Este protocolo es significativo porque mide cuantitativamente la fagocitosis de los fumigatedores de Aspergillus conidia etiquetados por leucocitos humanos, junto con la unión de Conidia a las células, y la falta de interacción por citometría de flujo. La principal ventaja de este método es que facilita el análisis rápido de un gran número de células. Además, el etiquetado de los marcadores celulares permite separar la evaluación de neutrófilos y monocitos dentro de la misma muestra.
En cualquier esta técnica se puede utilizar para analizar otros hongos clínicamente relevantes como Mucorales. En su lugar, los glóbulos rojos se pueden utilizar como fagocitos. Para comenzar este procedimiento, moje una toalla de papel con desinfectante y colóquela en un gabinete de seguridad biológica.
Coloque un plato de Aspergillus fumigatus cultivado encima de la toalla de papel para evitar la distribución excesiva de Conidia volátil. Añadir 10 mililitros de PBS que contengan 0.01% de detergente en la parte superior del hongo, y usar una espátula Drigalski para esparcir el líquido sobre la placa, y frotar el conidia de color oscuro. Transfiera la suspensión de Conidia a un 50 mililitros a través de un colador de 30 micrómetros, que eliminará cualquier micelio residual.
Añadir otros 10 mililitros de PBS con detergente a la placa, extenderlo con una espátula y transferirlo al mismo tubo a través del colador. A continuación, preparar una solución estéril de 0,1 molar de carbonato sódico, disuelto en PBS. Y preparar una solución de 0,1 milimolar de polvo FITC, en esta solución de carbonato de sodio.
Re-suspenda 100 millones o menos de Conidia, en cinco mililitros de esta solución FITC, en un tubo de 15 mililitros. Incubar en un rotador a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Para hincharse a Conidia, resuspendir el FITC etiquetado Conidia en cinco mililitros de medio RPMI, complementado con 10%FCS.
E incubar en un rotador a 37 grados centígrados durante el tiempo deseado. En un gabinete de seguridad biológica, coloque cinco mililitros de capa de buffy en un tubo de 50 mililitros. Llene el tubo con el buffer EL e invierta tres veces.
Incubar horizontalmente durante cinco a ocho minutos, hasta que la apariencia lechosa de la mezcla se vuelva clara. Luego, centrifugar a 300 veces G, y a temperatura ambiente durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en un mililitros de tamal EL por pipeteo.
Agregue otros 24 mililitros de tampón EL e invierta el tubo varias veces. Centrifugar a 300 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en un mililitros de medios RPMI, complementado con 10%FCS.
Para empezar, transfiera dos millones de leucocitos y cuatro millones de Conidia con etiqueta FITC en 1,5 mililitros de RPMI complementados con 10%FCS, a una placa de cultivo de 12 pozos. Incluya un control de celdas solo sin Conidia y un control de celdas con Conidia sin etiquetar. Incubar la placa en una incubadora de dióxido de carbono humidificada, a 37 grados centígrados durante el tiempo deseado.
Una vez completada la incubación, utilice un rascador celular para cosechar las células y transfieralas a un tubo de 15 mililitros. En primer lugar, coloque 100 microlitros de cada muestra y controles en un pozo de una placa inferior en V de 96 pozos. Añadir 150 microlitros de PBS que contengan dos mililitros de EDTA para el lavado.
Para la compensación de color, coloque un millón de celdas sin Conidia para cada color, en otros pozos de la placa. Incluya un pozo de celdas que quedarán sin restricciones. Añadir 150 microlitros de PBS que contengan dos mililitros de EDTA a cada pozo para el lavado.
A continuación, cubra la placa con una lámina adhesiva y centrifugar a 300 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, retire la lámina y deseche el sobrenadante invirtiendo rápida y contundentemente la placa una sola vez sobre el fregadero o una toalla de papel desechable. Resuspender las células en 100 microlitros de mezcla de anticuerpos, y mezclar bien por pipeteo.
