Estos estudios fueron financiados, en parte, por el Fondo del Hospital Infantil de Boston, los ingresos de Urología Fundación y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones NIBIB P41-EB002520 (Kaplan); NIDDK T32-DK60442 (Freeman); NIDDK 1K99-DK083616 (Mauney). Reconocemos el Dr. Peter Zvara de la Universidad de Vermont para la asistencia en el establecimiento de la técnica de colocación de la sonda de cistostomía y cistometría.

Métodos quirúrgicos 1. Preparación quirúrgica y anestesia <ol><li> Configure el campo quirúrgico estéril con los instrumentos necesarios: tijeras quirúrgicas de afeitar, pinzas con dientes, finas pinzas atraumáticas, conductor con aguja fina, tijeras, gasas, tijeras Metzenbaum tenotomía, hoja de bisturí, la aguja hipodérmica 30, lleno de solución salina jeringa de 1 ml, cuatro 6-0, 7-0 suturas de polipropileno de sutura poliglactina, suturas poliglactina 4-0. </li><li> Se anestesia el animal con la inhalación de isoflurano en la cámara de inducción. Confirmar inducción completa del animal antes de transferir al campo quirúrgico. Asegúrese de que el tubo de anestesia inhalatoria está en la posición adecuada para recibir anestesia continua. </li><li> Coloque el animal en decúbito supino del campo estéril. [Para el análisis de cistométrica, consulte la sección de abajo en un túnel del catéter de cistostomía.] </li><li> Utilice las tijeras de afeitar para eliminar la piel de la parte inferior del abdomen. </li><li> Preparación del abdomen con serTadine y 70% de etanol. </li><li> Antes de la incisión, un analgésico como buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) puede ser inyectado por vía subcutánea durante el control del dolor perioperatorio. </li></ol> 2. La incisión y la exposición de la vejiga <ol><li> Haga un 1-2 cm (dependiendo del tamaño del animal y si la rata o el ratón) menor incisión de línea media con el bisturí a través de la piel. Profundizar la incisión en la parte inferior de la incisión a través del músculo recto teniendo cuidado de no lesionar el intestino o vejiga subyacente. </li><li> Con unas pinzas dentadas, elevar el músculo recto y libre de diseccionar la superficie posterior del músculo con finas tijeras de Metzenbaum. </li><li> Incida el resto del músculo en la línea media para toda la longitud de su incisión en la piel. </li><li> Entregar la vejiga a través de la incisión de la herida (Figura 1). La vejiga es el órgano más por lo general depende de la pelvis. (En el hombre, la próstata es en realidad más dependiente y es mayor que ella vejiga se descomprime.) </li><li> Coloque una estancia de sutura a través de la pared posterior de la vejiga, y luego otro a través de la pared anterior de la vejiga con sutura de polipropileno 6-0. Coloque suturas adicionales lateralmente. No haga estos puntos de sutura. Cuando las suturas se mantiene tensa, la vejiga tendrá una configuración cuadrada de aproximadamente 1 cm 2 (Figura 2). Tenga cuidado de no tener demasiada tensión en estos puntos de sutura, ya que fácilmente se puede extraer a través del tejido de la vejiga. </li><li> Incisión en la vejiga longitudinalmente a través de la pared anterior de la vejiga (justo por debajo de la cúpula de la vejiga) en la línea media de aproximadamente 1 cm (1,5-2 cm de la vejiga de rata). </li></ol> 3. La anastomosis de la andamio <ol><li> Con unas tijeras finas, cortar el andamiaje de seda para el área aproximada del defecto de la vejiga. </li><li> Uso de la sutura de poliglactina 7-0, comience en una esquina del andamio y se sutura a la vejiga de forma continua, corriendomoda para crear un sello hermético todo el camino alrededor del defecto (Figura 3). </li><li> Probar la integridad de la anastomosis llenando la vejiga con solución salina estéril al infundir a través de la pared de la vejiga con una aguja hipodérmica de calibre 30. Si se detecta una fuga, esto se puede cerrar con un adicional de sutura interrumpida poliglactina 7-0 para cerrar la brecha. </li><li> Reducir la parte posterior de vejiga reconstruida en el abdomen. </li></ol> 4. Cierre de la incisión <ol><li> Antes de cierre de la pared abdominal, inyectar el músculo recto y el tejido subcutáneo con bupivicaína para anestesia local (&lt;3 mg / kg de 0,25%). </li><li> Reaproximar el músculo recto con una sutura continua, corriendo poliglactina 4-0. </li><li> Cerca de la piel con una sutura continua, corriendo poliglactina 4-0. </li><li> Limpie y seque la incisión (Figura 4). </li><li> Traslado del animal en una jaula caliente, limpia para el despertar de la anestesia. </li></ol&gt; Los pasos para la colocación del catéter cistostomía para el análisis cistométrica son