Este trabajo fue financiado por la Asociación Americana de Diabetes (ADA), Grant JF1-10-14 (MDiF). Nos gustaría agradecer al personal del Laboratorio de Recursos Animales en WSU. Los autores agradecen la asistencia con el análisis estadístico de los datos de Neil Paton, Ph.D.

TNTS de ratones y ratas se determinan mediante el incremento de la placa caliente analgesia metros [iHPAM, CITI Inc. Ciencias de la Vida (Woodland Hills, CA)]. El equipo consta de varios componentes: una placa de aluminio (10 x 20 cm) con el sistema de calefacción por debajo y una cámara de observación por encima de plexiglás, una unidad de control de calor, el software de adquisición de datos (serie CITI Parte # Soft 8), una PC (personal ordenador) y un pedal de arranque a control remoto, detener o reiniciar el control de la unidad. El sistema de calefacción también permite el inicio / parada / reposición del proceso de calentamiento de forma manual a través de un teclado en frente del equipo. El iHPAM se puede configurar para diferentes velocidades de calentamiento, en espera / de corte de las temperaturas. 1. Instalación del equipo <ol><li> Antes de los animales de prueba, una inspección visual de la unidad para corroborar las tasas de calentamiento elegido (por ejemplo, 6 ° C / min), las temperaturas iniciales y finales en espera de corte (por ejemplo, 28 ° C y 55 ° C, respectivamente). </li><li> Verifique todas las conexiones. Para conservar una copia electrónica de los resultados, la unidad debe estar conectada a un ordenador con software de la serie 8. Por otra parte, las copias impresas de los resultados se pueden imprimir a través del puerto serie de la unidad. </li><li> Pruebe el equipo. Pulse el pedal una vez para asegurarse de que el Software Series 8 registros de datos: las temperaturas iniciales de reserva, de corte final y el tiempo en segundos requerido para alcanzar la temperatura de corte. </li><li> Como una prueba de control adicional, los investigadores que participan en los experimentos puede ser necesario experimentar el dispositivo en sí mismos. Retiro de la mano de la placa de metal en el momento de la percepción del dolor (46-48 ° C) no debe causar daño a la piel ni produce ninguna molestia posterior. </li><li> Una vez que la unidad se ha establecido y se registrarán los resultados de las medidas 1.3 y 1.4 se pueden comparar. Esto es útil para detectar problemas potenciales que podrían invalidar el uso de la unidad. Por ejemplo, las discrepancias entre la formación inicial de espera / final de corte Tempeperaturas y la lectura real de la unidad, y / o diferencias entre las temperaturas mostradas por la unidad y la temperatura de la placa real requerido para la retirada de la mano. </li></ol> 2. Prueba de los animales normales Ya sea joven o adulto ratas Wistar [post-parto (p) Edad 21-25 días], o los ratones (P21-25) de cualquier fondo genético o de género se puede utilizar. Los ratones usados ​​en nuestros experimentos son de la cepa C57BL/6J. <ol><li> La noche antes de los experimentos a realizar, aclimatar a los animales mediante la colocación de sus jaulas en el banco donde se encuentra el iHPAM. Dos horas antes de la realización de las pruebas, encienda el iHPAM para familiarizar a los animales con el ruido de fondo de la unidad. En este punto, el iHPAM se puede configurar y probados para verificar el correcto funcionamiento (consulte los pasos 1). Alimentos y el agua se proporcionaron ad libitum durante toda la prueba, excepto cuando el animal se encuentra en la cámara de observación (ver Paso 2.1). Nota: Es importante no asumir que las condiciones de laboratorio en experimentos de comportamiento son controlados de forma predeterminada. Se debe prestar especial atención a los factores genéticos y ambientales que pueden influir en los resultados de los estudios de comportamiento (revisado en 7). </li><li> Suavemente colocar un ratón normal / rata en la cámara de observación plexiglás en la parte superior de la placa de calentamiento de la unidad. Deje que el animal se adapte a la superficie caliente (fijado en 28 ° C) hasta que el animal muestra un comportamiento confortable. Nota: En estas condiciones las ratas normales adultas muestran un comportamiento exploratorio inicial, en ocasiones de pie hacia la tapa de la cámara de observación, mientras que