Damos las gracias a S. Taylor para la prestación del pLPCX-Histone H2-GFP plásmido. Damos las gracias a R. Mertelsmann apoyo continuo. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. La siembra de U2OS basados ​​en células Reporter ciclina B-SNAP (clon 11 Celdas 6) en la cámara de diapositivas para microscopio <ol><li> Tripsinizar las células subconfluentes reportero SNAP que se dejaron crecer de forma asincrónica en fase log durante al menos 48 h. </li><li> Trabajar con 8 cámaras de microscopio pocillos (distribución constante de las células). </li></ol> Para la siembra de las células sobre 8 cámaras de microscopio pocillos a una distribución constante a través de toda la superficie de la cámara del microscopio, centrífuga de 10.000 células y resuspender en 350 l de rojo fenol libre de medio de crecimiento normal (suplementado con fetal 10% de suero bovino, penicilina / estreptomicina y piruvato de sodio). Transferir la suspensión celular a la cámara del microscopio (Figura 2). Trabajar con 8 cámaras de microscopio pocillos (densidad celular máxima en el centro). Para la siembra de las células a una densidad mayor en el centro de la chamb microscopioer, cargar la cámara con 300 l de rojo fenol libre de medio de crecimiento normal. Añadir 5.000 células cuidadosamente hasta el centro de la cámara del microscopio (Figura 2). Trabajar con 96 placas óptica bien especiales (distribución constante de las células). Para la siembra de células en placas de 96 pocillos a una distribución constante a través de toda la superficie del pozo, centrifugar 5.000 células y resuspender en 300 l de rojo fenol libre de medio de crecimiento normal. Transferir la suspensión celular a una placa de 96 pocillos. Dependiendo del número total de células que contienen pozos requeridos, ajustar el número de células y el volumen total del medio de suspensión (Figura 2). Trabajar con 96 placas óptica bien especiales (densidad celular máxima en el centro). Para la siembra de células en placas de 96 pocillos, añadir cuidadosamente 1.500 células en 15 l de rojo fenol libre de medio de crecimiento normal en un small gota al centro de cada pocillo para lograr una restricción del crecimiento celular al centro del pozo (Figura 2). <ol start="3"><li> Permitir que las células sembradas a crecer durante al menos 18 horas en condiciones estándar de cultivo celular (37 º C, humedad 100% de aire, 5% de CO 2). </li></ol> 2. La tinción de las células con el sustrato de SNAP Reporter <ol><li> 30 min antes del inicio del procedimiento de tinción permitir alícuotas de rojo fenol libre de medio de crecimiento normal para calentar a 37 ° C. </li><li> Para facilitar la manipulación del sustrato SNAP (en nuestro caso TMR estrella) disolver Star TMR en DMSO para obtener una concentración en la solución stock de 400 mM, que se pueden almacenar a -20 ° C. </li><li> Antes de la tinción, diluir 0,5 l de solución stock de Star TMR en 200 l de rojo fenol libre de medio de crecimiento normal (37 ° C) para obtener una concentración etiquetado final de 1 mM. </li><li> Eliminar el medio de crecimiento normal de las células asincrónicamente creciente e incubar en lAbeling medio durante 25 min en condiciones estándar de cultivo. </li><li> Eliminar etiquetado células medianas y lavado cuatro veces con rojo fenol libre de medio de crecimiento normal (37 ° C). Se incuban las células en 300 l de rojo fenol libre de medio de crecimiento normal (37 ° C) durante 30 min. Antes de transportar al microscopio sustituir el medio fresco con rojo fenol libre de medio de crecimiento normal (37 ° C) para eliminar el sustrato de SNAP residual no unido. </li><li> Transporte células al microscopio en una caja de espuma de poliestireno en una pre-calentado (37 ° C) del bloque de calor para minimizar la variación de temperatura. </li></ol> 3. Medición de la intensidad de fluorescencia <ol><li> Dos horas antes del análisis de ajustar la temperatura del aire de la cámara climática a 37 ° C en modo de secado con el fin de llevar el microscopio con todos sus componentes a la temperatura deseada. El precalentamiento antes de la humedad es importante para evitar daños por condensación y posterior al