Estamos muy agradecidos a cuatro revisores anónimos para mejorar el manuscrito, ya la Fundación Nacional para la Ciencia (Grant IOS-0546784) para el apoyo.

1. Hoja de Medición de conductancia hidráulica para Hojas hidratados (K max) <ol><li> Recoge los brotes de preferencia en la tarde o noche de tal manera que las tensiones del xilema son bajos, corte en el aire y colocar en bolsa de plástico llena de oscuridad con toallas de papel húmedas. En el laboratorio, volver a cortar al menos dos nodos desde el final de cada sesión de bajo el agua. Vamos a disparar rehidratar durante la noche en agua pura, o con otra solución que se utiliza para las mediciones hoja K. El agua ultrapura se recomienda como una solución de flujo a menos que los impactos de las diferentes soluciones han de ser investigado como un factor. </li><li> Cortar la hoja de la sesión con una hoja de afeitar nueva solución bajo flujo parcialmente desgasificada. El agua ultrapura se recomienda como una solución de flujo a menos que los impactos de las diferentes soluciones han de ser investigado como un factor. Se recomienda desgasificar la solución durante la noche en un matraz usando una bomba de vacío, pero otros métodos pueden ser empleados. </li><li> Wrap pre-estirado Parafilm alrededor del petioLe para asegurar un buen sellado entre el pecíolo y el tubo. Este paso es especialmente útil para no redondos pecíolos, como envoltura Parafilm adicional ayudará a redondear el peciolo para caber dentro de la tubería. Pasta dental puede ser aplicado a la pecíolo antes de envolver el parafilm para rellenar ranuras en los pecíolos. </li><li> Conecte la hoja de tubo de silicona bajo el agua ultrapura para evitar que el aire entre en el sistema. A medida que la hoja se eleva por encima de la fuente de agua, el agua en la tubería está a presión inferior a la atmosférica, y por lo tanto el sello es bueno si no se aspira aire en el tubo durante la medición. Alternativamente a sellar el pecíolo directamente en el tubo de silicona, un ajuste de compresión con la junta de goma se puede utilizar (por ejemplo, (Omnifit A2227 adaptador de orificio; Omnifit, Cambridge, UK); este enfoque es útil para pecíolos con formas especialmente complejas, o para hojas de hierba , que puede ser envuelto alrededor de una varilla de vidrio y se sella con el accesorio de compresión. Cuando sea factible, sellando el pecíolo directamente en SIlicone tubo tiene la ventaja de ser rápido y dejando una unión pecíolo tubo que es transparente, permitiendo burbujas sean más fáciles de ver. El tubo se conecta a un tubo de la hoja duro funcionando a un cilindro graduado en una balanza (± 10 g de resolución), que registra los datos cada 30 segundos a un ordenador (por ejemplo, utilizando &quot;Link Balance&quot; Software; Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Suiza) para el cálculo de la tasa de flujo a través de la hoja. </li><li> Las hojas deben realizarse hacia arriba la superficie adaxial en marcos de madera atadas con hilo de pescar por encima de un ventilador de caja grande y bajo una fuente de luz (&gt; 1.000 m mol • 2 • s -1 radiación fotosintéticamente activa de alta irradiancia medidas), ligeramente por encima del nivel de el menisco en el cilindro graduado. La hoja debe ser colocado por encima del agua en el cilindro graduado para asegurar que el agua en movimiento a la hoja es impulsado por la transpiración, y no entrar en la hoja bajo presión debido a la gravedad, como lo haríaser el caso si la hoja se coloca por debajo del menisco del agua en el cilindro. Los recipientes pequeños con toalla de papel húmeda se colocan dentro de la cámara de equilibrio para asegurar que el aire en el equilibrio es saturado con agua, evitando así la evaporación de la fuente de agua a la atmósfera en el equilibrio. Esta posibilidad se puede comprobar por detener el flujo dentro de la hoja usando una válvula de paso de cuatro vías en el tubo, y la comprobación de que la masa del cilindro de agua en el equilibrio no disminuye. </li><li> Colocar un recipiente de Pyrex claro lleno de agua por encima de la hoja para absorber el calor de la lámpara. </li><li> Mantener la temperatura de la hoja entre 23 ° C y 28 ° C durante todo el experimento mediante la adición de más agua fría al recipiente Pyrex de tal manera que la lámpara de calor no calienta el recipiente Pyrex suficientemente para calentar el aire alrededor de la hoja de abajo. </li><li> Permitir la hoja de transpirar en el aparato durante al menos 30 min, dando así tiempo suficiente para aclimatarse a alta irradiación, y additionally hasta que la velocidad de flujo se ha estabilizado, sin tendencia hacia arriba o hacia abajo, y con un coeficiente de variación &lt;5% por lo menos, mediciones 5-10 hechas a intervalos de 30 seg de flujo. Es esencial para la velocidad de flujo para alcanzar un estado estacionario, porque este método asume una hoja estable Ψ. Estudios anteriores encontraron estos criterios para ser suficiente para la estabilización de velocidad de flujo (E), Ψ hoja y la hoja de K; pruebas con periodos de medición más largos después de flujo estable se estableció no mostró una relación de hoja K a tiempo de medición para cada una de las siete especies de una gama rango de capacitancia hoja 17,18. Estabilización generalmente tarda 30 minutos o menos, pero en algunas especies puede requerir más de una hora para algunas especies. </li></ol> Nota: Cuando el caudal es muy baja (&lt;8 g s -1), la estabilidad se puede determinar