Siamo grati a quattro revisori anonimi per migliorare il manoscritto, e la National Science Foundation (Grant IOS-0546784) per il supporto.

1. Foglia di misurazione della conduttanza idraulica per Leaves idrate (K max) <ol><li> Raccogliere spara preferibilmente la sera o di notte in modo tale che le tensioni xilema sono basse, tagliate in aria e il luogo nel buio sacchetto di plastica pieno con tovaglioli di carta bagnati. In laboratorio, ripassare almeno due nodi dalla fine di ogni ripresa sott&#39;acqua. Lasciate sparare reidratarsi durante la notte in acqua pura, o altra soluzione da utilizzare per le misure foglia K. Acqua ultrapura è raccomandato come una soluzione di flusso a meno che gli impatti delle diverse soluzioni devono essere indagato come un fattore. </li><li> Tagliare la foglia dal germoglio con una lametta nuova soluzione sotto flusso parzialmente degasato. Acqua ultrapura è raccomandato come una soluzione di flusso a meno che gli impatti delle diverse soluzioni devono essere indagato come un fattore. Si consiglia degasaggio della soluzione durante la notte in un pallone con una pompa a vuoto, ma altri metodi possono essere impiegati. </li><li> Wrap pre-stirato parafilm tutto il Petiole per garantire una buona tenuta tra il picciolo e il tubo. Questo passaggio è particolarmente utile per i non-rotonde piccioli, come da imballaggio parafilm in più aiuterà intorno al picciolo per adattarsi all&#39;interno del tubo. Pasta dentale può essere applicato al picciolo prima di avvolgere il parafilm per riempire scanalature piccioli. </li><li> Collegare la foglia di tubo in silicone sotto l&#39;acqua ultrapura per evitare che l&#39;aria che entra nel sistema. Come la foglia viene sollevata sopra la fonte di acqua, l&#39;acqua nel tubo è sotto pressione subatmosferica, e quindi la tenuta è buona se non viene aspirata aria nel tubo durante la misurazione. In alternativa alla sigillatura del picciolo direttamente nel tubo di silicone, un raccordo a compressione con guarnizione in gomma può essere utilizzata (ad esempio, (Omnifit A2227 adattatore foro; Omnifit, Cambridge, UK), questo approccio è utile per i piccioli con forme particolarmente complesse o per fili d&#39;erba , che può essere avvolto intorno a una bacchetta di vetro e sigillato con il raccordo a compressione. Quando possibile, sigillando il picciolo direttamente in SItubo licone ha il vantaggio di essere rapida e lasciando un picciolo-tubo di giunzione che è trasparente, permettendo bolle di essere più facilmente visibile. Il tubo si collega la foglia di tubo rigido in esecuzione di un cilindro graduato su una bilancia (± 10 mcg risoluzione), che registra i dati ogni 30 secondi a un computer (ad esempio, l&#39;utilizzo di &quot;Balance Link&quot; Software, Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Svizzera) per il calcolo della portata attraverso la foglia. </li><li> Le foglie dovrebbe essere tenuto verso l&#39;alto di superficie adaxial in telai di legno legati con filo da pesca sopra un ventilatore grande scatola e sotto una fonte di luce (&gt; 1.000 mmol m • 2 • s -1 radiazione fotosinteticamente attiva per l&#39;alta irradianza misure), leggermente al di sopra del livello di il menisco nel cilindro graduato. La foglia deve essere collocato sopra l&#39;acqua nel cilindro graduato per garantire che l&#39;acqua di passare alla foglia è guidato dalla traspirazione, e non entrando la foglia sotto pressione a causa della gravità, come sarebbeil caso se la foglia sono stati posti sotto del menisco dell&#39;acqua nel cilindro. Piccoli recipienti riempiti con un tovagliolo di carta umido sono posizionati all&#39;interno della camera di equilibrio per assicurare l&#39;aria in equilibrio è saturo d&#39;acqua, evitando così l&#39;evaporazione dalla fonte di acqua all&#39;atmosfera in equilibrio. Questa possibilità può essere controllato da arrestare il flusso nella foglia utilizzando una valvola a quattro vie rubinetto nel tubo, e verificando che la massa del cilindro acqua sulla bilancia non si riduca. </li><li> Posizionare un contenitore