como sigue: 5. Túnel del catéter cistostomía <ol><li> Configure el campo quirúrgico estéril con los instrumentos quirúrgicos necesarios: tijeras de afeitar, pinzas con dientes, finos pinza atraumática, el conductor con aguja fina, gasas, tijeras de Metzenbaum, tijeras de tenotomía, pinza curva pequeña, hoja de bisturí, polipropileno 6-0, 4-0 poliglactina sutura, sutura de seda 3-0 (sutura de seda 4-0 para los ratones), aguja 18G, 22G aguja de punta roma, aguja 25G, 1 ml de solución salina jeringa llena, la tubería de polietileno de 50 (PE-50) para cortar una longitud de ~ 10 cm. </li><li> Bengala al final de la PE-50 tubos por suavemente exponiendo a una llama. Tenga cuidado de no fundir el extremo de u ocluir la luz (esto puede ser verificado mediante la inyección de solución salina a través de una aguja de 25 G conectada a la &quot;no quemado&quot; final y asegurar el flujo). Esto sirve como un ancla para mantener el tubo dentro de la vejiga (Figura 5). </li><li&gt; Anestesie el animal como en el paso por encima de 1,2. </li><li> Utilice las tijeras de afeitar para eliminar la piel tanto del dorso del animal entre la escápula y la parte inferior del abdomen en la ventral. </li><li> Preparación de las zonas con betadine y el 70% de etanol. Colocar el animal en decúbito prono sobre la sábana. </li><li> Haga una incisión de 1 cm en el dorso entre la escápula. Uso de la tijera Metzenbaum, desarrollar un plano entre la piel y el músculo subyacente mediante la colocación de las puntas de las tijeras en el plano y la difusión de ellos para crear un túnel en torno al abdomen ventral. </li><li> Vuelva a la posición supina de los animales. Haga que su incisión abdominal y exponer la vejiga que el anterior en los pasos 2.1-2.4. Reducir la vejiga en el abdomen. </li><li> Coloque una pequeña pinza en su túnel subcutáneo creado en el paso de 5,6 a partir de la incisión en la piel dorsal. Con los dedos para proteger el contenido intra-abdominales, perforar a través de la pared abdominal con las puntas de la pinza en el abdomen. </li><li> Sujete la smooth final de la PE-50 tubo con la abrazadera y tire de él a través de la incisión dorsal. Asegurarse de que el extremo bulbed no se tira más allá de la pared abdominal (Figura 6). </li></ol> 6. La colocación del tubo de cistostomía <ol><li> Entregar la vejiga a través de la incisión. A partir de ahora, la vejiga debe ser manejado con pinzas finas para evitar un traumatismo en la vejiga que puede causar daños o inflamación que puede sesgar los resultados cistométricos o resultar en molestias adicionales para el animal después de la operación. </li><li> Tome nota del sitio propuesto para el tubo de cistostomía. Debe ser colocado en la cúpula de la vejiga (superior a la del segmento de aumentar). Esto evitará que enroscar o la oclusión del tubo. </li><li> Uso de la sutura de polipropileno 6-0, coloque un punto en bolsa de tabaco en la cúpula de la vejiga de la siguiente manera: el lugar del primer lanzamiento a través de la pared de la vejiga en sentido longitudinal, lateral al sitio propuesto para el tubo de cistostomía. Deja una pequeña pinza en el extremo suelto de manera que la sutura no se retiró sin darse cuenta hasta el final. Colocar la siguiente tirada en una dirección transversal, a partir de entrar en la primera pared de la vejiga ligeramente lateral a la salida de su primer tiro. </li><li> No tire de la sutura tensa. Coloca el paralelo de sutura al lado de su primera (longitudinalmente) de entrar en la vejiga justo cefálico al punto de salida de la última sutura, transversal. El tiro cuarto comenzará lateral a la salida de la última puntada y final junto a la entrada para su tiro muy primera. Hecho correctamente, este forma una plaza circular en torno a la propuesta de inserción del catéter (Figura 7). </li><li> Usando una aguja 18G, perforar la pared de la vejiga en el centro de la jareta. Tenga cuidado de no perforar demasiado profundamente (lo suficiente como para ser intraluminal). Coloque las puntas de sus pinzas finas en la apertura y abre suavemente para ampliar el agujero. </li><li> Insertar el extremo bulbed del catéter en el defecto en elvejiga hasta que es intraluminal. Tire de la jareta apretada alrededor del catéter y amárrela. Esto debe cinchar la pared de la vejiga alrededor del catéter manteniéndolo en su lugar (Figura 8). </li><li> Tome uno de los extremos de la sutura y se envuelve alrededor del catéter una vez y que relacione el presente hacia abajo para asegurar aún más el catéter. </li></ol> 7. Prueba del catéter y cierre de la incisión abdominal <ol><li> Con una aguja 1 ml jeringa y 25G, insertar la aguja en el tubo y