utilizando el promedio de funcionamiento de los últimos cinco intervalos de 30 seg. </p&gt; <ol start="9"><li> Deseche las mediciones si el flujo cambia de repente, ya sea debido a cierre de los estomas repentino o drenaje desprende del sello o bloqueo en el sistema de partículas o burbujas de aire. </li><li> Cuando el flujo se estabilice, grabar temperatura de la hoja con un termopar. </li><li> Retire rápidamente la hoja de la tubería, limanda secar el pecíolo y coloque la hoja en una bolsa sellable que previamente había sido exhalado en, para detener la transpiración. </li><li> Deje que la hoja se equilibre en su bolsa por lo menos durante 20 minutos. </li><li> Promedio de las últimas 10 mediciones de caudal. Esta será su medición E. </li><li> Cuando la hoja se equilibra, medir el potencial de agua de la hoja final (Ψ final) con una cámara de presión. </li><li> Medir el área de la hoja con un escáner de superficie plana y software de procesamiento de imágenes, o con un medidor de área foliar. </li><li> K hoja se calcula como E /-ΔΨ hoja (donde ΔΨ hoja final = Ψ </sub&gt; - 0 MPa) y más normalizada por el área foliar. Las unidades se expresan en mmol m -2 s -1 MPa -1. Debido a que la hoja se coloca justo por encima del nivel de agua en el cilindro graduado, el efecto de la gravedad en la reducción de la presión de entrada de agua en la hoja sería insignificante, especialmente en lo relativo a la final Ψ, que siempre es&gt; -0,1 MPa. </li><li> Para corregir los cambios en K hoja inducidos por la dependencia de la temperatura de la viscosidad del agua 15,19,20, normalizar los valores de K foliar a 25 ° C mediante el uso de la ecuación siguiente: </li></ol><img alt="Ecuación 1" fo:content-width="3.863in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq1.jpg" /><ol start="18"><li> La conductancia estomática (g s) se puede determinar como E dividida por la diferencia de presión de las hojas-aire vapor, equivalente a la pressu vaporre déficit (VPD), determinados mediante un sensor de temperatura y humedad relativa adyacente a la hoja. VPD se calcula utilizando la siguiente ecuación 21 </li></ol><img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq2.jpg" fo:content-width="1.67in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq2highres.jpg" /> donde RH es la humedad relativa, VP es la presión de saturación de vapor del aire (en kPa; una función de la temperatura, de acuerdo con la ecuación Arden Buck 22), y el AP presión atmosférica (en kPa). 2. Medición de conductancia hidráulica para la hoja Las hojas deshidratadas <ol><li> Recoge los brotes de preferencia en la tarde o noche de tal manera que las tensiones del xilema son bajos, corte en el aire y en lugar oscuro bolsas de plástico llenas de toallas de papel húmedas. En el laboratorio, volver a cortar al menos dos nodos desde el final de cada sesión de bajo el agua. Vamos a disparar rehidratar durante la noche en agua pura, o con otra solución que se utilizará para K leaf mediciones. El agua ultrapura se recomienda como una solución de flujo a menos que los impactos de las diferentes soluciones han de ser investigado como un factor. </li><li> Cortar los brotes en segmentos con al menos tres hojas en agua ultrapura y deshidratar brotes con un ventilador para diferentes períodos de tiempo a una gama de valores de hoja Ψ. </li><li> Una vez que los brotes están deshidratados, coloque bolsas de cierre hermético (Whirl-Pak; Nasco, Fort Atkinson, WI, EE.UU.), que han sido previamente exhalado in) alrededor de cada hoja de la filmación, y luego coloque el rodaje todo en una bolsa sellable grande con el papel mojado toalla. </li><li> Que el rodaje equilibrar durante al menos 30 min (para los brotes fuertemente deshidratados más largos tiempos de equilibrio puede ser necesario). </li><li> Después de la equilibración, especial la hoja superior e inferior y la medida inicial hoja Ψ (Ψ = O) con una cámara de presión. </li><li> Descartar la sesión si la diferencia en la hoja Ψ de esos dos hojas es mayor que 0,1 MPa (para stronGly hojas deshidratadas, este rango puede ser extendido a 0,3 MPa). </li><li> La tercera hoja se utiliza entonces para determinar K hoja y s g con la EFM, siguiendo los pasos 1.2 -1.18 anteriores. Notablemente, E estado estacionario se puede conseguir incluso para las hojas que han sido severamente hojas deshidratadas, como estomas todavía abrir y generar valores sustancialmente más altas que la conductancia cuticular 17 g s. </li><li> Para construir las curvas de vulnerabilidad hidráulicos, calcular hoja K utilizando la final Ψ como en el paso 1,16, y luego la trama K valores de hoja contra el que sea más bajo, o Ψ Ψ o final, es decir, el más fuerte deshidratación experimentada por la hoja durante el experimento (= Ψ más bajo). De manera similar, la disminución de g s en respuesta a la deshidratación hoja puede ser determinada por el trazado g s contra más bajo Ψ. El trabajo previo ha SH<html> propio que la deshidratación induce al menos parcialmente la disminución irreversible de K foliar y g s 14,16. </li><li> Se recomienda obtener al menos 6 valores foliares de K por intervalo de 0,5 MPa de Ψ más bajo (este intervalo puede reducirse a 0,25 MPa si la especie que se está trabajando es muy vulnerable a la deshidratación). </li><li> Realizar prueba de Dixon outlier en los valores foliares de K para cada intervalo de agua 0,5 MPa de potencial más bajo Ψ para eliminar los valores extremos de la curva de vulnerabilidad 23. </li><li> Dado que las