oler. Después de unos minutos, las ratas pueden presentar episodios ocasionales de aseo personal y un comportamiento relajado. A veces, las ratas se acostó con una postura corporal relajada (extensión de decúbito prono), mientras que casualmente olfatear los alrededores. Los ratones normales son generalmente más activos que las ratas. Sin embargo, los ratones muestran un comportamiento exploratorio, relajado después de unos minutos in la cámara de observación. Es excepcionalmente raro observar tanto las conductas de escape (por ejemplo, saltar, tratando de escapar de la cámara de observación) o actitudes defensivas (por ejemplo, chillando). Es también importante observar que los ratones pueden comunicar el dolor de un ratón a otro 8. Por lo tanto, puede ser importante para los ratones de prueba colocados en jaulas separadas. </li><li> Colocar espejos en la parte posterior de la cámara de observación, para permitir observaciones en todos los ángulos. Un trípode que sostiene una cámara de vídeo digital puede ser de gran ayuda para determinar el momento exacto en el que nocifensive (evitar el dolor) la conducta que había ocurrido. </li><li> Una vez que el animal está cómodo en el calor de la cámara de observación de la placa presionando el pedal. Cuando la temperatura de la placa se calienta a una velocidad de 6 ° C / min, los animales normales presentan un comportamiento nocifensive estén implicados tanto la pata trasera-* Por lo general las temperaturas que rabian 46 a 48 ° C 3,5,9,10. Por lo tanto, el animal es la forma típica eliminado la observablesción cámara después de aproximadamente 3 minutos. Nota: Para la respuesta típica de un nocifensive es decir, la rata o el ratón, pata posterior paliza, mientras se agita y / o de elevación, es suficiente para terminar el estímulo térmico. Esto se consigue presionando el pedal. En este momento, el software registra la temperatura de la placa y la placa inmediatamente se enfría hasta la temperatura de espera (28 ° C) se alcanza (~ 0,5 min). Esto es decir, la temperatura, la que evoca cualquier reacción nocifensive es considerado como el umbral de calor nocivo (TNT) de la normal (control) de los animales. * A veces, particularmente en los ratones, el comportamiento a la temperatura nocifensive nocivo primero se puede observar en una o ambas patas delanteras (por ejemplo, lamiendo mientras está sentado), segundos antes traseras de las patas. Sin embargo, la pata delantera se lame es un componente normal de la conducta de aseo. Por lo tanto, sólo pata posterior se evalúan las reacciones. En ocasiones, los ratones pueden preparar a sus patas traseras también. Sin embargo, la preparación normal de hacer not duran más de unos pocos segundos, no implica intensiva lamer y por lo general termina después de la limpieza de sus garras. </li><li> Retire con cuidado el animal de la placa y colocarla en su jaula correspondiente. La medición del umbral de calor se repite entonces para el control de otras (normal) de los animales. Nota: TNTS se puede determinar en un solo animal a intervalos de 1-2 minutos sin retirar el animal de la cámara de observación. Determinaciones de TNT en ratas o ratones puede repetirse varias veces durante varios días. Esto es particularmente útil para determinar la media de TNT de un animal individual, así como su variación con la edad. </li><li> El TNT de los animales de control se expresa como la media de tres o más umbrales ± SEM. </li><li> El análisis estadístico de los datos obtenidos se realizó para comparar los diferentes grupos de tratamiento de los ratones o ratas. Procedimientos paramétricos, incluyendo análisis de la varianza puede ser utilizado apropiadamente en donde los datos se distribuyen normalmente y donde los grupos de tratamiento son homoskedastic, cuando estas condiciones se han cumplido los siguientes criterios pueden ser aplicados. Análisis de varianza seguido por la prueba de Newman-Keuls para detectar diferencias en las mediciones múltiples, es decir, que se repiten TNTS individuales con / sin tratamiento o en diferentes puntos de tiempo (por ejemplo, datos de la Figura 3). El Student para datos apareados t-test se puede utilizar para comparar dos grupos de datos es decir, antes de TNTS después del tratamiento contra las drogas, el unpaired t-test se puede utilizar para