lentamente inyectar solución salina para distender la vejiga. Observe si hay pérdidas de alrededor del catéter. Una vez que vea saliendo de la uretra, aspire la solución salina para descomprimir la vejiga de nuevo. </li><li> Cerrar la incisión abdominal como anteriormente en los pasos 4.1-4.4. </li></ol> 8. Cierre de la incisión dorsal y fijación del catéter (para ratas) <ol><li> Vuelva a colocar el animal en decúbito prono. </li><li> Cortar el tubo del catéter en el nivel de la piel con las tijeras. Inserte un contundente 22G tip aguja en el tubo. </li><li> Cerca de la piel que cubre el tubo con poliglactina 4-0 en forma corriendo. Agregar el cubo de la aguja de extrusión de la piel. </li><li> Coloque un extremo de línea intravenosa en la aguja de punta roma. Usando sutura de seda 3-0, asegurar la punta del catéter a la piel (Figura 9). </li><li> Limpie la herida. Traslado de la rata en una jaula caliente, limpia para el despertar de la anestesia. </li></ol> 8. * Cierre de la incisión dorsal y fijación del catéter (de los ratones o ratas) <ol><li> * Ocluir el extremo distal del catéter por retorcimiento o usando una llama para fundir el extremo. </li><li> Bobina * el extremo del tubo y dejarlo en la bolsa subcutánea en el dorso del animal (no corte la tubería para reducir su longitud) (Figura 10). </li><li> * Cerca de la piel que cubre el tubo con poliglactina 4-0 en forma corriente (Figura 11). </li><li> * En el día de la cistometría, preparar la incisión dorsal con betadine y el 70% de etanol. Abra la incisión dorsal bajo anestesia y retire la tubería flexible de la bolsa subcutánea. Cierre de la incisión. Despierta el animal de la anestesia y realizar cistometría cuando esté completamente despierto. </li></ol> 9. Resultados representativos - Métodos quirúrgicos La vejiga reconstruido debe ser tan hermético como sea posible para evitar complicaciones relacionadas con una fuga urinaria significativa (Figura 3). Dolor o malestar general, escalofríos, o manifestarse en forma de arañazos y abriendo paso en la incisión abdominal. Esto se puede controlar con inyecciones subcutáneas diarias de un fármaco no esteroide anti-inflamatorio, como meloxicam (0.5-1.0 mg / kg por vía subcutánea). Por lo general, los animales sólo requieren la inyección de los primeros 3 días después de la operación. Esto puede ser complementado con un opioide, tales como buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg por vía subcutánea cada hora 8-12) según sea necesario. Los animales deberán ser controlados a los 3 veces al día durante los primeros 3 días después de la operación, TWde hielo al día para el post-operatorio días 3-5 y luego todos los días a partir de entonces para evaluar el dolor, signos de infección, la curación adecuada de la herida, la actividad, el aseo y la turgencia de la piel. Los antibióticos (Baytril, 5mg/kg por vía subcutánea cada 24 horas en un volumen no superior a 0,1 ml) se dan para la cirugía de las 72 horas siguientes, como profilaxis contra la infección quirúrgica. Las señales de recuperación normal son la deambulación normal y los niveles de actividad, la alimentación adecuada y potable, ausencia de dolor o angustia (sin vocalización) y la socialización normal con cagemates. Un tiempo de recuperación de al menos 5-7 días se debe dar antes del análisis cistométrica, para permitir la cicatrización de vejiga y una disminución de la inflamación que podrían afectar los resultados. Los análisis cistométricos 10. Análisis cistométrico Despierta <ol><li> El programa de instalación se describe con MLT844 ADInstruments con la captura y análisis de datos con LabChart v6 (ADInstruments) y la infusión con una bomba de jeringa de Harvard, 22 (Harvard ApparaTus, Holliston, MA), aunque otros sistemas comparables están disponibles (Figura 12). </li><li> Calibrar el volumen y la presión sobre la base de las especificaciones del sistema de cistométrica utilizado. </li><li> Coloque los animales en jaulas metabólicas (jaulas con piso de malla de alambre) que están suspendidas en una escala. La escala está conectado a un transductor. </li><li> Purgar el sistema de las burbujas de aire y garantizar un flujo continuo desde la bomba de infusión. </li><li> Conecte el sistema de captura de datos a un ordenador y observar los trazados de datos. Ajuste la escala correspondiente. Presión de la vejiga y el volumen de orina se registran de forma continua. </li><li> El acceso a los catéteres suprapúbicas con una aguja 27G conectado a través de un tubo en T para el transductor de presión y la bomba de infusión. Comience la infusión de solución salina fisiológica a 12,5 l / min para el ratón y 100 l / min para la rata. </li><li> Permitir que el patrón de la micción rastreo para estabilizar (aumento de presión vesical, seguido por un vacío). Esto usualmente toma aproximadamentedamente 10-20 minutos. Registre los ciclos de micción de 45-120 minutos o menos ciclos de vaciamiento 3-4. </li><li> Observe todo el procedimiento en tiempo real para solucionar las complicaciones que llevarán al artefacto (es decir, retorcimiento del catéter, obstrucción, etc, véase más adelante la discusión). </li><li> Detener la infusión, desconecte el catéter del sistema, y ​​devolver el animal a su jaula. </li></ol> 11. Análisis inconsciente cistométrico (No catéter suprapúbico) <ol><li> Se anestesia el animal con uretano (1.2 g / kg) por inyección intraperitoneal (IP). </li><li> Exponer la vejiga como en los pasos por encima de 1.3-2.4. </li><li> Calibrar el sistema como en el paso 9,2. Preparar el sistema como en el paso 9.4-9.5. </li><li> Insertar una aguja 27G conectado a través de un tubo en T para el transductor de presión y la bomba de infusión en la cara lateral de la vejiga. </li><li> Registre los ciclos de micción de 45-90 minutos. </li><li> Detener la infusión, retirar la aguja de la vejiga y la eutanasia del animal. &lt;/ Li&gt; </ol> 12. Resultados representativos - Análisis cistométricos Trazados urodinámicos se pueden analizar para obtener parámetros como volúmenes anulados, el cumplimiento, las puntas de presión de vaciado, el intervalo entre la contracción, el tiempo de ciclo de la micción y los volúmenes de residuo postmiccional. Cistometrograma se puede dividir en un relleno y una fase de vaciado. Una fase de llenado normal es la porción del ciclo de la micción en el que la vejiga se llena con muy poco cambio en la presión intravesical. Una fase de vaciado normal de la localización consiste en un aumento constante de la presión intravesical que corresponde a la contracción del detrusor. La presión más alta alcanzada durante la fase de vaciado del trazado se denomina la presión miccional máximo. Un pico de presión alta micción podría sugerir un patrón miccional obstructiva, la vejiga o torcedura hipercontráctil un catéter en el SP. El cumplimiento puede ser calculada mediante la adquisición de la relación del volumen instilado During la fase de llenado y el cambio en la presión (= cumplimiento dV / DP). Una vejiga hypocompliant es uno que no está en condiciones adecuadas para dar cabida a los volúmenes de orina a baja presión. El intervalo entre puede calcularse mediante el análisis del tiempo entre dos contracciones como se ve en la cistometrograma. Un corto intervalo entre sugiere una vejiga irritable. El tiempo de ciclo de la micción se refiere al tiempo que tarda un llenado completo y la micción fase para completar y puede ser fácilmente comprobada por el análisis de la localización. A la conclusión de la cistometría, post-vaciado residual (RVP) se puede obtener. Esto se hace por aspiración del catéter suprapúbico a la terminación de una contracción del detrusor. Estos parámetros ayudan al investigador objetivamente estudiar la dinámica de la vejiga, como la vejiga se llena y se vacía. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig1.jpg" /> Figura 1. Fotografía de la incisión abdominaly extrusión de la vejiga. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig2.jpg" /> Figura 2. Incisión vejiga con la exposición de la luz vejiga. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig3.jpg" /> Figura 3. La integración del implante en la pared de la vejiga. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig4.jpg" /> Figura 4. Fotografía de la incisión cerrada. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig5.jpg" /> Figura 5. El extremo abocinado del tubo de PE-50. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig6.jpg" /> Figura 6. PE-50 tubo (catéter) a través de la incisión dorsal. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig7.jpg" /> Figura 7.Bolsa de tabaco sutura. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig8.jpg" /> Figura 8. Fijación del catéter a la vejiga. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig9.jpg" /> Figura 9. Conexión del catéter asegurado. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig10.jpg" /> Figura 10. Tubería flexible en la bolsa subcutánea. <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig11.jpg" /> Figura 11. Cierre de la incisión dorsal. <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig12.jpg" /> Figura 12. Ejemplo cistométrica puesta a punto. <img alt="Figura 13" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig13.jpg" /> Figura 13. Cistometría Representante de rastreo.