especies difieren en sus respuestas de K foliar y s g a la deshidratación 14,16, aptos funciones diferentes para cada especie y seleccionar la máxima verosimilitud (menor valor de AIC, ver 14 para más detalles). Se recomienda fijar al menos cuatro funciones utilizadas anteriormente en la literatura: lineal (pg &quot;fo: content-width =&quot; 1.4in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/4179/4179eq3highres.jpg &quot;/&gt;), sigmoidal ( <img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq4.jpg" fo:content-width="1.483in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq4highres.jpg"/> ), Logística ( <img alt="Ecuación 5" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq5.jpg" fo:content-width="1.7in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq5highres.jpg"/> ) Y exponencial ( <img alt="Ecuación 6" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq6.jpg" fo:content-width="1.583in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq6highres.jpg"/> ). </li></ol> 3. Los resultados representativos La disminución de la conductancia hidráulica hoja con deshidratación varía fuertemente entre especies (Fig. 1). Sequía especies sensibles experimentan un descenso más fuerte en potenciales hídricos menos negativas que las especies más tolerantes a la sequía, cuando se mide bajo alta irradiación solar (PAR&gt; 1.000 mol m -2 • • s -1). El aguapotencial de pérdida del 80% de la conductividad hidráulica (P 80) para mesic hierba Helianthus annuus fue de 3 MPa menos negativa que la de Heteromeles arbutifolia, nativa de California chaparral. Heteromeles arbutifolia respondió linealmente a la disminución en el potencial de agua, mientras que Helianthus annuus mostró un no disminución lineal. Tanto la conductancia estomática (g s) y conductancia de la hoja hidráulica (K hoja) también puede responder dramáticamente a la radiación (Fig. 2). Para Raphiolepis indica, la conductancia estomática disminuyó fuertemente con la deshidratación de las hojas medidos bajo alta irradiación solar (PAR&gt; 1.000 mol m -2 • • s -1) y bajo la luz de laboratorio (PAR &lt;6 mmol m -2 • • s -1). Bajo alta irradiación, hojas mide con el EFM que había sido deshidratada al potencial del agua que es típico para bien iluminado leaVES en plantas intactas a mediados de día mostró similar s g de hojas como medidas en las plantas intactas con un porómetro (estrella en la fig. 2). En particular, para las hojas de máxima hidratación, K foliar fue cuatro veces mayor para las hojas expuestas a alto de baja irradiación (11 frente a 2,8 mmol m -2 s -1 MPa -1), y por lo tanto K foliar mostraron una respuesta más fuerte luz en el pozo hojas hidratados que g s. Además, bajo alta irradiación, K foliar se redujo más fuertemente con la deshidratación. El P 80 fue de 0,93 MPa menos negativo que en condiciones de alta irradiancia baja. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4179/4179fig1.jpg" /> Figura 1. Hojas curvas hidráulicas de vulnerabilidad de una sequía sensible (arriba) y un tolerantes a la sequía (abajo) de las especies (14,24). Cada punto representa un pecadogle medición de conductancia de la hoja hidráulica (K foliar) en una hoja separada con el método de evaporación flujo (EFM). Las barras verticales representan el potencial de agua en el que las especies perdido 80% de conductancia de la hoja inicial hidráulica (P 80). Mejores funciones de ajuste utilizando máxima verosimilitud se trazan para ambas especies. <img alt="Ecuación 7" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq7.jpg" fo:content-width="3.293in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq7highres.jpg"/><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4179/4179fig2.jpg" /> Figura 2. La respuesta de conductancia estomática (g s) y de conductancia de la hoja hidráulica (K foliar) a la disminución potencial hídrico foliar para Raphiolepis indicador mide bajo vs alto irradiancia baja (de 16). (PAR&gt; 1,000 y &lt;6 mmol m -2 s • •-1). Cada punto representa una sola medición en una hoja individual utilizando el método de evaporación de flujo (EFM), con los puntos blancos y negro que representan hojas medidos bajo irradiación de alta y baja respectivamente. Las ecuaciones de las curvas de conductancia estomática en alta irradiancia vs baja: <img alt="Ecuación 8" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq8.jpg" fo:content-width="4.727in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq8highres.jpg" /> y <img alt="Ecuación 9" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq9.jpg" fo:content-width="2.26in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq9highres.jpg"/> . Las ecuaciones para las curvas de vulnerabilidad en la radiación de alta vs baja: <img alt="Ecuación 10" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq10.jpg" fo:content-width="2.7in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq10highres.jpg"/> y <img alt="Ecuación 11" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq11.jpg" fo:content-width="1.8in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq11highres.jpg"/> . La estrella gris en el panel superior representa la media ± standard error para g s y el potencial hídrico foliar medido en las hojas de las plantas intactas al mediodía con un porómetro. Grises y negras barras verticales en el panel inferior representa el potencial de agua en el que las especies perdido el 80% de la conductancia foliar inicial hidráulica (P 80) bajo la irradiación de alta y baja respectivamente.