determinar las diferencias en los cambios de TNT en tratados con el fármaco frente a animales tratados con vehículo (por ejemplo, , datos de la Figura 4). </li></ol> 3. Prueba de los animales diabéticos La estreptozotocina (STZ) inducida rata diabética es el modelo animal más utilizado para estudiar los mecanismos de PDN y evaluar fármacos analgésicos y terapias 11,12. Las ratas hechas diabéticas por una sola dosis intraperitoneal de STZ (60 mg / kg) puede be la prueba de la hiperalgesia térmica durante la 3 ª semana después de la aparición de la diabetes 11. Es importante tener en cuenta que no todas las ratas diabéticas desarrollar PDN. Sin embargo, los animales que se desarrollan hiperalgesia (~ 50%) pueden ser fácilmente identificados. De hecho, sus TNTS son inferiores a lo normal *. * Para determinar TNTS de STZ ratas diabéticas, una temperatura de la placa de partida de 15 ° C en lugar de 28 ° C se utiliza. La razón de estos cambios es que los animales diabéticos con más PDN se espera que sean hiperalgésico 2,11. Por lo tanto, tendrán más bajos que los umbrales normales de calor nocivos (por ejemplo, &lt;45 ° C). <ol><li> Una rata diabética se coloca en la cámara de observación en la parte superior del aparato de ensayo. El animal se le permite aclimatarse a la superficie de la placa hasta que el animal muestra un comportamiento confortable. Nota: Por lo general, una rata diabética no muestra gran parte del comportamiento normal. Las ratas diabéticas suelen ser hipoactivo, letárgico, a menudo mostrandomovimientos restringidos y aseo lento. Es raro observar la clasificación hacia la tapa de la cámara de observación. Después de unos minutos, las ratas diabéticas con calma pueden permanecer en un rincón de la cámara con ocasional inhalación de los alrededores. </li><li> Una vez que el animal diabético es cómodo en la cámara de observación, la placa se calienta hasta que en la Etapa 2,3 la rata diabética pueden mostrar un comportamiento nocifensive implica ya sea trasera / delantera de la pata. Esto suele ocurrir a temperaturas de la placa no nocivos (por ejemplo, &lt;45 ° C), o después de no más de 5 minutos en la cámara con el aumento de la temperatura de 6 ° C / min. Nota: La respuesta nocifensive de una rata adulta joven diabético no difiere de la de una rata normal. Sin embargo, la temperatura más baja que evoca tal comportamiento se redujo significativamente. </li><li> Vea el Paso 2.4 </li><li> La media de más de tres umbrales en el día del experimento expresado como ° C ± SEM se considera el umbral de calor nocivo de la diabetic animal. Nota: Un paradigma similar a la explicada para las ratas normales o diabéticas se pueden seguir para determinar la eficiencia térmica de lucha contra la nocifensive efecto de los analgésicos en los umbrales de calor. </li></ol> 4. Las pruebas de analgesia Las propiedades anti-nociceptivos de fármacos (por ejemplo, analgésicos), así como la determinación de los parámetros farmacológicos tales como la dosis mínima efectiva puede ser fácilmente obtenido mediante los pasos explicados anteriormente. Se prevé que las dosis apropiadas de un analgésico administrado a ratas o ratones incrementaría significativamente sus TNTS. Esto es particularmente sensible en los animales con hiperalgesia térmica 3. Sin embargo, para evitar el sesgo en la interpretación de los resultados, los investigadores involucrados en la observación del comportamiento de un grupo de animales que no debe saber o conocer si los animales habían sido tratados o no. Además, los medicamentos a ser inyectados por el observador se pueden preparar por otro investigador y etiquetadosA, B, C, etc dosificación se proporciona en una copia impresa, listando dosis individuales por animal identificado. Dependiendo del fármaco sometido a ensayo, diferentes dosis de un analgésico potencial puede ser administrado a los animales normales o diabéticos 5-15 min comportamiento pruebas anteriores. Los controles apropiados deben ser incluidos (es decir, solo emparejados por edad los animales inyectados con vehículo y / o ratas diabéticas sin PDN) y probada usando condiciones idénticas (por ejemplo, misma temperatura de partida de la placa). Los efectos crónicos de drogas se puede probar también. 