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E., Talo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+rhabdosphincter+in+female+rat+voiding.">The role of the rhabdosphincter in female rat voiding.</a> BJU Int. 94, 138-142 (2004).</li><li>Malmgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystometrical+evaluation+of+bladder+instability+in+rats+with+infravesical+outflow+obstruction.">Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction.</a> J. Urol. 137, 1291-1294 (1987).</li><li>Smith, P. P., Kuchel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+uroflow+cystometry+in+the+urethane-anesthetized+mouse.">Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse.</a> Neurourol. Urodyn. 29, 1344-1349 (2010).</li><li>Cannon, T. W., Damaser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+anesthesia+on+cystometry+and+leak+point+pressure+of+the+female+rat.">Effects of anesthesia on cystometry and leak point pressure of the female rat.</a> Life Sci. 69, 1193-1202 (2001).</li><li>Smith, P. P., Hurtado, E., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystometric+methods+in+female+rats.">Comparison of cystometric methods in female rats.</a> Neurourol. Urodyn. 27, 324-329 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Evaluaciones cistométricos de configuraciones después de la implantación de biomateriales y el aumento de la vejiga en animales pequeños, representa un paso importante en la identificación de validación óptimas características estructurales y mecánicas de los diseños de la matriz para su uso en situaciones clínicas. En este estudio, se describen los métodos quirúrgicos para llevar a cabo el aumento de la vejiga en ratones y ratas, así como técnicas para determinar las propiedades cistométricos urodinámicos de los órganos de ingeniería para las evaluaciones funcionales. Hemos utilizado estas técnicas en múltiples experimentos que involucran tanto en ratones y ratas, con cada experimento que consta de 30 roedores + sin problemas significativos. Nuestro laboratorio de investigación es un conglomerado diverso de científicos básicos y médicos cirujanos y cirujanos con al menos 5-6 años de formación de postgrado quirúrgico que se realiza a los aspectos procedimentales de estos experimentos. Independientemente del tipo de biomaterial utilizado, la mayor diferenc entre aumentar la vejiga en ratas frente a ratones es el tamaño de la vejiga. Debido al tamaño pequeño de vejiga, la disección y la incorporación del biomaterial es técnicamente más difícil en el ratón. Para ayudar en la visualización, un microscopio quirúrgico puede ser utilizado. Dado que el tamaño de la vejiga en ratas es mayor, es más susceptible a las situaciones donde más de un procedimiento tiene que ser realizado en la vejiga (por ejemplo, el aumento y la colocación de catéter cistostomía). Además, el protocolo anterior describe el uso de tubos de PE-50 para la rata 13, sin embargo, incluso los catéteres grandes de tamaño, hasta PE-100 se han utilizado, especialmente para estudios a largo plazo 14. En ratones, un calibre más pequeño, tales como PE-10 tubo puede ser utilizado 15,16, pero se debe tener en cuenta que más pequeño, más tubos flexibles no pueden transmitir los cambios de presión al transductor con precisión. Además, el método alternativo de asegurar el catéter en el dorso (paso 8 * supra) se realiza en millasdebido a su menor tamaño corporal y la aguja de punta roma y la tapa IV CE son demasiado engorrosos. La desventaja de esto es la necesidad de anestesia para extraer el extremo del catéter en la bolsa subcutánea antes de cistometría. Los estudios han demostrado que en los días iniciales de los primeros (0-4 días) después de la colocación de los catéteres, cistometría reveló altas presiones de la vejiga y la hiperactividad con los volúmenes miccionales bajos. Estos hallazgos parecen estabilizarse en torno al sexto y el séptimo día 14,17 y por lo tanto, es probablemente el momento ideal para la evaluación cistométrica. Sin embargo, la mayoría de los informes en la literatura realizar cistometría en los primeros 3 días de cateterización de 18 años, y las cuentas de estos para la amplia variación en los parámetros anteriores en relación con el tiempo. Dejar el catéter suprapúbico para una mayor duración de 3 días lleva consigo la morbilidad como el riesgo de piedras, desplazamiento, infección, hematuria y la oclusión del catéter de escombros. &lt;clase p = &quot;jove_content&quot;&gt; Diferentes tasas de infusión durante la cistomanometría se han descrito de 1-3mL/hr para los ratones y 15,16 para las ratas 10-11mL/hr 13,19,20. Las tasas de suprafisiológicas de infusión puede causar presiones falsamente elevadas 14. Utilizamos una velocidad de infusión de 12,5 l / min (0,75 ml / h) para ratones y 100 l / min (6 ml / h) para las ratas en nuestra configuración, pero menores tasas también puede ser utilizada. La temperatura de la solución salina fisiológica debe ser por lo menos a temperatura ambiente, aunque tibia (37 °) de solución salina es más óptima con el fin de evitar hiperactividad de la vejiga provocada con infundir solución fría. En la cistometría despierto, es crucial para permitir la estabilización del patrón de la micción cuando el animal se convierte en ajustarse a la jaula, que en nuestra experiencia requiere un período de ~ 10-20 minutos. Después de esto, los ciclos regulares de la micción puede ser grabado para 45-120 minutos o, como mínimo, los ciclos de vaciamiento 3-4. El animal debe ser observado en tiempo real ya que el animal es de libre Moving, y complicaciones como torsión o retorcimiento del catéter puede alterar el análisis cistométrica. Limitar el ruido ambiental durante la cistomanometría se desea disminuir el movimiento de los animales y artefactos posteriores. Cistometría inconsciente no tiene los problemas