positivas de suero que indicaría la enfermedad invasiva aspergilosis pulmonar debido a la presencia de antígeno de Aspergillus que circula en el torrente sanguíneo. Reacciones positivas BAL (débil, moderada o fuerte) podría indicar la germinación de las esporas y el desarrollo de las hifas potencialmente patógeno en los pulmones. pdflinebreak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Paciente no. </td><td> Patient información </td><td> Criterios clínicos 1 </td><td> BAL cultura 2 </td><td> GM EIA índice 3 </td><td> EORTC / MSG (2002) 4 </td><td> EORTC / MSG (2008) 5 </td><td> Aspergillus PCR resultado </td><td> Resultado LFD </td></tr><tr><td> 6 </td><td> - </td><td> Los principales signos de TC (nódulo y el halo) y un menor </td><td> Negativo </td><td> 0,9 (positivo) </td><td> Probable </td><td> Probable </td><td> Positiva </td><td> Débil positivo (+) </td></tr><tr><td> 12 </td><td> Presunto infección por hongos anterior </td><td> No mayor, menor un </td><td> Candida glabrata </td><td> 6,43 (muy positiva) </td><td> Posible </td><td> Ninguno </td><td> Positiva </td><td> Fuerte positivo (+ + +) </td></tr><tr><td> 13 </td><td> El estafilococo coagulasa-negativosylococcus y E. coli en sangre </td><td> N mayor, dos menores </td><td> Negativo </td><td> 0,25 (negativo) </td><td> Posible </td><td> Ninguno </td><td> Negativo </td><td> Negativo (-) </td></tr><tr><td> 16 </td><td> Infección del tórax; </td><td> 3 criterios menores incluyen nueva efusión plural infiltrarse en más </td><td> Negativo </td><td> 0,16 (negativo) </td><td> Posible </td><td> Ninguno </td><td> Negativo </td><td> Negativo (-) </td></tr></tbody></table> 1 Los nódulos o halos en una tomografía computarizada es sugestivo de infección por hongos 2 Candida glabrata en el líquido de BAL, se consideraría como un contaminante como lo es la levadura segundo más común aislado como parte de la flora normal humanos 9 3 Un índice de&gt; 0,8 en la prueba de evaluación del impacto ambiental de GM de BAL es un indicador de infección por Aspergillus 4 A partir de los 2002 EORTC / MSG criterios de diagnóstico para &#39;posible &quot;,&quot; probable &quot;o&quot; probado &quot;la enfermedad invasiva por hongos 10 5 Basado en la versión revisada (2008) EORTC / MSG criterios para el diagnóstico de &quot;posible&quot;, &quot;probable&quot; o &quot;probado&quot; la enfermedad invasiva por hongos 2 Tabla 1. Resultados de las pruebas LFD de muestras de BAL de pacientes con leucemia mieloide aguda con IPA probable y de control de los pacientes con LMA (sin evidencia de infección) y EORTC / MSG diagnóstico de la infección.

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No tenemos nada que revelar.