5. Los resultados representativos La temperatura más baja de la placa que evoca reacciones nocifensive, ya sea en la pata trasera de jóvenes adultos normales no tratados ratas o ratones se determinaron los pasos siguientes 2-1 a 2-6. Como se muestra en la Figura 1, TNT de ratas normales y ratones adultos jóvenes fueron 47,2 ± 0,2 ° C y 47,5 ± 0,5 ° C, respectivamente. Tenemos OBSErved ni variación significativa diaria de TNTS individuo (Figura 2A), ni cambios significativos de TNTS entre los individuos de la misma edad (Figura 2B). Diferencias TNT, debido a los géneros no se observaron (no mostrado). TNTS de jóvenes adultos STZ-ratas diabéticas se determinaron de manera similar a la de las ratas normales (Pasos 3.1 a 3.3). Sin embargo, la temperatura de la placa de partida se fijó a 15 ° C en lugar de 28 ° C. El comportamiento nocifensive de STZ-ratas diabéticas se evaluó al menos tres veces en un individuo y de manera diaria a partir once días después de la inyección de STZ. Como se muestra en la Figura 3, una disminución significativa (p &lt;0,01) en el TNT de STZ-ratas diabéticas se hace evidente dos semanas después de la inyección de STZ. La media de TNT de STZ-ratas diabéticas fue de 45,6 ± 0,1 ° C (n = 16, los valores combinados de 14-23 días). Las ratas diabéticas que presentan significativamente más baja que la norma TNTl se considera que tienen PDN. Estas ratas se utilizaron para probar las agudas antinociceptivos propiedades de un analgésico (compuesto A). TNTS se determinaron en ratas normales y diabéticas inyectados con una dosis única del compuesto o vehículo solo cinco minutos antes de la prueba. Como se muestra en la Figura 4, una sola dosis intraperitoneal del compuesto aumentó significativamente TNTS de ratas diabéticas, en comparación con ratas tratadas con el vehículo solo (45,6 ° C frente a 47,6 ° C, respectivamente). El efecto anti-nocifensive del compuesto A también se observó en las ratas normales, aunque significativa (p &lt;0,01), fue menos pronunciada (47,4 ° C frente a 48,0 ° C, respectivamente). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3785/3785fig1.jpg" /> Figura 1. Determinación de TNTS de ratas adultas jóvenes normales y ratones: Los TNTS de ratas adultas jóvenes (p21-24) o ratones (P20-21) fueron probados en el iHPAM siguiendo los pasos descritos ABOve. Un total de 12 ratas y ratones fueron probados 25. Las mediciones se realizaron durante varios días y los resultados se agruparon. Los resultados se expresan como media ± SEM. El mínimo y el máximo de los valores registrados en TNT estas ratas fue de 46,2 ° C y 48,6 ° C respectivamente. En el caso de los ratones, los valores máximo y mínimo de TNT registrados fueron 48,8 ° C y 44,9 ° C, respectivamente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3785/3785fig2.jpg" /> Figura 2. Edad-dependencia de TNTS en ratas y ratones: Un Plotted) son los TNTS de cuatro ratas normales (n = 4) de 21 días de edad determinados por lo menos tres veces al día durante 5 días B) TNTS de ratones littermates determinarse una vez al indicado. las edades. Los números en la parte superior de cada determinación del punto representa el número de camada utilizados. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3785/3785fig3.jpg" /> Figura 3. Las ratas diabéticas se hiperalgésico 3 noseks después de la aparición de la diabetes: TNTS de seis (n = 6) años de edad encontrados adultos jóvenes STZ-ratas diabéticas se determinaron todos los días desde 11 días después de la inducción de la diabetes. Se muestran los promedios diarios de TNT (media ± SEM). TNTS diabéticos determinadas entre 11-13 días después de la inyección de STZ se encontraban dentro del rango normal (línea roja). Dos semanas después de la inyección de STZ TNTS disminuyó significativamente a 45,1 ± 0,4 ° C, (p &lt;0,05). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3785/3785fig4.jpg" /> Figura 4. Agudas contra nocifensive efectos del compuesto B en ratas diabéticas STZ. Ratas jóvenes adultos normales (azul grupo de n = 12) y la edad coincide con STZ-ratas diabéticas (verde hiperalgésicas grupo n = 6) fueron probados en el iHPAM después de la inyección intraperitoneal de vehículo (barras oscuras) o un compuesto. (barras claras) La media de TNT ± SEM para cada tratamiento (control del vehículo o el compuesto A-tratada) se muestran. Los asteriscos indican diferencias estadísticas(P &lt;0,05).