trasparente Pyrex riempito di acqua sopra la foglia di assorbire il calore della lampada. </li><li> Mantenere la temperatura della foglia tra 23 ° C e 28 ° C per tutto l&#39;esperimento con l&#39;aggiunta di acqua più fredda al contenitore Pyrex tale che la lampada di calore non riscalda il contenitore Pyrex sufficiente a riscaldare l&#39;aria intorno alla foglia di seguito. </li><li> Consentono la foglia di traspirare sull&#39;apparato per almeno 30 min, dando così tempo sufficiente per acclimatarsi irradianza alta, e additionally fino portata è stabilizzata, con nessuna tendenza verso l&#39;alto o verso il basso, e con un coefficiente di variazione &lt;5% per almeno 5-10 misurazioni effettuate a intervalli di 30 sec di flusso. E &#39;essenziale per il flusso a raggiungere uno stato stazionario perché questo metodo presuppone una foglia stabile Ψ. Studi precedenti trovato questi criteri sufficienti per la stabilizzazione della portata (E), Ψ foglia e foglia K; test con periodi di misurazione più lunghi dopo che il flusso stabile è stato istituito non ha mostrato alcun rapporto di foglia K per tempo di misura per ciascuna delle sette specie di un ampio gamma di capacità foglia 17,18. Stabilizzazione richiede generalmente 30 minuti o meno, ma in alcune specie può richiedere più di un&#39;ora per alcune specie. </li></ol> Nota: Se la portata è molto bassa (&lt;8 mg s -1), la stabilità può essere determinata usando la media corrente degli ultimi cinque intervalli di 30 sec. </p&gt; <ol start="9"><li> Eliminare le misurazioni se il flusso cambia improvvisamente, sia a causa di improvvisa chiusura degli stomi, o perdite evidenti dalla tenuta o il blocco del sistema di particelle o bolle d&#39;aria. </li><li> Quando il flusso si stabilizza, registrare la temperatura della foglia con una termocoppia. </li><li> Rimuovere rapidamente la foglia dal tubo, tamponare asciugare il picciolo e l&#39;anta in un sacchetto sigillato che era stato precedentemente esalata in, per fermare la traspirazione. </li><li> Lasciate che la foglia equilibrare nella sua confezione per almeno 20 min. </li><li> Nella media degli ultimi 10 misure di portata. Questa sarà la vostra misura e. </li><li> Quando la foglia è equilibrato, misurare la finale potenziale idrico fogliare (Ψ finale) con una camera a pressione. </li><li> Misura della superficie fogliare con uno scanner piano e un software di elaborazione di immagini, o con un misuratore di area fogliare. </li><li> K foglia è calcolato come E /-ΔΨ foglia (dove ΔΨ foglia = Ψ finale </sub&gt; - 0 MPa) e ulteriormente normalizzato dalla superficie fogliare. Le unità sono in mmol m-2 s-1 MPa -1. Perché la foglia è posizionata appena sopra il livello dell&#39;acqua nel cilindro graduato, l&#39;effetto della gravità nel ridurre la pressione dell&#39;acqua in ingresso foglia sarebbe trascurabile, in particolare rispetto alla finale Ψ, che è sempre&gt; -0,1 MPa. </li><li> Per correggere variazioni indotte da K foglia dipendenza dalla temperatura della viscosità dell&#39;acqua 15,19,20, standardizzare valori foglia K a 25 ° C utilizzando la seguente equazione: </li></ol><img alt="Equazione 1" fo:content-width="3.863in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq1.jpg" /><ol start="18"><li> Conduttanza stomatica (g s) può essere determinato come E divisa per la foglia-aria differenza di pressione di vapore, equivalente alla pressio vaporere deficit (VPD), determinato mediante un sensore di temperatura e umidità relativa adiacente alla foglia. VPD è calcolato utilizzando la seguente equazione 21 </li></ol><img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq2.jpg" fo:content-width="1.67in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq2highres.jpg" /> dove RH è l&#39;umidità relativa, VP è la pressione di vapore di saturazione dell&#39;aria (in kPa, in funzione della temperatura, secondo l&#39;equazione Arden Buck 22), AP e la pressione atmosferica (in kPa). 