concomitantes como la cistometría despierto, pero varios anestésicos se ha demostrado que inhibir las contracciones espontáneas de vejiga. Esta inhibición se corresponde directamente con la duración prevista de la acción de los fármacos anestésicos, es decir, cuando desaparece el efecto anestésico, las contracciones espontáneas reanudar la 14. Por otra parte, las presiones medidas cuando la vejiga se desbordó, eran estadísticamente mayor en ratas anestesiadas, ambos vivos y post mortem, lo que indica un efecto sobre las propiedades de cumplimiento pasivos de la pared de la vejiga. Este efecto se ve con pentobarbital 21, ketamina, y cloralosa AI / IP, además de halotano inhalado e intratecal nesacaine 14. Un estudio más amplio de las diversas confirmación anestésicosm este hallazgo con la supresión del reflejo de micción de los anestésicos inhalatorios tanto (isoflurano y metoxiflurano) y barbitúricos (pentobarbital y thiobutabarbital) en los niveles de anestesia moderada 17. Este efecto se observó con los niveles de luz uniforme o sedantes de la anestesia con medicamentos como el fentanilo-droperidol y la ketamina-diazepam, y como en el estudio anterior, ya que el efecto de la anestesia disminuido, al igual que la inhibición de la 17. Para este procedimiento, uretano inyecciones intraperitoneales se puede utilizar ya que se ha demostrado que la micción reflejo se conserva, además de facilitar una anestesia adecuada 17,22. Además, no hay efecto se observa con respecto a las presiones de micción 23. Colocación de un catéter suprapúbico para la cistometría se describe aquí, ya que el cateterismo intrauretral se ha demostrado que tienen mayores curvas de presión de la vejiga y menores tasas de flujo constante en relación con la obstrucción del tracto urinario inferior 24.Por otra parte, el cateterismo intrauretral sólo es factible en animales anestesiados, y aún así, el cateterismo puede ser difícil, especialmente en los roedores machos y ratones. En conclusión, la elección de cuál es el modelo a utilizar para el aumento de la vejiga y / o análisis cistométrica depende de los objetivos del estudio específico. Desde un punto de vista técnico el modelo de rata con claridad tiene la ventaja por las razones expuestas anteriormente. Sin embargo, el modelo de ratón puede ser utilizado en los estudios que evalúan las funciones específicas de los productos finales de genes codificados en las enfermedades de las vías urinarias, debido a su susceptibilidad a la manipulación genética. Esto no es generalmente factible en la rata. Cistometría despierto la mayor parte reproduce con precisión el estado fisiológico normal en el que dichos animales se sometan a sus ciclos de micción, y por lo tanto, es probable que dé una determinación fisiológica más fiable de la función de la vejiga. Por otra parte, la variable de confusión de los efectos directos de unanesthetics en función de la vejiga se evita.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiales: </td><td> Descripción / uso: </td></tr><tr><td> Tijeras de afeitar </td><td> Preparación de rata / ratón para la cirugía </td></tr><tr><td> Paños estériles, betadine, el 70% de etanol, gasa estéril </td><td> Preparación de campo quirúrgico estéril </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Instrumentos: </td></tr><tr><td> Hoja de bisturí </td><td> Incisión cutánea </td></tr><tr><td> pinzas con dientes </td><td> La manipulación de la piel </td></tr><tr><td> Unas pinzas finas </td><td> Atraumática (sin dientes), no hay dientes de sierra o con estrías finas para manipular </td></tr><tr><td> Controlador de la aguja pequeña </td><td> La disección de tejidos de Sharp </td></tr><tr><td> Metzenbaum tijera </td><td> Bldder incisión </td></tr><tr><td> Tenotomía tijera </td><td> Para suturas de retracción y desarrollar subcutánea tunnel (catéter de cistostomía) </td></tr><tr><td> Las pequeñas pinzas curvas </td><td> Subcutánea túnel (catéter de cistostomía) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Suturas: </td></tr><tr><td> 6-0 suturas de polipropileno </td><td> Suturas vesicales estancia y jareta </td></tr><tr><td> 7-0 poliglactina de sutura </td><td> La anastomosis de andamio para la vejiga </td></tr><tr><td> Sutura de poliglactina 4-0 </td><td> Cierre de músculo / la piel </td></tr><tr><td> 3-0 o sutura de seda 4-0 </td><td> Asegurar la punta del catéter a la piel </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Las agujas y jeringas: </td></tr><tr><td> Calibre 18 con aguja </td><td> La perforación de la vejiga por catéter de cistostomía </td></tr><tr><td> 25 y 30 agujas de calibre </td><td> Prueba de la vejiga que no haya fugas </td></tr><tr><td> 1 ml de solución salina fjeringa illed </td><td></td></tr><tr><td> Calibre 22 punta de la aguja roma </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Cistostomía catéter: </td></tr><tr><td> PE-50 tubería </td><td></td></tr><tr><td> Encendedor </td><td> Quema de la tubería PE-50 </td></tr><tr><td> Abrazadera curva pequeña </td><td> El desarrollo de túnel subcutáneo </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Cistometría: </td></tr><tr><td> MLT844 ADInstruments de captura de datos y software LabChart </td><td> Datos de presión adquisición </td></tr><tr><td> 22 Harvard bomba de jeringa (Harvard Apparatus, Holliston, MA) </td><td> Bomba de infusión de fluidos </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Anestésicos (cistometría inconsciente): </td></tr><tr><td> Yosoflurane </td><td> Inducción / mantenimiento de la anestesia general </td></tr><tr><td> Uretano </td><td> Unconconscious cistometría </td></tr><tr><td> Bupivicaína o equivalente </td><td> La anestesia local </td></tr><tr><td> El meloxicam </td><td> La analgesia postoperatoria </td></tr><tr><td> La buprenorfina </td><td> La analgesia postoperatoria </td></tr></tbody></table>