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	<li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+neuropathic+pain:+From+mechanisms+to+symptoms.">Peripheral neuropathic pain: From mechanisms to symptoms.</a> Clin. J. Pain. 16, S12-S20 (2000).</li><li>Calcutt, N. A., Jorge, M. C., Yaksh, T. L., Chaplan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+allodynia+and+formalin+hyperalgesia+in+streptozotocin-diabetic+rats:+Effects+of+insulin,+aldose+reductase+inhibition+and+lidocaine.">Tactile allodynia and formalin hyperalgesia in streptozotocin-diabetic rats: Effects of insulin, aldose reductase inhibition and lidocaine.</a> Pain. 68, 293-299 (1996).</li><li>Bolcskei, K., Petho, G., Szolcsanyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noxious+heat+threshold+measured+with+slowly+increasing+temperatures:+Novel+rat+thermal+hyperalgesia+models.">Noxious heat threshold measured with slowly increasing temperatures: Novel rat thermal hyperalgesia models.</a> Methods Mol. Biol. 617, 57-66 (2010).</li><li>Ankier, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+hot+plate+tests+to+quantify+antinociceptive+and+narcotic+antagonist+activities.">New hot plate tests to quantify antinociceptive and narcotic antagonist activities.</a> Eur. J. Pharmacol. 27, 1-4 (1974).</li><li>Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+resiniferatoxin+on+the+noxious+heat+threshold+temperature+in+the+rat:+A+novel+heat+allodynia+model+sensitive+to+analgesics.">Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: A novel heat allodynia model sensitive to analgesics.</a> Br. J. Pharmacol. 139, 49-58 (2003).</li><li>Bolcskei, K., Horvath, D., Szolcsanyi, J., Petho, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+injury-induced+drop+of+the+noxious+heat+threshold+measured+with+an+increasing-temperature+water+bath:+A+novel+rat+thermal+hyperalgesia+model.">Heat injury-induced drop of the noxious heat threshold measured with an increasing-temperature water bath: A novel rat thermal hyperalgesia model.</a> Eur. J. Pharmacol. 564, 80-87 (2007).</li><li>Chesler, E. J., Wilson, S. G., Lariviere, W. R., Rodriguez-Zas, S. L., Mogil, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+ranking+of+genetic+and+laboratory+environment+factors+influencing+a+behavioral+trait,+thermal+nociception,+via+computational+analysis+of+a+large+data+archive.">Identification and ranking of genetic and laboratory environment factors influencing a behavioral trait, thermal nociception, via computational analysis of a large data archive.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 907-923 (2002).</li><li>Langford, D. J., Crager, S. E., Shehzad, Z., Smith, S. B., Sotocinal, S. G., Levenstadt, J. S., Chanda, M. L., Levitin, D. J., Mogil, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+modulation+of+pain+as+evidence+for+empathy+in+mice.">Social modulation of pain as evidence for empathy in mice.</a> Science. 312, 1967-1970 (2006).</li><li>Hunt, S. P., Koltzenburg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The neurobiology of pain. , (2005).</li><li>Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The pain system : The neural basis of nociceptive transmission in the mammalian nervous system. , (1985).</li><li>Calcutt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling diabetic sensory neuropathy in rats. In: Methods in molecular medicine. Pain research: Methods and protocols. , (2004).</li><li>Bars, D. L. e., Gozariu, M., Cadden, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+nociception.">Animal models of nociception.</a> Pharmacol. Rev. 53, 597-652 (2001).</li><li>Shaikh, A. S., Somani, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+and+biomarkers+of+neuropathy+in+diabetic+rodents.">Animal models and biomarkers of neuropathy in diabetic rodents.</a> Indian J. Pharmacol. 42, 129-134 (2010).</li><li>Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+and+sensitive+method+for+measuring+thermal+nociception+in+cutaneous+hyperalgesia.">A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia.</a> Pain. 32, 77-88 (1988).</li><li>Hardy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+rapid+measurement+of+skin+temperature+during+exposure+to+intense+thermal+radiation.">Method for the rapid measurement of skin temperature during exposure to intense thermal radiation.</a> J. Appl. Physiol. 5, 559-566 (1953).</li><li>Sumino, R., Dubner, R., Starkman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+small+myelinated+&amp;quot;warm&amp;quot;+fibers+to+noxious+heat+stimuli+applied+to+the+monkey's+face.">Responses of small myelinated &amp;quot;warm&amp;quot; fibers to noxious heat stimuli applied to the monkey's face.</a> Brain Res. 62, 260-263 (1973).</li><li>Hammond, D. L., Ruda, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+alterations+in+thermal+nociceptive+threshold+and+the+distribution+of+immunoreactive+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+p+after+neonatal+administration+of+capsaicin+in+the+rat.">Developmental alterations in thermal nociceptive threshold and the distribution of immunoreactive calcitonin gene-related peptide and substance p after neonatal administration of capsaicin in the rat.</a> Neurosci. Lett. 97, 57-62 (1989).</li></ol>