Para las compensaciones de color, resuspender las células respectivas en 100 microlitros de PBS que contienen dos mililitros de EDTA, y añadir un solo tipo de anticuerpo a cada pozo, en la misma cantidad utilizada en la mezcla de anticuerpos. Cubrir con una lámina adhesiva e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 minutos. Después de esto, retire la lámina y agregue 150 microlitros de PBS que contengan dos mililitros de EDTA a cada pozo para el lavado.
Cubra la placa con papel de aluminio adhesiva de nuevo. Centrifugar a 300 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, retire la lámina y deseche el sobrenadante invirtiendo rápida y contundentemente la placa sobre un fregadero o una toalla de papel desechable.
Resuspender las células en 200 microlitros de PBS que contienen 2 EDTA milimétricas, y transferir la suspensión celular de cada pozo, en un tubo inferior redondo separado. Arranque el citómetro de flujo y déjelo calentar. En el software de adquisición, cree un nuevo experimento y configure y etiquete los nuevos ejemplos.
Configure los parámetros y los detectores para los fluoróforos apropiados, como se describe en el protocolo de texto. En este software, muestre las gráficas de puntos adecuadas como se describe en el protocolo de texto. Usando las células sólo muestran, adquirir algunas células y establecer la puerta alrededor de los leucocitos.
Basado en la puerta de leucocitos, puerta para células positivas CD45, para separar de Conidia en la gráfica SSC CD45. En una gráfica de puntos, CD14, CD66b, neutrófilos de puerta y monocitos por separado. Después de esto, cambie de la muestra de las celdas solamente, a Conidia sin etiquetar.
En una gráfica de puntos, anti-FITC, APC FITC, muestran neutrófilos en cuadrantes establecidos para señales anti-FITC y FITC. Abra la vista de estadísticas y ajuste los cuadrantes, permitiendo un máximo del 1% de las celdas en los cuadrantes Q1, Q2 y Q4. Repita este proceso para la puerta del monocitos. En la puerta del leucocitos, registre todas las muestras con al menos 20.000 eventos.
La fagocitosis de la conidia etiquetada por FITC por neutrófilos humanos se puede leer a partir de las opiniones de las estadísticas. En este estudio, se utiliza un método citométrico de flujo rápido para medir la interacción de Aspergillus fumigateurs Conidia con un gran número de leucocitos humanos primarios. Utilizando los anticuerpos apropiados y la estrategia de gating que se muestra aquí, un gating general de leucocitos humanos por características FSC y SSC, es seguido por una separación de leucocitos en conidia libre, por el marcador de leucocitos pan, CD45.
Conidia puede alcanzar casi el tamaño de la célula en el momento de la citometría de flujo, especialmente cuando se utiliza Conidia hinchada, y o largos tiempos de incubación, y por lo tanto puede comprarnos análisis. Dado que los monocitos primarios humanos y los neutrófilos toman Conidia de manera diferente, este protocolo permite el análisis separado de estas poblaciones celulares basado, en la tinción con los marcadores de linaje celular bien establecidos, CD14 para monocitos, y CD66b para neutrófilos. El porcentaje de fagocitos primarios humanos que internalizan Conidia puede ser muy variable entre los donantes de sangre, pero también depende de factores experimentales, como el tiempo de incubación y el estado de hinchazón de Conidia.
La internalización de la espora se puede detectar después de 0,5 horas de incubación conjunta y aumenta con el tiempo. La Conidia pre-hinchada se toma más fácil que las esporas en reposo, incluso en tiempos cortos de incubación. Si Conidia se fija con formaldehído, la fagocitosis disminuye en comparación con Conidia nativa.
Después de este procedimiento, el Cairo puede recolectar y analizar los sobrenadantes de células inmunitarias co-incubadas y Conidia para comprobar si la interacción provoca una liberación de citoquinas por las células inmunitarias. Recuerde que la sangre humana puede transmitir enfermedades infecciosas. Este trabajo requiere la vacunación a través de la Hepatitis B, el uso de un gabinete de seguridad biológica, así como el uso de guantes en una bata de laboratorio.