2. Di misura della conduttanza idraulica Foglia per foglie disidratate <ol><li> Raccogliere spara preferibilmente la sera o di notte in modo tale che le tensioni xilema sono basse, tagliate in aria e posto in sacchetti di plastica scuri pieni di asciugamani di carta bagnati. In laboratorio, ripassare almeno due nodi dalla fine di ogni ripresa sott&#39;acqua. Lasciate sparare reidratarsi durante la notte in acqua pura, o altra soluzione da utilizzare per le Kaf misurazioni. Acqua ultrapura è raccomandato come una soluzione di flusso a meno che gli impatti delle diverse soluzioni devono essere indagato come un fattore. </li><li> Tagliare spara in segmenti con almeno tre foglie sotto l&#39;acqua ultrapura e disidratare spara con una ventola per diversi periodi di tempo ad una serie di valori foglia Ψ. </li><li> Una volta germogli sono disidratati, collocare sacchetti sigillabili (Whirl-Pak, Nasco, Fort Atkinson, WI, USA), che sono stati precedentemente in esalato) intorno a ogni foglia del germoglio, e quindi posizionare le riprese tutto in un grande sacchetto sigillabile con carta bagnata asciugamano. </li><li> Lasciate che le riprese equilibrare per almeno 30 min (per servizi fortemente disidratati tempi di equilibrazione più lunghi possono essere necessari). </li><li> Dopo equilibrazione, asportare il foglio superiore e inferiore e la prima misura Ψ foglia (Ψ = o) utilizzando una camera di pressione. </li><li> Scartare il germoglio se la differenza nella foglia Ψ di questi due foglie è maggiore di 0,1 MPa (per strongly foglie disidratate, questo intervallo può essere esteso a 0,3 MPa). </li><li> Terza foglia viene poi utilizzato per determinare K foglia e g s con l&#39;EFM, seguendo i passi 1,2 -1,18 sopra. In particolare, e stato stazionario può essere ottenuta anche per le foglie che sono state foglie disidratati, come stomi ancora aperti e generare g s valori sostanzialmente superiori a conduttanza cuticolare 17. </li><li> Per costruire curve di vulnerabilità idraulici, calcolare foglia K utilizzando la finale Ψ come nel passaggio 1,16, e quindi trama valori foglia K contro seconda del valore più basso, o Ψ Ψ o finale, cioè, il più forte disidratazione sperimentato dal foglio durante l&#39;esperimento (= Ψ più basso). Analogamente, il declino g s in risposta alla disidratazione foglia può essere determinato tracciando g s contro basso Ψ. Il lavoro precedente ha sh<html> proprio che la disidratazione induce almeno calo parzialmente irreversibili K foglia e 14,16 g s. </li><li> Si consiglia di ottenere almeno 6 valori K foglia per intervalli di 0,5 MPa di Ψ più bassa (questo intervallo può essere ridotto a 0,25 MPa se la specie si sta lavorando è molto vulnerabile alla disidratazione). </li><li> Eseguire test di Dixon outlier su valori foglia K per ogni intervallo di 0,5 MPa acqua più basso potenziale di Ψ per eliminare valori anomali dalla curva di vulnerabilità 23. </li><li> Dato che le specie si differenziano per le loro risposte di K foglie e g s alla disidratazione 14,16, adatto diverse funzioni per ogni specie e selezionare la massima verosimiglianza (AIC più basso valore, vedi 14 per i dettagli). Si consiglia di montare almeno quattro funzioni precedentemente utilizzati in letteratura: lineare (pg &quot;fo: content-width =&quot; 1.4in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/4179/4179eq3highres.jpg &quot;/&gt;), sigmoidale ( <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq4.jpg" fo:content-width="1.483in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq4highres.jpg"/> ), Logistica ( <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq5.jpg" fo:content-width="1.7in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq5highres.jpg"/> ) Ed esponenziale ( <img alt="Equazione 6" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq6.jpg" fo:content-width="1.583in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq6highres.jpg"/> ). </li></ol> 3. Risultati rappresentativi Il declino della foglia di conduttanza idraulica con disidratazione varia fortemente tra le specie (Fig. 1). Siccità specie sensibili registrare un calo più forte a potenziali idrici meno negativi rispetto alle specie più tolleranti alla