La identificación definitiva de la API sólo puede ser verdaderamente alcanzado por el aislamiento del agente etiológico a partir de muestras de biopsia, pero la recuperación de muestras adecuadas a menudo no es posible en pacientes muy enfermos y Aspergillus rara vez es objeto de reembolso a partir de sangre. Mientras los mayores avances se han hecho en el uso de tomografías axiales computarizadas del tórax en el diagnóstico de la API, características que son indicativos de la API pulmonar, tales como el &quot;halo&quot; o &quot;Media Luna&quot; signos de aire son o transitorio o se puede atribuir a los artefactos de respiración u otras infecciones por hongos 11,12. Estos datos son por lo tanto, complementado con técnicas serológicas que tienen como objetivo identificar las moléculas de la firma (GM y β-glucano) de hongos que están circulando en el suero del paciente o que están presentes en los fluidos del LBA, esputo o muestras de orina 13. Aunque estos ensayos muestran sensibilidad satisfactoria, carecen de suficiente especificidad o sufren de interferencia bajo ciertas condiciones 1,6 </sup&gt;. La prueba para la detección de LFD IPA que aquí se presenta permite el diagnóstico del &quot;punto de atención&quot; de la tecnología de la API y las hazañas que se ha utilizado hasta la fecha en las pruebas para la detección de virus, bacterias, parásitos y toxinas 14-19 y, lo más famoso, para la prueba de embarazo casera introdujo por primera vez Unipath en 1988. En la LFD Aspergillus se describe aquí, los géneros Aspergillus-MAb específico JF5 se inmoviliza a una zona de captura (la línea de prueba) en una membrana de nitrocelulosa poroso. Anti-inmunoglobulina de ratón inmovilizado en la membrana en una zona separada sirvió como un control interno (línea de control). En adición de suero o líquido BAL al puerto de liberación, el MAb JF5-coloidal conjugado de oro en la almohadilla de liberación se une al antígeno diana y el complejo a continuación, pasa a lo largo de la membrana porosa por acción capilar. MAb JF5 inmovilizado en la zona de captura se une a la JF5-oro coloidal-antígeno complejo resultante en una línea de prueba de color rojo. Cualquier JF5 sin consolidar-oro coloidalconjugado se une al control interno que indica que el ensayo ha funcionar correctamente. Esto da como resultado una línea de control rojo. La prueba es rápida, teniendo tan sólo 15 minutos para llevar a cabo, es barato en comparación con las pruebas de suero y BAL sobre la base de GM y la detección de β-glucano, y no requiere de equipos costosos o amplias instalaciones de laboratorio para correr. Por otra parte, el MAb JF5 no presenta reacción cruzada con los fármacos o contaminantes que se han demostrado para causar falsos positivos en la reacción de GM y β-glucano pruebas 1,4,6. Una ventaja adicional importante sobre las pruebas de diagnóstico actuales es la capacidad para detectar la actividad LFD que es indicativo del crecimiento invasivo de las especies de Aspergillus. Un paso crítico en el procedimiento LFD es la necesidad de leer los resultados 15 minutos después de la aplicación de la muestra de suero o BAL al dispositivo. La prueba no se debe dejar por más de 15 minutos antes de registrar los resultados, ya que este resultado puede sesgo interpretatisucesivamente. Una reacción débil no se verá reforzada por la ampliación del período de incubación. El tratamiento térmico de suero de modelos animales de la infección se ha encontrado para mejorar la sensibilidad del ensayo. Una limitación de la prueba es que es cualitativa, y se basa en el operador para hacer una evaluación subjetiva de la positividad. La intensidad de la línea de prueba varía de acuerdo con el contenido de antígeno de las muestras de suero y BAL (Figura 1). Sin embargo, cualquier reacción positiva (determinado por comparación con los negativos conocidos) indica la presencia de antígeno de Aspergillus y por lo tanto la infección. Para limitar la subjetividad de los ensayos de LFD, los dispositivos de mano disponibles que permiten la cuantificación de la LFD intensidades de prueba de línea y permitir el establecimiento de valores umbral para la detección de antígeno 20. La evolución futura de la LFD incluyen su comercialización y el desarrollo de un LFD múltiple que permite la detección simultánea de otros patógenos fúngicos invasivosutilizando anticuerpos monoclonales altamente específicos 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Aspergillus LFD </td><td> Universidad de Exeter </td><td></td><td> Disponible en el autor correspondiente solicitud de </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Sigma </td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de ternera fetal </td><td> Biosera </td><td> S9100 </td><td> Otras fuentes de suero fetal de ternera se puede utilizar en la preparación de TCM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BPE120-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of invasive pulmonary aspergillosis in haematological malignancy patients by using lateral-flow technology

Aspergilosis pulmonar invasiva (API) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los pacientes hematológicos y tumores malignos madre hematopoyéticas receptores de trasplante de células 1. Detección de la API representa un reto diagnóstico formidable y, en ausencia de un &quot;estándar de oro&quot;, se basa en una combinación de datos clínicos y de microbiología e histopatología cuando sea posible. El diagnóstico de la IPA debe ajustarse a la Organización Europea para la Investigación y Tratamiento del Cáncer y el Instituto Nacional de (EORTC / MSG) Alergias y Enfermedades Grupo de Infecciosas Micología estudio de consenso la definición de &quot;probada&quot;, &quot;probable&quot; y &quot;posible&quot; Las infecciones fúngicas invasivas 2 . En la actualidad, no a base de ácidos nucleicos, las pruebas han sido validados externamente para la detección de la API y por lo tanto la reacción en cadena de polimerasa (PCR) no está incluido en las actuales EORTC / MSG criterios diagnósticos. La identificación de Aspergillus en las secciones histológicas es problemático debido a Simiirregularidades en las morfologías de hifas con otros patógenos fúngicos invasivos 3, y la identificación comprobada requiere el aislamiento del agente etiológico en cultivo puro. Basada en el cultivo enfoques se basan en la disponibilidad de muestras de biopsia, pero éstos no siempre son accesibles en los pacientes enfermos, y no siempre producen propágulos viables para el cultivo cuando se obtienen. Una característica importante en la patogénesis de Aspergillus es la angio-invasión, un rasgo que ofrece oportunidades para realizar un seguimiento del hongo mediante pruebas inmunológicas que detectan las moléculas antigénicas características de las firmas en el suero y lavado broncoalveolar (LBA) líquidos. Esto ha conducido al desarrollo de la inmunoensayo enzimático Platelia (GM-EIA) que detecta Aspergillus galactomanano y una &quot;pan-hongos &#39;ensayo (ensayo Fungitell) que detecta la conservada componente fúngico pared celular (1 → 3)-β-D- glucano, pero no en los Mucorales que carecen de este componente en sus paredes celulares 1,4. Esdemanda que rodea a la exactitud de estas pruebas de 1,4-6 ha llevado a la reciente desarrollo de la próxima generación de anticuerpos monoclonales (Mab)-basados ​​en ensayos que detectan marcadores de infección 1,5. Thornton 5 describió recientemente la generación de un anticuerpo monoclonal específico de Aspergillus (JF5) utilizando tecnología de hibridoma y su uso para desarrollar un ensayo inmuno-cromatográfico de flujo lateral del dispositivo (LFD) para el punto de atención (PDA) el diagnóstico de la API. Una ventaja importante de la LFD es su capacidad para detectar la actividad desde el MAb JF5 se une a un antígeno glucoproteína extracelular que es secretada durante el crecimiento activo del hongo sólo 5. Esta es una consideración importante cuando se utilizan líquidos como BAL pulmonar para el diagnóstico de la API ya que las esporas de Aspergillus son un componente común de aire inhalado. La utilidad del dispositivo en el diagnóstico de IPA se ha demostrado utilizando un modelo animal de infección, donde la LFD muestra sensibilidad mejorada y especificacionesificity en comparación con el MM Platelia y Fungitell (1 → 3)-β-D-glucano ensayos 7. A continuación, presentamos un procedimiento sencillo LFD para detectar el antígeno de Aspergillus en el suero y fluidos humanos BAL. Su velocidad y precisión proporciona un complemento de la novela en el punto de atención de la prueba para el diagnóstico de la API en pacientes con neoplasias malignas hematológicas.