Hemos decidido no revelar la identidad del analgésico utilizado en estos experimentos. Parte de los resultados que se muestran aquí se ha presentado en las Sesiones 71 ª Científica de la Asociación Americana de Diabetes (San Diego, CA) y la 47 Reunión Anual de la Asociación Europea para el Estudio de la Diabetes (Lisboa, Portugal).

Al igual que en la prueba de la placa clásico caliente para cuantificar la hiperalgesia térmica 4,13, el ensayo de la nocicepción aquí descrito permite una manera rápida y fiable para cuantificar el comportamiento nocifensive en ratas y ratones. Sin embargo, contrariamente a prueba clásica, el incremento de la placa caliente método es no invasivo y prácticamente libre de estrés. Aunque algunos frenar es necesario realizar la prueba (es decir, el animal debe estar en la cámara de observació...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Incremento de la placa caliente Analgesia Meter </td><td> CITI Inc. Ciencias de la Vida </td><td> Parte # PE34 </td></tr><tr><td> Serie suave 8 </td><td> CITI Inc. Ciencias de la Vida </td><td> Parte # Series8 </td></tr><tr><td> Estreptozotocina </td><td> Calbiochem </td><td> 572201 </td></tr></tbody></table>

rapid determination of the thermal nociceptive threshold in diabetic rats

La neuropatía diabética dolorosa (PDN) se caracteriza por la hiperalgesia, es decir, mayor sensibilidad a los estímulos nocivos, y la alodinia, es decir, hipersensibilidad a estímulos inocuos normalmente 1. Hiperalgesia y alodinia se han estudiado en muchos diferentes modelos de roedores de la diabetes mellitus tipo 2. Sin embargo, según lo declarado por Bölcskei et al, la determinación de &quot;dolor&quot; en modelos animales es un reto debido a su naturaleza subjetiva 3. Por otra parte, los métodos tradicionales utilizados para determinar las respuestas de comportamiento a los estímulos térmicos nocivos por lo general carecen de reproducibilidad y la sensibilidad farmacológica 3. Por ejemplo, utilizando el método de la placa caliente de Ankier 4, estremecerse, la retirada y / o de cualquiera de lamer traseros y / o patas delanteras se cuantifica como los reflejos en las latencias de constantes estímulos térmicos de alta (52-55 ° C). Sin embargo, los animales que son hiperalgésico al estímulo térmico no reproducible muestran diferencias en la reflex latencias que se utilicen los umbrales de temperaturas supra-3,5. Como el método descrito recientemente de Bölcskei et al. 6, los procedimientos descritos aquí permite la determinación rápida, sensible y reproducible de los umbrales térmicos nociceptivos (TNTS) en ratones y ratas. El método utiliza estímulo aumentando lentamente térmico aplicado principalmente a la piel de la superficie de ratón / rata plantar. El método es especialmente sensible para estudiar la lucha contra la nocicepción durante los estados hiperalgésicas como PDN. Los procedimientos descritos abajo se basan en los publicados en detalle por Almási et al 5 y Bölcskei et al 3. Los procedimientos aquí descritos han sido aprobados el Cuidado de Animales de Laboratorio y el empleo (LACUC), Wright State University.

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Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