siccità, se misurati in irradiance alta (PAR&gt; 1.000 mmol m-2 • • s-1). L&#39;acquapotenziale perdita a 80% della conducibilità idraulica (P 80) per mesico erbe Helianthus annuus era 3 MPa meno negativo di quello di Heteromeles arbutifolia, nativa della California chaparral. Heteromeles arbutifolia risposto linearmente al declino potenziale idrico, mentre Helianthus annuus ha mostrato una non lineare declino. Sia la conduttanza stomatica (g s) e foglia conduttanza idraulica (K foglie) può anche rispondere drammaticamente all&#39;irradianza (Fig. 2). Per Raphiolepis indica, la conduttanza stomatica è diminuita fortemente con disidratazione di foglie rilevati alle irradianza alta (PAR&gt; 1.000 mmol m-2 • • s-1), e alla luce di laboratorio (PAR &lt;6 mmol m-2 • • s-1). Sotto irradianza alta, foglie misurata con l&#39;EFM che era stato disidratato al potenziale acqua che è tipico per ben illuminato leaves su piante intere a metà giornata mostrò simile g s come per foglie misurati su piante intere con un porometro (stella in Fig. 2). In particolare, per ante a massima idratazione, K foglia era quattro volte superiore per foglie esposte a elevate rispetto basso irraggiamento (11 vs 2,8 mmol m -2 s -1 MPa -1), e quindi K foglia ha mostrato una risposta forte luce in ben foglie di idrati di g s. Inoltre, sotto irraggiamento alto, K foglia diminuita più fortemente con la disidratazione. Il P 80 è 0,93 MPa meno negativo in alto di basso irraggiamento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4179/4179fig1.jpg" /> Figura 1. Curve di vulnerabilità Leaf idraulici per un periodo di siccità sensibile (in alto) e un tolleranti siccità (in basso) specie (da 14,24). Ogni punto rappresenta un peccatogle misurazione della conduttanza idraulica foglia (K foglia) su una foglia distaccata mediante il metodo di flusso evaporativo (EFM). Le barre verticali rappresentano il potenziale dell&#39;acqua in cui la specie perso l&#39;80% della conduttanza idraulica foglia iniziale (P 80). Migliori funzioni di fit con massima verosimiglianza sono tracciate per entrambe le specie. <img alt="Equazione 7" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq7.jpg" fo:content-width="3.293in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq7highres.jpg"/><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4179/4179fig2.jpg" /> Figura 2. La risposta di conduttanza stomatica (g s) e della conducibilità idraulica foglia (K foglia) al potenziale di foglia declino acqua per Raphiolepis indica misurato in alto vs basso irraggiamento (da 16). (PAR&gt; 1000 e &lt;6 mmol m-2 • • s-1). Ogni punto rappresenta una singola misura su una foglia distaccata mediante il metodo di flusso evaporativo (EFM), con punti bianchi e neri rappresentano foglie misurati sotto irradiazione rispettivamente alto e basso. Equazioni per le curve di conduttanza stomatica in alta irradiazione vs basso: <img alt="Equazione 8" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq8.jpg" fo:content-width="4.727in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq8highres.jpg" /> e <img alt="Equazione 9" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq9.jpg" fo:content-width="2.26in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq9highres.jpg"/> . Equazioni per le curve di vulnerabilità a irraggiamento alto vs basso: <img alt="Equazione 10" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq10.jpg" fo:content-width="2.7in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq10highres.jpg"/> e <img alt="Equazione 11" src="/files/ftp_upload/4179/4179eq11.jpg" fo:content-width="1.8in" fo:src="/files/ftp_upload/4179/4179eq11highres.jpg"/> . Stella grigia nel pannello superiore rappresenta la media ± STAerrore ndard per g s e il potenziale idrico fogliare misurato su foglie di piante intere a metà giornata con un porometro. Grigio e nero barre verticali nel pannello inferiore rappresentano il potenziale dell&#39;acqua in cui le specie perso l&#39;80% della conducibilità idraulica foglia iniziale (P 80) sotto irradiazione di alta e bassa, rispettivamente.