microscopio. </li><li> Ajuste t humedad del aireo 60% y CO 2 al 5% antes del inicio del análisis. </li><li> Inicie el software Scan ^ Adquisición R y definir la configuración estándar (ver tabla 1). </li><li> Definir las posiciones de los pocillos a analizar. </li><li> Definir la Dt (tiempo de adquisición de ciclo) y el número absoluto de ciclos de adquisición. </li><li> Si el análisis de un mayor número de pozos se desea, seleccionar autoenfoque de hardware, de lo contrario, es suficiente para utilizar el autofoco software solo. </li><li> Inicie la adquisición y supervisión para los ciclos de adquisición de las dos primeras. El microscopio se centrará en la histona H2-GFP señal, con la posterior adquisición de una primera imagen en ese canal antes de que se cambia el filtro y la correspondiente imagen TMR Star es adquirido (Figura 3). Esto se repite para todas las posiciones dentro de un pozo y para cada uno de los pozos a ser examinados, antes de repetir otra vez el ciclo siguiente. </li></ol> 4. Análisis de perfiles u proteolíticacantar Scan ^ R <ol><li> Iniciar la exploración ^ software de análisis R y analizar las imágenes con los núcleos celulares, como se visualiza por histona H2-GFP, que se define como el objeto principal, utilizando un umbral basado en la intensidad de la señal y un algoritmo de cuenca para ayudar en la separación de las células vecinas. Un subobjeto que consiste en un núcleo con citoplasma debe ser creado para el análisis TMRstar. (Propiedades importantes del objeto principal son posiciones X e Y, el tiempo y máxima y las intensidades medias de GFP para el objeto principal y la intensidad total dividida por el área para el subobjeto TMRstar.) Este proceso de análisis puede tardar varias horas debido a la gran cantidad de datos cantidades. </li><li> Cambiar el modo de rastrear para visualizar la media subobjeto TMR Star intensidad de fluorescencia con el tiempo (trazas de células), asigna a los objetos analizados principales (Figura 4). El número de células para ser examinadas puede ser reducido por gating sobre dichas mediciones de duración mínima de 140 ciclos y con una alta intensidad máxima de H2-GFP. Buscandoa mayor número de células permite que un representante primera y vista objetivo (Figura 4). </li><li> Seleccione una traza de células de interés para visualizar las histonas H2-GFP y TMR Star fluorescencia simultáneamente en el nivel de célula única (Figura 5A). </li><li> Con el botón derecho del ratón en una celda de interés y generar una galería de imágenes exportable para la ilustración de la histona H2-GFP y ciclina B-SNAP Star TMR para cada punto de tiempo. </li><li> Cambie al modo de población del software Scan ^ Análisis de R y la puerta de la región en la que se representa la célula de interés en la parcela X vs Y punto (Figura 5B). </li><li> Aplique una ventana nueva trama de puntos para la región acotada y visualizar significa TMR Star intensidad de fluorescencia con el tiempo (Figura 5C). </li><li> Exportar datos (tiempo y la intensidad de fluorescencia) a Microsoft Excel para el cálculo posterior. </li></ol> 5. Los resultados representativos Higoure 5D y 5E muestran la cinética de la ciclina B, representado por una curva TMR Star intensidad de fluorescencia, de una célula que procede a través de una mitosis normal sin signos de falta de alineación cromosómica (Figura 5E). Tras la compactación del citoplasma después de la envoltura nuclear desglose (NEBD, según lo indicado por el triángulo rojo), TMR Star intensidad de fluorescencia muestra un aumento abrupto hasta que la ventana isomorfo (área más brillante en el diagrama) se alcanza cuando la célula entra en la prometafase 6. La intensidad de fluorescencia se mantiene en un nivel estable, siempre y cuando las ganancias de células a través de la profase y metafase y luego empieza a disminuir rápidamente una vez que todos los cromosomas han establecido una placa de metafase estable (Figura 5D y 5E). Esta caída precede separación de los cromosomas durante la anafase (punto azul en la curva). En la mitosis finales de la cromatina empieza a decondense (barras azules) y la célula adopta la morfología de la interfase, mientras