A continuación, describimos un procedimiento rápido fiable y sencillo para determinar la temperatura más baja en la que las ratas o ratones muestran un comportamiento nocifensive,<em&gt; Es decir,</em&gt; El<em&gt; Umbral nociceptivo térmica</em&gt; (TNT). Este método se aplica un estímulo térmico aumentando lentamente permitiendo una estimación precisa y reproducible de TNTS con un mínimo, en su caso, la tensión a los animales.

Determinación rápida del umbral nociceptivo térmico en ratas diabéticas

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

rapid-determination-thermal-nociceptive-threshold-diabetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.4K vistas.  Wright State University. A continuación, describimos un procedimiento rápido fiable y sencillo para determinar la temperatura más baja en la que las ratas o ratones muestran un comportamiento nocifensive, Es decir, El Umbral nociceptivo térmica (TNT). Este método se aplica un estímulo térmico aumentando lentamente permitiendo una estimación precisa y reproducible de TNTS con un mínimo, en su caso, la tensión a los animales.

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A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

Un método general para la evaluación de incubación de sacarosa en ratas Deseo

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

Investigación

Neurociencias

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Métodos locales y globales de evaluación de nocicepción térmica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities

Opioid-induced hyperalgesia and tolerance severely impact the clinical efficacy of opiates as pain relievers in animals and humans. The molecular mechanisms underlying both phenomena are not well understood and their elucidation should benefit from the study of animal models and from the design of appropriate experimental protocols. 
We describe here a methodological approach for inducing, recording and quantifying morphine-induced hyperalgesia as well as for evidencing analgesic tolerance, using the tail-immersion and tail pressure tests in wild-type mice. As shown in the video, the protocol is divided into five sequential steps. Handling and habituation phases allow a safe determination of the basal nociceptive response of the animals. Chronic morphine administration induces significant hyperalgesia as shown by an increase in both thermal and mechanical sensitivity, whereas the comparison of analgesia time-courses after acute or repeated morphine treatment clearly indicates the development of tolerance manifested by a decline in analgesic response amplitude. This protocol may be similarly adapted to genetically modified mice in order to evaluate the role of individual genes in the modulation of nociception and morphine analgesia. It also provides a model system to investigate the effectiveness of potential therapeutic agents to improve opiate analgesic efficacy.

We describe a protocol to examine the development of opioid-induced hyperalgesia and tolerance in mice. Based on the measurement of thermal and mechanical nociceptive responses of na&#239;ve and morphine-treated animals, it allows to quantify the increase in pain sensitivity (hyperalgesia) and decrease in analgesia (tolerance) associated with chronic opiate administration.