<ol>
	<li>Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xylem Structure and the Ascent of Sap. , (2002).</li><li>Lawlor, D. W., Cornic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+carbon+assimilation+and+associated+metabolism+in+relation+to+water+deficits+in+higher+plants.">Photosynthetic carbon assimilation and associated metabolism in relation to water deficits in higher plants.</a> Plant Cell Environ. 25, 275-294 (2002).</li><li>Sack, L., Holbrook, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+hydraulics.">Leaf hydraulics.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 361-381 (2006).</li><li>Cochard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+role+of+aquaporins+in+variable+hydraulic+conductance+of+leaves+in+response+to+light.">Putative role of aquaporins in variable hydraulic conductance of leaves in response to light.</a> Plant Physiol. 143, 122-133 (2007).</li><li>Johnson, D. M., Meinzer, F. C., Woodruff, D. R., McCulloh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+xylem+embolism,+detected+acoustically+and+by+cryo-SEM,+corresponds+to+decreases+in+leaf+hydraulic+conductance+in+four+evergreen+species.">Leaf xylem embolism, detected acoustically and by cryo-SEM, corresponds to decreases in leaf hydraulic conductance in four evergreen species.</a> Plant Cell Environ. 32, 828-836 (2009).</li><li>Cochard, H., Froux, F., Mayr, F. F. S., Coutand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylem+wall+collapse+in+water-stressed+pine+needles.">Xylem wall collapse in water-stressed pine needles.</a> Plant Physiol. 134, 401-408 (2004).</li><li>Blackman, C. J., Brodribb, T. J., Jordan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+hydraulic+vulnerability+is+related+to+conduit+dimensions+and+drought+resistance+across+a+diverse+range+of+woody+angiosperms.">Leaf hydraulic vulnerability is related to conduit dimensions and drought resistance across a diverse range of woody angiosperms.</a> New Phytol. 188, 1113-1123 (2010).</li><li>Nardini, A., Salleo, S., Raimondo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+leaf+hydraulic+conductance+correlate+with+leaf+vein+embolism+in+Cercis+siliquastrum+L.">Changes in leaf hydraulic conductance correlate with leaf vein embolism in Cercis siliquastrum L.</a> Trees-- Structure and Function. 17, 529-534 (2003).</li><li>Trifilo, P., Nardini, A., Lo Gullo, H. A., Salleo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vein+cavitation+and+stomatal+behaviour+of+sunflower+(Helianthus+annuus)+leaves+under+water+limitation.">Vein cavitation and stomatal behaviour of sunflower (Helianthus annuus) leaves under water limitation.</a> Physiol. Plant. 119, 409-417 (2003).</li><li>Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundle-sheath+cell+regulation+of+xylem-mesophyll+water+transport+via+aquaporins+under+drought+stress:+a+target+of+xylem-borne+ABA.">Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA.</a> Plant J. 67, 72-80 (2011).</li><li>Engelbrecht, B. M. J., Velez, V., Tyree, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+conductance+of+two+co-occuring+neotropical+understory+shrubs+with+different+habitat+preferences.">Hydraulic conductance of two co-occuring neotropical understory shrubs with different habitat preferences.</a> Ann. For. Sci. 57, 201-208 (2000).</li><li>Sheffield, J., Wood, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projected+changes+in+drought+occurrence+under+future+global+warming+from+multi-model+multi-scenario,+IPCC+AR4+simulations.">Projected changes in drought occurrence under future global warming from multi-model multi-scenario, IPCC AR4 simulations.</a> Climate Dynamics. 31, 79-105 (2008).</li><li>Blackman, C. J., Brodribb, T. J., Jordan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+hydraulic+vulnerability+influences+species'+bioclimatic+limits+in+a+diverse+group+of+woody+angiosperms.">Leaf hydraulic vulnerability influences species' bioclimatic limits in a diverse group of woody angiosperms.</a> Oecologia. 168, 1-10 (2012).</li><li>Scoffoni, C., McKown, A. D., Rawls, M., Sack, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+leaf+hydraulic+conductance+with+water+status:+quantification+and+analysis+of+species+differences+under+steady-state.">Dynamics of leaf hydraulic conductance with water status: quantification and analysis of species differences under steady-state.</a> J. Exp. Bot. 63, 643-658 (2012).</li><li>Sack, L., Melcher, P. J., Zwieniecki, M. A., Holbrook, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hydraulic+conductance+of+the+angiosperm+leaf+lamina:+a+comparison+of+three+measurement+methods.">The hydraulic conductance of the angiosperm leaf lamina: a comparison of three measurement methods.</a> J. Exp. Bot. 53, 2177-2184 (2002).</li><li>Guyot, G., Scoffoni, C., Sack, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+impacts+of+irradiance+and+dehydration+on+leaf+hydraulic+conductance:+insights+into+vulnerability+and+stomatal+control.">Combined impacts of irradiance and dehydration on leaf hydraulic conductance: insights into vulnerability and stomatal control.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 35, 857-871 (2012).</li><li>Scoffoni, C., Pou, A., Aasamaa, K., Sack, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+light+response+of+leaf+hydraulic+conductance:+new+evidence+from+two+experimental+methods.">The rapid light response of leaf hydraulic conductance: new evidence from two experimental methods.</a> Plant Cell Environ. 31, 1803-1812 (2008).</li><li>Pasquet-Kok, J., Creese, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+over+a+new+"leaf":+multiple+functional+significances+of+leaves+versus+phyllodes+in+Hawaiian+Acacia+koa.">Turning over a new "leaf": multiple functional significances of leaves versus phyllodes in Hawaiian Acacia koa.