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T., Salleo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylem+cavitation+in+the+leaf+of+Prunus+laurocerasus+and+its+impact+on+leaf+hydraulics.">Xylem cavitation in the leaf of Prunus laurocerasus and its impact on leaf hydraulics.</a> Plant Physiol. 125, 1700-1709 (2001).</li><li>Brodribb, T. J., Holbrook, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+closure+during+leaf+dehydration,+correlation+with+other+leaf+physiological+traits.">Stomatal closure during leaf dehydration, correlation with other leaf physiological traits.</a> Plant Physiol. 132, 2166-2173 (2003).</li><li>Blackman, C. J., Brodribb, T. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo del flusso evaporativo qui presentata consente relativamente rapido (30 min) determinazione della conduttanza idraulica foglia in laboratorio con misurazione simultanea di conduttanza stomale. L&#39;EFM è finora il metodo che più si segue il percorso naturale di acqua nelle foglie, dato che l&#39;acqua evapora negli spazi aerei foglie e diffonde dal stomi 15. Un certo numero di altri metodi sperimentali per la determinazione foglia K esistono 25, con tre sono particolarmente comuni. (1) Nel metodo di flusso ad alta pressione (HPFM), l&#39;acqua viene spinta attraverso la foglia sotto alta pressione 15,26. Tuttavia, curve di vulnerabilità non può essere ottenuto con questo metodo perché applicate pressioni positive venga riempito emboli e reidratare tessuto mesofillo. (2) Nel metodo di reidratazione cinetica (RKM), K foglia viene calcolato utilizzando l&#39;analogia tra la reidratazione di fogli disidratati con la charging di un condensatore in serie ad una resistenza 27,28. Questo metodo è veloce, ma non riprodurre l&#39;intero sistema di traspirazione vie naturali nella foglia e non è facilmente modificato per consentire la misurazione di foglie acclimatati per irraggiamento elevato. (3) Nel metodo pompa a vuoto (VPM) la foglia viene posto in una camera, il suo picciuolo collegato ad una fonte di acqua su una bilancia, mentre vuoti di diversa intensità vengono applicati alla perdita di acqua di guida foglia dalla foglia 15,26. Questo metodo può richiedere molto tempo. Misurazioni con tutti e tre i metodi sono stati trovati per dare risultati coerenti 15,28,29, e quindi la EFM viene frequentemente usato dato perché si basa sul movimento acqua per traspirazione, e la sua relativa rapidità e la sua modifica per misurare foglia K in diverse condizioni. Tutti i metodi tipicamente utilizzati per determinare foglia K comportano un livello di incertezza nella quantificazione accurately la forza motrice corrispondente alla traspirazione 25. Nel EFM, la foglia ΔΨ utilizzato per calcolare foglia K è inferiore al vero motore, in quanto si basa sulla foglia bulk Ψ dopo la foglia è equilibrata per la bomba pressione. A questo punto, la foglia bulk Ψ non rappresenta necessariamente il potenziale dell&#39;acqua delle cellule alla fine del percorso idraulico, in cui l&#39;acqua evapora, ma piuttosto un volume media ponderata per le cellule relativamente pochi potenziale acqua bassa dove l&#39;acqua è movimento e evaporazione, e per le cellule più numerose potenziale dell&#39;acqua alta che può essere isolato dal flusso di traspirazione. Quanto la foglia Ψ è diverso dal vero motore dipende quindi dove l&#39;acqua sta evaporando nella foglia. Se l&#39;acqua evapora tutta la foglia, la foglia di massa Ψ può essere vicino al vero motore, e se l&#39;acqua evapora solo da relativamente pochi cells vicino gli stomi, la foglia bulk Ψ può sostanzialmente sottostimare la vera forza di guida, cioè, il potenziale dell&#39;acqua di tali cellule può essere molto più bassa, e quindi foglia K effettiva sarebbe inferiore a quello determinato con l&#39;EFM. Così, il grado di foglia K determinato dal EFM rappresenta la foglia vera K è sensibile ai percorsi di flusso dell&#39;acqua, che ancora non sono ben compresi. Mentre la EFM fornisce i dati che corrispondono a quelli