Evaluación de la hiperalgesia inducida por la morfina y analgésicos Tolerancia en ratones utilizando térmicas y mecánicas Modalidades nociceptivos

Opioid-induced hyperalgesia and tolerance severely impact the clinical efficacy of opiates as pain relievers in animals and humans. The molecular ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinación de la actividad locomotora espontánea en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación usando sondas de oligonucleótidos en Cerebro paraformaldehído-prefijo de ratas con síndrome de serotonina

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Measurement &amp; Analysis of the Temporal Discrimination Threshold Applied to Cervical Dystonia

The temporal discrimination threshold (TDT) is the shortest time interval at which an observer can discriminate two sequential stimuli as being asynchronous (typically 30-50 ms). It has been shown to be abnormal (prolonged) in neurological disorders, including cervical dystonia, a phenotype of adult onset idiopathic isolated focal dystonia. The TDT is a quantitative measure of the ability to perceive rapid changes in the environment and is considered indicative of the behavior of the visual neurons in the superior colliculus, a key node in covert attentional orienting. This article sets out methods for measuring the TDT (including two hardware options and two modes of stimuli presentation). We also explore two approaches of data analysis and TDT calculation. The application of the assessment of temporal discrimination to the understanding of the pathogenesis of cervical dystonia and adult onset idiopathic isolated focal dystonia is also discussed.

Methods for the measurement and analysis of the temporal discrimination threshold are presented, and its application to the study of the pathogenesis of cervical dystonia are discussed.

Medición y análisis del umbral de discriminación Temporal aplicado a Distonía Cervical

The temporal discrimination threshold (TDT) is the shortest time interval at which an observer can discriminate two sequential stimuli as being ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Establishment of Acute Pontine Infarction in Rats by Electrical Stimulation

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided here is a protocol for successfully establishing a rat model of acute pontine infarction. Rats weighing about 250 g are used, and a probe with an insulated sheath is injected into the pons using a stereotaxic apparatus. A lesion is produced by the electrical stimulation with a single pulse. The Longa score, Berderson score, and beam balance test are used to assess neurological deficits. Additionally, the adhesive-removal somatosensory test is used to determine sensorimotor function, and the limb placement test is used to evaluate proprioception. MRI scans are then used to assess the infarction in vivo, and TTC staining is used to confirm the infarction in vitro. Here, a successful infarction is identified that is located in the anterolateral basis of the rostral pons. In conclusion, a new method is described to establish an acute pontine infarction rat model.

Presented here is a protocol for establishing acute pontine infarction in a rat model via electrical stimulation with a single pulse.

Establecimiento del Infarto Pontino Agudo en Ratas por Estimulación Eléctrica

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) occlusion of the middle cerebral artery (MCA) using a catheter. This generally accepted technique, however, has some limitations, thereby limiting its extensive use. Stroke induction by this method is often characterized by high variability in the localization and size of the ischemic area, periodical occurrences of hemorrhage, and high death rates. Also, the successful completion of any of the transient or permanent procedures requires expertise and often lasts for about 30 minutes. In this protocol, a laser irradiation technique is presented that can serve as an alternative method for inducing and studying brain injury in rodent models.
When compared to rats in the control and MCAO groups, the brain injury by laser induction showed reduced variability in body temperature, infarct volume, brain edema, intracranial hemorrhage, and mortality. Furthermore, the use of a laser-induced injury caused damage to the brain tissues only in the motor cortex unlike in the MCAO experiments where destruction of both the motor cortex and striatal tissues is observed.
Findings from this investigation suggest that laser irradiation could serve as an alternative and effective technique for inducing brain injury in the motor cortex. The method also shortens the time for completing the procedure and does not require expert handlers.

The protocol presented here shows a technique to create a rodent model of brain injury. The method described here uses laser irradiation and targets motor cortex.

Lesión cerebral inducida por láser en la corteza motora de ratas

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

Inducción de lesión cerebral axonal difusa en ratas basada en aceleración rotacional

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...