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 33, 2084-2100 (2010).</li><li>Weast, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Chemistry and Physics. , (1974).</li><li>Yang, S. D., Tyree, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+resistance+in+Acer+saccharum+shoots+and+its+influence+on+leaf+water+potential+and+transpiration.">Hydraulic resistance in Acer saccharum shoots and its influence on leaf water potential and transpiration.</a> Tree Physiol. 12, 231-242 (1993).</li><li>Pearcy, R. W., Schulze, E. -. D., Zimmermann, R., Pearcy, R. W., Ehleringer, J. R., Mooney, H. A., Rundel, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Physiological Ecology: Field Methods and Instrumentation. , 137-160 (2000).</li><li>Buck, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+equations+for+computing+vapor-pressure+and+enhancement+factor.">New equations for computing vapor-pressure and enhancement factor.</a> Journal of Applied Meteorology. 20, 1527-1532 (1981).</li><li>Sokal, R. R., Rohlf, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biometry. , (1995).</li><li>Scoffoni, C., Rawls, M., McKown, A., Cochard, H., Sack, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decline+of+leaf+hydraulic+conductance+with+dehydration:+relationship+to+leaf+size+and+venation+architecture.">Decline of leaf hydraulic conductance with dehydration: relationship to leaf size and venation architecture.</a> Plant Physiol. 156, 832-843 (2011).</li><li>Sack, L., Tyree, M. T., Holbrook, N. M., Zweiniecki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vascular Transport in Plants. , (2005).</li><li>Nardini, A., Tyree, M. T., Salleo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylem+cavitation+in+the+leaf+of+Prunus+laurocerasus+and+its+impact+on+leaf+hydraulics.">Xylem cavitation in the leaf of Prunus laurocerasus and its impact on leaf hydraulics.</a> Plant Physiol. 125, 1700-1709 (2001).</li><li>Brodribb, T. J., Holbrook, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+closure+during+leaf+dehydration,+correlation+with+other+leaf+physiological+traits.">Stomatal closure during leaf dehydration, correlation with other leaf physiological traits.</a> Plant Physiol. 132, 2166-2173 (2003).</li><li>Blackman, C. J., Brodribb, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+measures+of+leaf+capacitance:+insights+into+the+water+transport+pathway+and+hydraulic+conductance+in+leaves.">Two measures of leaf capacitance: insights into the water transport pathway and hydraulic conductance in leaves.</a> Funct. Plant Biol. 38, 118-126 (2011).</li><li>Nardini, A., Raimondo, F., Lo Gullo, M. A., Salleo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leafminers+help+us+understand+leaf+hydraulic+design.">Leafminers help us understand leaf hydraulic design.</a> Plant Cell Environ. 33, 1091-1100 (2010).</li><li>Sheriff, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation+sites+and+distillation+in+leaves.">Evaporation sites and distillation in leaves.</a> Ann. Bot. 41, 1081-1082 (1977).</li><li>Canny, M. J., Huang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leaf+water+content+and+palisade+cell+size.">Leaf water content and palisade cell size.</a> New Phytol. 170, 75-85 (2006).</li><li>Santiago, L. S., Mulkey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+test+of+gas+exchange+measurements+on+excised+canopy+branches+of+ten+tropical+tree+species.">A test of gas exchange measurements on excised canopy branches of ten tropical tree species.</a> Photosynthetica. 41, 343-347 (2003).</li><li>Sack, L., Cowan, P. D., Jaikumar, N., Holbrook, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'hydrology'+of+leaves:+co-ordination+of+structure+and+function+in+temperate+woody+species.">The 'hydrology' of leaves: co-ordination of structure and function in temperate woody species.</a> Plant Cell Environ. 26, 1343-1356 (2003).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de flujo evaporativo aquí se presenta permite relativamente rápida (30 min) la determinación de la conductancia de la hoja hidráulico en el laboratorio con la medición simultánea de la conductancia estomática. El EFM es hasta ahora el método que más fielmente sigue el camino natural del agua en las hojas, ya que el agua se evapora en los espacios aéreos de hoja y se difunde desde los estomas 15. Un número de otros métodos experimentales para la determinación de la hoja existen K 25, con tres siendo especialmente común. (1) En el método de presión de alto flujo (HPFM), el agua es empujada a través de la hoja a alta presión 15,26. Sin embargo, las curvas de vulnerabilidad no se puede obtener con este método porque se aplican presiones positivas puede rellenar émbolos y rehidratar tejido mesófilo. (2) En el método de rehidratación cinética (RKM), K hoja se calcula usando la analogía entre la rehidratación de las hojas deshidratadas con el charging de un condensador en serie con un 27,28 resistencias. Este método es rápido, pero no reproduce en todo el sistema de vías naturales por transpiración en la hoja y no se puede modificar fácilmente para permitir la medición de las hojas aclimatadas a alta irradiación. (3) En el método de la bomba de vacío (VPM) de la hoja se coloca en una cámara, su peciolo conectado a una fuente de agua en el equilibrio, mientras que los vacíos de diferentes intensidades se aplican a la pérdida de agua de la hoja de conducción de la hoja 15,26. Este método puede consumir mucho tiempo. Mediciones usando los tres métodos se han encontrado para dar resultados consistentes 15,28,29, y por lo tanto la EFM se utiliza con frecuencia dado que se basa en su movimiento de agua por transpiración, y su relativa rapidez, y su modificación para medir hoja K en diferentes condiciones. Todos