evaluation of biomaterials for bladder augmentation using cystometric analyses in various rodent models

La función renal y la continencia de la orina son críticamente dependientes del correcto funcionamiento de la vejiga urinaria, que almacena la orina a baja presión y lo expulsa con una precisión orquestado contracción. Una serie de anomalías urológicas congénitas y adquiridas, incluyendo las válvulas uretrales posteriores, la hiperplasia benigna de próstata y la vejiga neurogénica secundaria a espina bífida / lesión de la médula espinal pueden dar lugar a la remodelación del tejido patológico que lleva al cumplimiento de deterioro y la disminución de la capacidad 1. Obstrucción funcional o anatómica del tracto urinario se asocia con frecuencia a estas condiciones, y puede llevar a la incontinencia urinaria y daño renal causado por aumento en el almacenamiento y las presiones de vaciado 2. La implantación quirúrgica de segmentos del tracto gastrointestinal para ampliar la capacidad de órganos y reducir las presiones intravesicales representa la principal opción de tratamiento quirúrgico para estos trastornos cuando el tratamiento médico falla 3. Sin embargo, este enfoque es obstaculizared por la limitación de tejido de un donante disponible, y se asocia con complicaciones importantes, como la infección crónica del tracto urinario, la perturbación del metabolismo, formación de cálculos urinarios, y malignidad secundaria 4,5. La investigación actual en la ingeniería del tejido de vejiga está muy centrado en la identificación de las configuraciones de biomateriales que pueden apoyar la regeneración de los tejidos en los sitios de defectos. Convencional en 3-D andamios derivado a partir de polímeros naturales y sintéticos, tales como la submucosa del intestino delgado y el ácido poli-glicólico han demostrado algún éxito a corto plazo en el apoyo de la regeneración del músculo liso y urotelial así como facilitar una mayor capacidad de almacenamiento de órganos en ambos modelos animales y en el clínica de 6,7. Sin embargo, las deficiencias en la integridad mecánica y la biocompatibilidad de andamio a menudo resultan en la fibrosis nocivo 8, contractura del injerto 9, 10 y calcificación, lo que aumenta el riesgo de fracaso del implante y la necesidad de for procedimientos quirúrgicos secundarios. Además, la restauración de las características de la micción normal estándar que utilizan las construcciones de biomateriales para la cistoplastia de aumento aún no se ha logrado, y por lo tanto, la investigación y el desarrollo de matrices nuevas que pueden cumplir esta función es necesario. Con el fin de desarrollar y evaluar los biomateriales óptimas para el aumento de la vejiga clínica, la investigación de eficacia debe llevarse a cabo en modelos animales estándar que utilizan los métodos quirúrgicos detallados y evaluaciones de resultado funcionales. Hemos informado anteriormente el uso de un modelo de aumento de la vejiga en ratones para determinar el potencial de seda fibroína basados ​​en andamios para mediar en la regeneración del tejido y las características funcionales miccionales. 11,12 análisis cistométricos de este modelo han demostrado que las variaciones en las propiedades estructurales y mecánicas del implante puede influir en las características resultantes del estudio urodinámico en las vejigas de ingeniería tisular 11,12. Correlación positivaciones entre el grado de regeneración de los tejidos matriz mediada determinó histológicamente y el cumplimiento funcional y capacidad evaluada por cistometría se demostraron en este modelo 11,12. Estos resultados sugieren que por lo tanto, las evaluaciones funcionales de las configuraciones de biomateriales en los sistemas de roedores ampliación vesical puede ser un formato útil para la evaluación de las propiedades de los andamios y el establecimiento de la viabilidad in vivo antes de que los estudios en animales grandes y la implementación clínica. En el estudio actual, vamos a presentar varias etapas quirúrgicas de aumento de vejiga en ratas y ratones usando andamios de seda y demostrar las técnicas de cistometría despierto y anestesiado.