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Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Una rápida y precisa en el punto de atención de la prueba para la aspergilosis pulmonar invasiva se presenta. Se aprovecha de flujo lateral tecnología utilizando un anticuerpo monoclonal específico que se une a un<em&gt; Aspergillus</emAntígeno&gt; secretada durante las infecciones pulmonares. El ensayo es compatible con el lavado de suero y brochoalveolar y representa una prueba adyuvante novedoso para el diagnóstico de enfermedades.

La detección de la aspergilosis pulmonar invasiva en pacientes con neoplasia hematológica maligna, mediante el uso de la tecnología de flujo lateral

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

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Immunology and Infection

27.8K vistas.  University of Exeter. Una rápida y precisa en el punto de atención de la prueba para la aspergilosis pulmonar invasiva se presenta. Se aprovecha de flujo lateral tecnología utilizando un anticuerpo monoclonal específico que se une a un Aspergillus secretada durante las infecciones pulmonares. El ensayo es compatible con el lavado de suero y brochoalveolar y representa una prueba adyuvante novedoso para el diagnóstico de enfermedades.

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Investigación

Inmunología e Infección

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

Tecnología IgY: Extracción de anticuerpos de pollo de yema de huevo por el polietilenglicol (PEG) Precipitación

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

En Vivo Imaging Systems (IVIS) La detección de un virus invasor Neuro-encefálico

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

La detección del antígeno leucocitario humano biomarcadores en cáncer de mama Utilizando-Label gratuita tecnología de biosensores

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Generación de anticuerpos monoclonales murino por el hibridoma Tecnología

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse models of pulmonary fungal infection. Although multiple methods are used to assess fungal burden, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of fungal DNA has emerged as a technique with several advantages over previous culture-based methods. Currently, a comprehensive assessment of lung pathology, leukocyte recruitment, fungal burden, and gene expression in mice with invasive aspergillosis (IA) necessitates the use of a significant number of experimental and control animals. Here the quantification of lung histological staining to determine fungal burden using a reduced number of animals was examined in detail. Lung sections were stained to identify fungal structures with Gomori&#39;s modified methanamine silver (GMS) staining. Images were taken from the GMS-stained sections from 4 discrete fields of each formalin-fixed paraffin-embedded lung. The GMS stained areas within each image were quantified using an image analysis program, and from this quantification, the mean percentage of stained area was determined for each sample. Using this strategy, eosinophil-deficient mice exhibited decreased fungal burden and disease with caspofungin therapy, while wild-type mice with IA did not improve with caspofungin. Similarly, fungal burden in mice lacking &#947;&#948; T cells were also improved by caspofungin, as measured by qPCR and GMS quantification. GMS quantification is therefore introduced as a method for the determination of relative lung fungal burden that may ultimately reduce the quantity of experimental animals required for comprehensive studies of invasive aspergillosis.

Here we describe a protocol to determine pulmonary fungal burden in mice with invasive aspergillosis by quantification of Gomori&#39;s modified methanamine silver staining in histological sections. Use of this method resulted in comparable results with less animals compared to assessment of fungal burden by quantitative PCR of lung fungal DNA.

Cuantificación histológica para determinar la carga micótica pulmonar en aspergilosis Experimental

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Detección ultrasensible de biomarcadores utilizando una impresión Molecular basado Biosensor capacitiva

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...