los métodos típicos utilizados para la determinación de hoja K implicar un nivel de incertidumbre en la cuantificación de accurately el motor correspondiente a la transpiración 25. En el EFM, la hoja ΔΨ utiliza para calcular hoja K es menor que la verdadera fuerza motriz, ya que se basa en el grueso hoja Ψ después de la hoja se equilibra para la bomba de presión. En este punto, la mayor parte de hoja Ψ no representa necesariamente el potencial de agua de las células al final de la vía hidráulica, donde el agua se evapora, sino más bien un promedio ponderado por volumen de las relativamente pocas células de potencial bajo de agua donde el agua es el movimiento y la evaporación, y para las células más numerosas de alto potencial hídrico que pueden ser aislados de la corriente de transpiración. ¿Cuánto de la hoja Ψ difiere del verdadero motor depende, pues, del lugar donde el agua se evapora en la hoja. Si el agua se evapora a través de la hoja, el grueso hoja Ψ puede estar cerca de la verdadera fuerza motriz, y si el agua se evapora sólo de c relativamente pocosells cerca de los estomas, la hoja de la mayor parte Ψ sustancialmente puede subestimar la verdadera fuerza motriz, es decir, el potencial hídrico de las células puede ser en realidad mucho menor, y por lo tanto la hoja K real sería inferior al determinado con el EFM. Así, el grado que la hoja de K determinado por el EFM representa la hoja verdadera K es sensible a las vías de flujo de agua, que todavía no son bien comprendidas. Mientras que el EFM proporciona los datos que coinciden con los de otros métodos de medición K hoja (véase más arriba), y es excelente para uso comparativo, la posibilidad de variación de especie en las vías de flujo de agua a través del mesófilo necesita más investigación. En efecto, incluso para las hojas de las especies dadas, estas vías de agua puede variar bajo diferentes condiciones, por ejemplo, bajo distintas irradiancias y 4,30 cargas de calor o del estado del agua diferente (dada la contracción del tejido) 31. Conocimiento másde las vías de transporte de agua por lo tanto permitiría que el EFM que se utiliza para resolver los efectos de las vías cambiante sobre el transporte hidráulico hoja general. La medición de la conductancia estomática en el EFM tiene las ventajas de permitir la determinación de las respuestas a la irradiancia y la deshidratación, y proporcionar respuestas emparejados g de s con la hoja K. Además, el efecto de la deshidratación hoja anterior seguido de rehidratación en g s se puede evaluar con este método. Sin embargo, este método tiene dos inconvenientes potenciales. En primer lugar, la medición de este g s se realiza sobre una hoja extirpada, más que en una planta intacta, y segundo, la determinación de la conductancia estomática se basa en la medición del clima a cierta distancia de la hoja, en lugar de cerca de la hoja como en una cámara de porómetro , aunque la ventilación de la hoja con el ventilador se equilibra la superficie de la hoja con el aire circundante. Para algunas especies, extirpadoslas hojas pueden mostrar diferentes respuestas de los estomas de las hojas en que una planta intacta 16,32. Sin embargo, para varias especies g s estimó utilizando el EFM fue similar a los valores medidos en plantas intactas con un porómetro para hojas a mediados de día Ψ hoja 16 (Fig. 2). El EFM se puede aplicar para una visión fisiológica, es decir, la investigación de la dinámica de K hoja, su base en la estructura y la anatomía, y sus respuestas a los factores ambientales. Además, el método puede ser utilizado para comparar las plantas de especies dadas cultivadas en condiciones diferentes, o de diferentes edades, o para comparar las plantas de especies diferentes adaptadas a diferentes ambientes. Mediante la construcción de curvas de hoja de vulnerabilidad, se puede obtener información sobre los mecanismos de tolerancia a la sequía especies. Durante la sequía, la cavitación y colapso celular han demostrado que se producen en el xilema hoja de algunos<html> especies, y la contracción de células en el mesófilo durante la deshidratación también podría afectar el movimiento del agua (revisado en 14). Futuros estudios serán necesarios para determinar la importancia relativa de cada uno de estos procesos en la conducción de la disminución de K hoja y cierre de los estomas. La irradiación es también un factor de fuerte influencia K foliar y el EFM es muy adecuado para las mediciones con alta irradiación. La respuesta combinada de las acuaporinas a la irradiación y de la sequía debe tener mucho interés. Irradiancia alta conduce a una mayor expresión y / o activación de las acuaporinas que permiten el flujo de agua más rápido a través de las células vivas, el aumento de hoja K, mientras que conduce a la reducción de expresión de deshidratación y / o de-activatation de las acuaporinas, reduciendo hoja K. Los efectos combinados de la radiación y el suministro de agua en la hoja K requieren investigación adicional 4,10,16,33. tienda de campaña &quot;&gt; Además, en todas estas especies, K foliar y su vulnerabilidad ha sido relacionado con la distribución de especies con respecto al suministro de agua luz y otros recursos 3,13,24. Las especies de zonas secas tienden a mostrar una mayor resistencia al deterioro hidráulico, frente a potenciales más negativos del agua del suelo, y por el mantenimiento de una hoja K alto a potenciales más negativos del agua, pueden mantener una alta s g y continuar la captura de CO 2 para la fotosíntesis 13,14. Así, el estudio de la hoja de propiedades hidráulicas proporciona información detallada a nivel de celda, hoja, y toda planta y sus respuestas al medio ambiente, y es probable que el rendimiento numerosos nuevos descubrimientos importantes en todas las escalas.