di altri metodi di misurazione K foglia (vedi sopra), ed è eccellente per uso comparativo, la possibilità di specie variazione nei percorsi di flusso d&#39;acqua attraverso il mesofillo necessita di ulteriori indagini. In effetti, anche per foglie di data specie, queste vie d&#39;acqua può variare in condizioni diverse, ad esempio, sotto irradianza diversi e carichi di calore 4,30 o dello stato delle acque diversa (dato restringimento del tessuto) 31. Ulteriori conoscenzedelle vie di trasporto dell&#39;acqua sarebbe quindi consentire la EFM da utilizzare per risolvere gli effetti dei percorsi cambiamento sul trasporto foglia idraulico complessivo. La misurazione della conduttanza stomale in EFM ha il vantaggio di permettere la determinazione di risposte a irraggiamento e disidratazione, e fornire risposte appaiate g s con foglia K. Inoltre, l&#39;effetto della disidratazione foglia precedente seguito da reidratazione in g s può essere valutata con questo metodo. Tuttavia, questo metodo ha due inconvenienti potenziali. Primo, questa misura g s è fatta su una foglia asportato, piuttosto che su una pianta intatta, e la seconda, la determinazione della conduttanza stomale si basa sulla misura del clima certa distanza dalla foglia, piuttosto vicino alla foglia come in una camera porometro , anche se la ventilazione della foglia con il ventilatore equilibra la superficie del foglio con l&#39;aria circostante. Per alcune specie, escissefoglie possono mostrare diverse risposte stomatiche che per le foglie su una pianta intatta 16,32. Tuttavia, per varie specie g s stimato utilizzando la EFM era simile ai valori misurati su piante intere con un porometro per ante a metà giornata Ψ foglia 16 (Fig. 2). L&#39;EFM può essere applicato per fisiologica intuizione, cioè, indagare le dinamiche di K foglia, la sua base nella struttura e anatomia, e le sue risposte ai fattori ambientali. Inoltre, il metodo può essere usato per confrontare piante della data specie coltivate in condizioni diverse, o di età diverse, o per confrontare piante di diverse specie adattate ad ambienti differenti. Con la costruzione di curve di vulnerabilità foglia, si possono ottenere informazioni sui meccanismi di tolleranza specie alla siccità. Durante la siccità, cavitazione e collasso cellule hanno dimostrato di essere in xilema foglia di alcuni<html> specie, e ritiro cellula del mesofillo durante la disidratazione potrebbe anche avere un impatto il movimento dell&#39;acqua (recensione in 14). I futuri studi saranno necessari per determinare l&#39;importanza relativa di ciascuno di questi processi nel guidare il declino di K foglia e chiusura degli stomi. Irraggiamento è anche un forte fattore che influenza K foglia e l&#39;EFM è particolarmente adatto per misure in alto irraggiamento. La risposta combinata di acquaporine per irraggiamento e la siccità dovrebbe guadagnare molto interesse. Irradianza alta porta ad un&#39;aumentata espressione e / o attivazione delle acquaporine che permettono il flusso di acqua più velocemente attraverso cellule viventi, aumentando foglia K, che conduce alla disidratazione ridotta espressione e / o de-activatation di acquaporine, riducendo foglia K. L&#39;impatto combinato di irraggiamento e di acqua sulla foglia K richiedono ulteriori indagini 4,10,16,33. tenda &quot;&gt; Inoltre, tra le specie, K foglia e la sua vulnerabilità è relativa a distribuzione delle specie per quanto riguarda la fornitura di acqua luce e di altre risorse 3,13,24. Specie da zone aride tendono a mostrare una maggiore resistenza al declino idraulica, di fronte più negativi potenziali idrici del suolo, e mantenendo una foglia alta K da più potenziali idrici negativi, possono mantenere alta g s e continuare la cattura della CO 2 per la fotosintesi 13,14. Pertanto, lo studio delle proprietà idrauliche foglia fornisce intuizioni a livello di cella, foglia, e intero impianto e le sue risposte per l&#39;ambiente, e rischia di produrre numerose importanti scoperte nuove a tutte le scale.

