Nuestro protocolo mide el ATP, un transmisor importante en la vejiga urinaria, lo que nos permitirá interrogar más a fondo los mecanismos que controlan su liberación. Nuestra técnica mide el ATP directamente desde la luz de la vejiga, por lo que es más relevante fisiológicamente que las técnicas que utilizan células cultivadas o tejido vesical. Demostrando el procedimiento estarán Keara Healy y Stephanie Daugherty, técnicas de investigación en mi laboratorio.
Para comenzar, inducir la anestesia inicial colocando al animal en una caja cerrada gaseada con 4% a 5% de isoflurano en oxígeno. Administre uretano por vía subcutánea bilateralmente, luego coloque al animal en una jaula para permitir que el uretano haga efecto durante casi dos horas. Después de esperar a que el uretano haga efecto, pruebe un plano adecuado de anestesia pellizcando el pie del animal con fórceps.
Para evitar la contracción de la vejiga en respuesta a la distensión durante el experimento, inyecte al animal un agente bloqueador ganglionar, hexametonio. A continuación, aplique ungüento oftálmico en los ojos del animal para evitar que se seque durante el experimento. Ahora afeite el abdomen del animal y realice una laparotomía de línea media para exponer la vejiga urinaria.
Con una llama, encienda un extremo de un tubo intramédico PE50 de corta longitud, coloque una aguja de calibre 22 en el otro extremo del tubo y llénelo con solución de Krebs. Coloque un pequeño bucle de sutura de seda 3-0 sobre la cúpula de la vejiga y realice una pequeña cistostomía para insertar el extremo acampanado del catéter. Mientras sostiene el catéter con una mano, apriete el asa de sutura para asegurar el catéter en su lugar con la otra mano.
Termine de asegurar el catéter atando dos nudos en la sutura. Tire del catéter hacia atrás hasta que la cabeza ensanchada esté en contacto con la pared de la vejiga. Pruebe la configuración para detectar fugas infundiendo una pequeña cantidad de solución de Krebs a través del catéter.
Sumerja el extremo de un catéter intravenoso en lubricante quirúrgico. Sostenga suavemente el meato uretral externo con un par de fórceps e inserte la punta del catéter en el orificio uretral en la dirección de la cola, como se describe en el manuscrito. Gire el catéter 90 grados y avance suavemente.
Inserte el catéter hasta que el cubo de bloqueo luer esté cinco milímetros distal de la abertura uretral externa. Asegure el catéter y evite fugas alrededor del catéter enrollando una longitud corta de sutura de seda 3-0 alrededor del meato uretral externo y atándolo firmemente. Asegure el catéter a la cola con cinta adhesiva para evitar que se saque accidentalmente.
Una vez cateterizado, infunda suavemente la solución de Krebs en la vejiga a través del catéter suprapúbico de la vejiga y confirme que el líquido fluye fuera del catéter uretral y no alrededor de él. Cierre la incisión abdominal sobre la vejiga con una sutura de seda 3-0. Coloque una almohadilla base absorbente en una almohadilla térmica para mantener el calor corporal y absorber líquidos.
Asegure al animal en la tabla inclinada para ayudar a drenar el líquido intravesical a través del catéter uretral, luego encienda la almohadilla térmica. Conecte el catéter suprapúbico a una llave de parada de tres vías que conecte el catéter a una bomba de jeringa y un transductor de presión. Conecte el transductor de presión a una computadora a través de un amplificador y un sistema de adquisición de datos.
Infundir la solución de Krebs a través del catéter suprapúbico a una velocidad de 0,1 mililitros por minuto, y dejar que el líquido drene a través del catéter uretral durante una hora para eliminar cualquier ATP residual liberado durante los implantes del catéter. Después de este período de lavado, tapa el catéter uretral con un tapón luer lock. Mida la presión en la vejiga y busque un aumento lento de la presión intravesical a una presión de 30 centímetros de agua sin un aumento brusco de la presión, lo que indica una contracción de la vejiga.
Retire el tapón del catéter uretral cuando la presión alcance los 30 centímetros de agua para evitar daños en la vejiga. Infundir la vejiga y recoger el eluyente del catéter uretral. Pruebe inmediatamente las alícuotas de 100 microlitros del eluyente para detectar ATP o congele para la posterior cuantificación del lote.
Para probar el efecto de la distensión vesical en las concentraciones luminales de ATP, tapa el catéter uretral con el tapón y monitorea la presión de la vejiga hasta que alcance el nivel deseado, luego destapa el catéter uretral y recoge el eluyente para la medición o congelación de ATP, como se describió anteriormente. Después de cada distensión, deje que la vejiga descanse y se lave durante 10 a 15 minutos antes de tomar muestras adicionales. Para probar el efecto de los medicamentos en la liberación de ATP, cambie la solución de Krebs que infunde la vejiga a Krebs que contiene el medicamento de elección.
Perfundir el medicamento durante 10 a 15 minutos para tener un efecto, y luego recolectar las muestras de vejigas no distendidas y distendidas, como se demostró anteriormente. Coloque 100 microlitros de muestra de perfusión con 50 microlitros de la mezcla de ensayo en el luminómetro para su lectura. Para convertir de unidades de luz relativa a concentración de ATP, haga diluciones seriadas de ATP en solución de Krebs que van desde un micromolar a 10 picomolar en diluciones diez veces mayores para crear una curva estándar, y léalas en el luminómetro.
Trazar las lecturas resultantes en un gráfico y realizar una regresión no lineal para extrapolar las concentraciones de las muestras tomadas del animal. La infusión de la solución en la vejiga mientras el catéter uretral está tapado hace que la presión intravesical aumente bruscamente a medida que la vejiga se contrae. Después de la administración de hexametonio, se observó un aumento más gradual de la presión intravesical, lo que permitió que la presión aumentara hasta 30 centímetros de agua sin contracción.
El FCF azul brillante disminuye significativamente la pendiente de la curva estándar, suficiente para alterar los valores calculados para la concentración de ATP en la muestra. El cálculo de la concentración de ATP en una muestra utilizando el estándar de Krebs que contiene FCF azul brillante puede resultar en una subestimación de la concentración de ATP en un 50%La distensión de la vejiga aumenta las concentraciones luminales de ATP, que pueden disminuir en presencia de NTPDasa apvrasa, o aumentar cuando las ECA endógenas de NTPD se inhiben con ARL67156. Se analizó la liberación de ATP inducida por el estiramiento del urotelio.
La liberación de ATP evocada por distensión es bloqueada por los antagonistas del canal de panectina, FCF azul brillante y carbonoxolona, pero no con un antagonista del canal de conexones, ácido alfa-glicirretínico 18. Es imperativo que todas las lecturas del luminómetro se conviertan a concentraciones de ATP utilizando la curva estándar apropiada, ya que la reacción de Lucifer Luciferase es altamente susceptible a la interferencia de una amplia variedad de agentes diferentes. Nuestra técnica podría usarse para estudiar la liberación evocada por distensión de cualquier molécula en el lumen de la vejiga, suponiendo que exista un ensayo adecuado para esa molécula.