measurement of leaf hydraulic conductance and stomatal conductance and their responses to irradiance and dehydration using the evaporative flux method (efm)

El agua es un recurso clave, y el agua de la planta sistema de transporte establece límites en el máximo crecimiento y tolerancia a la sequía. Cuando las plantas abren sus estomas para lograr una alta conductancia estomática (g s) para capturar CO 2 para la fotosíntesis, el agua se pierde por 1,2 transpiración. El agua que se evapora de los espacios aéreos se sustituye a partir de las paredes celulares, a su vez, sacar agua del xilema de las venas de las hojas, en el dibujo a su vez de xilema en los tallos y raíces. Como el agua es eliminada a través del sistema, experimenta una resistencia hidráulica, creando tensión en todo el sistema y un potencial hídrico de las hojas bajo (Ψ hoja). La propia hoja es un cuello de botella crítico en el sistema de toda la planta, lo que representa una media del 30% de la resistencia de la planta hidráulica 3. Conductancia de la hoja hidráulica (K = resistencia hoja 1 / hoja hidráulica) es la relación de la tasa de flujo de agua con el gradiente de potencial del agua a través de la hoja, y se resume lacomportamiento de un sistema complejo:. agua se mueve por el pecíolo y a través de varios órdenes de venas, sale a la vaina del haz y pasa a través o alrededor de las células del mesófilo antes de evaporarse en el espacio aéreo y se desprendía del estomas de la hoja K es de gran interés como una rasgo fisiológico importante para comparar las especies, la cuantificación de la efectividad de la estructura de la hoja y la fisiología para el transporte de agua, y una variable clave a investigar por su relación con la variación en la estructura (por ejemplo, en la arquitectura venación foliar) y sus impactos sobre el intercambio gaseoso fotosintético. Además, K hoja responde fuertemente a la hoja entorno interno y externo 3. Hoja K puede aumentar dramáticamente con la irradiancia aparentemente debido a cambios en la expresión y la activación de las acuaporinas, las proteínas implicadas en el transporte de agua a través de membranas 4, y la hoja de K disminuye fuertemente durante drdebe, debido a la cavitación y / o el colapso de los conductos del xilema, y / o pérdida de la permeabilidad en los tejidos extra-xilema debido a mesófilo y la vaina del haz encogimiento de la célula o la desactivación acuaporina 5-10. Debido K hoja puede limitar g s y la tasa fotosintética en las especies en condiciones bien regado y durante la sequía, y por lo tanto limitar el rendimiento de toda la planta, posiblemente, puede determinar la distribución de especies, especialmente las sequías aumentarán en frecuencia y severidad 11-14. Se presenta un método simple para la determinación simultánea de K hoja y s g de hojas cortadas. Una hoja transpirante está conectada por su pecíolo a un tubo de corriente a una fuente de agua en una balanza. La pérdida de agua de la balanza se registró para calcular la velocidad de flujo a través de la hoja. Cuando la transpiración estado de equilibrio (E, mmol m -2 • • s -1) se alcanza, g <sub&gt; S se determina dividiendo por déficit de presión de vapor, y la hoja de K dividiendo por la fuerza del agua conducción potencial determinó utilizando una cámara de presión (K = hoja E / - Δψ hoja, MPa) 15. Este método se puede utilizar para evaluar las respuestas de K foliar a distintas irradiancias y la vulnerabilidad de la hoja de K a la deshidratación 14,16,17.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM at 