measurement of leaf hydraulic conductance and stomatal conductance and their responses to irradiance and dehydration using the evaporative flux method (efm)

L&#39;acqua è una risorsa fondamentale, e l&#39;acqua del sistema di trasporto dell&#39;impianto pone dei limiti alla crescita massima e tolleranza alla siccità. Quando le piante aprono il loro stomi per ottenere una conduttanza stomatica alta (g s) per catturare CO2 per la fotosintesi, l&#39;acqua si perde per 1,2 traspirazione. L&#39;acqua evapora dagli spazi aerei è sostituito dalle pareti cellulari, a sua volta, attingendo acqua dal xilema delle vene del foglio, nel disegno turno da xilema negli steli e radici. Come l&#39;acqua è tirato attraverso il sistema, sperimenta resistenza idraulica, creando tensione in tutto il sistema e un basso potenziale idrico fogliare (Ψ foglia). Foglia stessa è un fattore critico nel sistema pianta intera, rappresentano in media il 30% della resistenza dell&#39;impianto idraulico 3. Foglia conduttanza idraulica (K = resistenza anta 1 / foglia idraulico) è il rapporto tra la portata di acqua al gradiente acqua potenziale attraverso la foglia, e riassume l&#39;comportamento di un sistema complesso:. acqua si muove attraverso il picciolo e con vari ordini di vene, esce nella guaina pacchetto e passa attraverso o attorno cellule del mesofillo prima di evaporare nello spazio aereo e di essere emerso dal stomi foglia K è di forte interesse come importante caratteristica fisiologica di confrontare specie, quantificando l&#39;efficacia della struttura della foglia e fisiologia per il trasporto di acqua, e una variabile chiave per indagare per la sua relazione alla variazione nella struttura (ad esempio, in architettura venature foglia) e suoi impatti sul cambio gas fotosintetica. Inoltre, K foglia reagisce fortemente con l&#39;ambiente interno ed esterno foglia 3. Foglia K può aumentare drammaticamente con irradianza apparentemente a causa di cambiamenti nell&#39;espressione e attivazione delle acquaporine, le proteine ​​coinvolte nel trasporto acqua attraverso membrane 4, e foglia K diminuisce fortemente durante drdovrebbe, a causa di cavitazione e / o collasso dei condotti xilematici, e / o la perdita di permeabilità dei tessuti extra-xilema a causa di mesofillo e guaina ritiro pacco cella o disattivazione acquaporina 5-10. Poiché K foglia può vincolare g s e il tasso fotosintetico tra le specie in condizioni ben irrigati e durante la siccità, e quindi limitare intero impianto di prestazioni che possono eventualmente determinare distribuzione delle specie in particolare, come siccità aumentano in frequenza e gravità 11-14. Presentiamo un metodo semplice per la determinazione simultanea di foglia e K g s sulle foglie asportati. Una foglia traspirante è collegato con il suo picciolo a tubo esecuzione ad una fonte di acqua su una bilancia. La perdita di acqua dal saldo viene registrato per calcolare la portata attraverso la foglia. Quando traspirazione stato stazionario (E, mmol m-2 • • s-1) viene raggiunta, g <sub&gt; S è determinato dividendo da deficit di pressione di vapore, e foglia K dividendo per la forza potenziale driving acqua determinato utilizzando una camera di pressione (K = foglia E / - Δψ foglia, MPa) 15. Questo metodo può essere utilizzato per valutare le risposte foglia K di irradianza diverse e la vulnerabilità di foglia K alla disidratazione 14,16,17.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM at 