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Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Etapas quirúrgicas de aumento de la vejiga se describen utilizando en 3-D andamios en modelos murinos y la rata. Para probar la eficacia de las configuraciones de biomateriales para su uso en aumento de la vejiga, las técnicas para cistometría tanto despierto y anestesiado se presentan.

Evaluación de Biomateriales para el aumento de la vejiga usando análisis cistométricos en modelos de roedores Varios

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.1K vistas.  Harvard Medical School. Etapas quirúrgicas de aumento de la vejiga se describen utilizando en 3-D andamios en modelos murinos y la rata. Para probar la eficacia de las configuraciones de biomateriales para su uso en aumento de la vejiga, las técnicas para cistometría tanto despierto y anestesiado se presentan.

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Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Fabricación de micro-tejidos, utilizando los módulos de gel de colágeno las células que contienen

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Investigación

Bioingeniería

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de Biomateriales<em&gt; En Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microentornos-Sandwich como para aprovechar Celulares / Materiales Interacciones

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Síntesis de nanotubos de carbono multipared modificados con nanopartículas de plata y la evaluación de sus actividades antibacterianas y propiedades citotóxicas

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Perfil de compatibilidad biológica de Biomateriales para regeneración ósea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificación y análisis de un anticuerpo monoclonal de células de ovario de hámster chino utilizando un sistema automatizado de microbiorreactores

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Evaluación de comportamientos fotosintéticos mediante mediciones simultáneas de la reflectancia de la hoja y análisis de fluorescencia de clorofila

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows assessment of bone substitution materials for oral and craniofacial bone regeneration in terms of bone growth and neovascularization support. Once animals are anesthetized and ventilated (endotracheal intubation), four cylinders made of polyether ether ketone (PEEK) are screwed onto the skull, on both sides of the median and coronal sutures. Five intramedullary holes are drilled within the bone area delimited by each cylinder, allowing influx of bone marrow cells. The material samples are placed into the cylinders which are then closed. Finally, the surgical site is sutured, and animals are awaken. Bone growth may be assessed on live animals by using microtomography. Once animals are euthanized, bone growth and neovascularization may be evaluated by using microtomography, immune-histology and immunofluorescence. As the evaluation of a material requires maximum standardization and calibration, the calvarial model appears ideal. Access is very easy, calibration and standardization are facilitated by the use of defined cylinders and four samples may be assessed simultaneously. Furthermore, live tomography may be used and ultimately a large decrease in animals to be euthanized may be anticipated.

Here we present a surgical protocol in rabbits with the aim to assess bone substitution materials in terms of bone regeneration capacities. By using PEEK cylinders fixed onto rabbit skulls, osteoconduction, osteoinduction, osteogenesis and vasculogenesis induced by the materials may be evaluated either on live or euthanized animals.

Modelo Calvarial de Aumento Óseo en Conejo para Evaluación del Crecimiento Óseo y Neovascularización en Materiales de Sustitución Ósea

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Clarificación primaria del fluido de cultivo celular cosechado con CHO utilizando un separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...