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

Se describe un método relativamente rápido (30 min) y al mismo tiempo realista para la medición de la conductancia hidráulica de hoja (<em&gt; K</em<sub&gt; Hoja</sub&gt;) Y la conductancia estomática (<em&gt; G</em<sub&gt; S</sub&gt;) Para transpirantes hojas cortadas. El método puede ser modificado para medir las respuestas de luz y de deshidratación<em&gt; K</em<sub&gt; Hoja</sub&gt; Y<em&gt; G</em<sub&gt; S</sub&gt;.

Medición de conductancia de la hoja hidráulica y la conductancia estomática y sus respuestas a la irradiación y la deshidratación mediante el método de evaporación Flux (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

measurement-leaf-hydraulic-conductance-stomatal-conductance-their

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

36.9K vistas.  University of California, Los Angeles. Se describe un método relativamente rápido (30 min) y al mismo tiempo realista para la medición de la conductancia hidráulica de hoja ( K

Video: Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in cellular and mammalian models. Here, we describe detailed methods to perform stable isotopic profiling of intermediary metabolism and metabolic flux in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are described for profiling whole worm free amino acids, labeled carbon dioxide, labeled organic acids, and labeled amino acids in animals exposed to stable isotopes either from early development on nematode growth media agar plates or beginning as young adults while exposed to various pharmacologic treatments in liquid culture. Free amino acids are quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) in whole worm aliquots extracted in 4% perchloric acid. Universally labeled 13C-glucose or 1,6-13C2-glucose is utilized as the stable isotopic precursor whose labeled carbon is traced by mass spectrometry in carbon dioxide (both atmospheric and dissolved) as well as in metabolites indicative of flux through glycolysis, pyruvate metabolism, and the tricarboxylic acid cycle. Representative results are included to demonstrate effects of isotope exposure time, various bacterial clearing protocols, and alternative worm disruption methods in wild-type nematodes, as well as the relative extent of isotopic incorporation in mitochondrial complex III mutant worms (isp-1(qm150)) relative to wild-type worms. Application of stable isotopic profiling in living nematodes provides a novel capacity to investigate at the whole animal level real-time metabolic alterations that are caused by individual genetic disorders and/or pharmacologic therapies.

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling by gas chromatography mass spectrometric analysis of intermediary metabolic flux is described in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are detailed for assessing isotopic enrichment in carbon dioxide, organic acids, and amino acids following isotope exposure either during development on agar plates or during adulthood in liquid culture.

Perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de Adultos Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Investigación

Biología

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

La purificación de la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana de proteínas expresadas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Un método estandarizado para el análisis de las células del hígado sinusoidal endoteliales y sus Fenestraciones por Microscopía Electrónica de Barrido

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, morphological leaf traits have the potential to summarize plants strategies in terms of water use efficiency, growth pattern and nutrient use. The leaf economics spectrum (LES) is a recognized framework in functional plant ecology and reflects a gradient of increasing specific leaf area (SLA), leaf nitrogen, phosphorus and cation content, and decreasing leaf dry matter content (LDMC) and carbon nitrogen ratio (CN). The LES describes different strategies ranging from that of short-lived leaves with high photosynthetic capacity per leaf mass to long-lived leaves with low mass-based carbon assimilation rates. However, traits that are not included in the LES might provide additional information on the species&#39; physiology, such as those related to stomatal control. Protocols are presented for a wide range of leaf functional traits, including traits of the LES, but also traits that are independent of the LES. In particular, a new method is introduced that relates the plants&#8217; regulatory behavior in stomatal conductance to vapor pressure deficit. The resulting parameters of stomatal regulation can then be compared to the LES and other plant functional traits. The results show that functional leaf traits of the LES were also valid predictors for the parameters of stomatal regulation. For example, leaf carbon concentration was positively related to the vapor pressure deficit (vpd) at the point of inflection and the maximum of the conductance-vpd curve. However, traits that are not included in the LES added information in explaining parameters of stomatal control: the vpd at the point of inflection of the conductance-vpd curve was lower for species with higher stomatal density and higher stomatal index. Overall, stomata and vein traits were more powerful predictors for explaining stomatal regulation than traits used in the LES.

Unraveling how physiology and morphology are linked allows a deeper understanding of mechanistic functioning of plant leaves. We present both a procedure to derive parameters of stomatal regulation from stomatal conductance measurements and correlations with traditional functional leaf traits.

Relacionar estomática conductancia de la hoja Rasgos funcionales

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular systolic and diastolic function. Measures of ventricular contractility and compliance are obtained through examination of cardiac response to changes in afterload and preload. These techniques were originally developed nearly three decades ago to measure cardiac function in large mammals and humans. The application of these analyses to small mammals, such as mice, has been accomplished through the optimization of microsurgical techniques and creation of conductance catheters. Conductance catheters allow for estimation of the blood pool by exploiting the relationship between electrical conductance and volume. When properly performed, these techniques allow for testing of cardiac function in genetic mutant mouse models or in drug treatment studies. The accuracy and precision of these studies are dependent on careful attention to the calibration of instruments, systematic conduct of hemodynamic measurements and data analyses. We will review the methods of conducting pressure-volume loop experiments using a conductance catheter in mice.

Cardiac pressure-volume loop analysis is the most comprehensive way to measure cardiac function in the intact heart. We describe a technique to perform and analyze cardiac pressure volume loops, using conductance catheters.

Cardiaca Presión-Volumen Análisis Loop Utilizando conductancia catéteres en ratones

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Simple y eficaz administración y visualización de micropartículas en el sistema circulatorio de peces pequeños con inyección de riñón

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their recruited proteins, lead to temporal and spatial control of gene expression. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&#38;Tag) is an enzyme-tethering method in which the specific chromatin protein is firstly recognized by its specific antibody, and then the antibody tethers a protein A-transposase (pA-Tn5) fusion protein, which cleaves the targeted chromatin in situ by the activation of magnesium ions. Here, we provide our previously published CUT&#38;Tag protocol using intact nuclei isolated from allortetraploid cotton leaves with modification. This step-by-step protocol can be used for epigenomic research in plants. In addition, substantial modifications for plant nuclei isolation are provided with critical comments.

Cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag) is an efficient chromatin epigenomic profiling strategy. This protocol presents a refined CUT&amp;Tag strategy for the profiling of histone modifications in plants.

Elaboración de perfiles de modificación de H3K4me3 en plantas utilizando escisión bajo objetivos y etiquetado

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...