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

Descriviamo un metodo relativamente rapido (30 min) e realistico per la misurazione simultanea del foglio conduttanza idraulica (<em&gt; K</em<sub&gt; Foglia</sub&gt;) E conduttanza stomatica (<em&gt; G</em<sub&gt; S</sub&gt;) Per traspiranti foglie asportati. Il metodo può essere modificato per misurare le risposte di luce e di disidratazione<em&gt; K</em<sub&gt; Foglia</sub&gt; E<em&gt; G</em<sub&gt; S</sub&gt;.

Misurazione della Leaf conduttanza idraulica e conduttanza stomatica e le loro risposte ad irraggiamento e disidratazione con il metodo del flusso evaporativo (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

measurement-leaf-hydraulic-conductance-stomatal-conductance-their

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

37.1K Views.  University of California, Los Angeles. Descriviamo un metodo relativamente rapido (30 min) e realistico per la misurazione simultanea del foglio conduttanza idraulica ( K

Video: Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in cellular and mammalian models. Here, we describe detailed methods to perform stable isotopic profiling of intermediary metabolism and metabolic flux in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are described for profiling whole worm free amino acids, labeled carbon dioxide, labeled organic acids, and labeled amino acids in animals exposed to stable isotopes either from early development on nematode growth media agar plates or beginning as young adults while exposed to various pharmacologic treatments in liquid culture. Free amino acids are quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) in whole worm aliquots extracted in 4% perchloric acid. Universally labeled 13C-glucose or 1,6-13C2-glucose is utilized as the stable isotopic precursor whose labeled carbon is traced by mass spectrometry in carbon dioxide (both atmospheric and dissolved) as well as in metabolites indicative of flux through glycolysis, pyruvate metabolism, and the tricarboxylic acid cycle. Representative results are included to demonstrate effects of isotope exposure time, various bacterial clearing protocols, and alternative worm disruption methods in wild-type nematodes, as well as the relative extent of isotopic incorporation in mitochondrial complex III mutant worms (isp-1(qm150)) relative to wild-type worms. Application of stable isotopic profiling in living nematodes provides a novel capacity to investigate at the whole animal level real-time metabolic alterations that are caused by individual genetic disorders and/or pharmacologic therapies.

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling by gas chromatography mass spectrometric analysis of intermediary metabolic flux is described in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are detailed for assessing isotopic enrichment in carbon dioxide, organic acids, and amino acids following isotope exposure either during development on agar plates or during adulthood in liquid culture.

Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Ricerca

Biologia

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Un metodo standardizzato per l&#39;analisi delle cellule epatiche sinusoidali endoteliali e loro fenestrazioni da microscopia elettronica a scansione

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, morphological leaf traits have the potential to summarize plants strategies in terms of water use efficiency, growth pattern and nutrient use. The leaf economics spectrum (LES) is a recognized framework in functional plant ecology and reflects a gradient of increasing specific leaf area (SLA), leaf nitrogen, phosphorus and cation content, and decreasing leaf dry matter content (LDMC) and carbon nitrogen ratio (CN). The LES describes different strategies ranging from that of short-lived leaves with high photosynthetic capacity per leaf mass to long-lived leaves with low mass-based carbon assimilation rates. However, traits that are not included in the LES might provide additional information on the species&#39; physiology, such as those related to stomatal control. Protocols are presented for a wide range of leaf functional traits, including traits of the LES, but also traits that are independent of the LES. In particular, a new method is introduced that relates the plants&#8217; regulatory behavior in stomatal conductance to vapor pressure deficit. The resulting parameters of stomatal regulation can then be compared to the LES and other plant functional traits. The results show that functional leaf traits of the LES were also valid predictors for the parameters of stomatal regulation. For example, leaf carbon concentration was positively related to the vapor pressure deficit (vpd) at the point of inflection and the maximum of the conductance-vpd curve. However, traits that are not included in the LES added information in explaining parameters of stomatal control: the vpd at the point of inflection of the conductance-vpd curve was lower for species with higher stomatal density and higher stomatal index. Overall, stomata and vein traits were more powerful predictors for explaining stomatal regulation than traits used in the LES.

Unraveling how physiology and morphology are linked allows a deeper understanding of mechanistic functioning of plant leaves. We present both a procedure to derive parameters of stomatal regulation from stomatal conductance measurements and correlations with traditional functional leaf traits.

Relative conduttanza stomatica a Leaf tratti funzionali

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular systolic and diastolic function. Measures of ventricular contractility and compliance are obtained through examination of cardiac response to changes in afterload and preload. These techniques were originally developed nearly three decades ago to measure cardiac function in large mammals and humans. The application of these analyses to small mammals, such as mice, has been accomplished through the optimization of microsurgical techniques and creation of conductance catheters. Conductance catheters allow for estimation of the blood pool by exploiting the relationship between electrical conductance and volume. When properly performed, these techniques allow for testing of cardiac function in genetic mutant mouse models or in drug treatment studies. The accuracy and precision of these studies are dependent on careful attention to the calibration of instruments, systematic conduct of hemodynamic measurements and data analyses. We will review the methods of conducting pressure-volume loop experiments using a conductance catheter in mice.

Cardiac pressure-volume loop analysis is the most comprehensive way to measure cardiac function in the intact heart. We describe a technique to perform and analyze cardiac pressure volume loops, using conductance catheters.

Cardiac pressione Volume Analysis Loop Utilizzando conduttanza Cateteri nei topi

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

Misurazione della Leaf conduttanza idraulica e conduttanza stomatica e le loro risposte ad irraggiamento e disidratazione con il metodo del flusso evaporativo (EFM)

Riepilogo

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Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans

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Misurazione dei ritmi diurni nel flusso autofagico e proteasomico