que la curva de intensidad de fluorescencia se aproxima a unameseta que es más baja que la meseta antes de la mitosis (Figura 5D y 5E). <table border="1"><tbody><tr><td> Enfoque automático ajustes </td><td> Histona H2-GFP (ajustes principales de adquisición de objetos) </td><td> Ciclina B-SNAP etiquetados con TMR Star (Ajustes de adquisición) </td><td> Repeticiones de adquisición de tiempo de ciclo </td></tr><tr><td> Grueso de enfoque automático + / -39 m 24 Capas Fine enfoque automático + / -5,4 M 14 Capas </td><td> GFP juego de filtros: Tiempo de exposición: 100 mseg Intensidad de la luz: 25% </td><td> TRITC juego de filtros: Tiempo de exposición: 150 mseg Intensidad de la luz: 33,3% </td><td> 2 a 5 min. </td></tr><tr><td> GFP juego de filtros: Tiempo de exposición: 12 ms Intensidad de la luz: 12,5% </td><td></td><td></td><td> Hasta 48 horas de análisis continuo (limitado por la humedad del aire reducida de 60%) </td></tr></tbody&gt; </table> Tabla 1. Ajustes estándar se utilizan para el análisis de la ciclina B proteólisis. Histonas H2-GFP se utilizó como una estructura de referencia para definir el plano de enfoque para la medición de la intensidad de la ciclina B-SNAP fluorescencia. Las intensidades de luz durante el procedimiento de centrado son más bajos en comparación con los valores de adquisición de imágenes para evitar la fototoxicidad acumulativo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de la medición de la proteólisis de ciclina B a través de la expresión de un derivado de la ciclina B quimérica con características de degradación similares a la proteína endógena. La disminución de la intensidad de fluorescencia después de pulso-caza etiquetado es una medida de APC / C-actividad. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> Figura 2. El análisis de las células en portaobjetos y 8 o 96 placas. Distribución regular de lacélulas a través de la superficie del pozo se consigue mediante resuspensión en un volumen final de 300 l y se recomienda, si sólo unas posiciones único o pocos se definen manualmente para el análisis. Enriquecimiento de las células en la región central se consigue por adición de células al centro de pozos prellenadas o vacío. Esta técnica se recomienda en el caso de adquisición de imágenes automatizado en diferentes pozos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> Figura 3. Secuencia de adquisición de datos. A) Detección de las histonas H2-GFP se utiliza para la definición de foco plano y el seguimiento de alineación cromosómica durante la mitosis. B) La intensidad de fluorescencia de la intensidad de fluorescencia Star TMR es una medida de la cantidad absoluta de pulso-caza etiquetados ciclina B-SNAP. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> Figura 4. Representante Scan ^ R Análisis basado en software representación de la media Star TMRla intensidad de fluorescencia (intensidad TMRstar total dividido por área) en el tiempo. Selección de una traza célula representativa (azul). Las imágenes correspondientes (que se muestra a la derecha) permite la visualización simultánea de las histonas H2-GFP (verde) y ciclina B-SNAP (rojo). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> Figura 5. A + B) Ejemplo para la inyección de puntos que representa una célula de interés en el gráfico XY-punto. C) La visualización de la intensidad media de fluorescencia TMRstar (intensidad TMRstar total dividido por área) en el tiempo utilizando el gráfico de puntos. D + E) Representante curva intensidad de la fluorescencia de la ciclina B-SNAP con ventana isomorfo (campo brigher en el diagrama) entre NEBD (desglose envoltura nuclear) y la cromatina descondensación (barra azul) generado en Microsoft Excel. Anafase se indica por tél punto azul en la curva. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . Película 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película suplementario</a> .

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	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Presentamos aquí un enfoque de células vivas imágenes basada en facilitar el seguimiento simultáneo de la ciclina B proteólisis y la alineación de los cromosomas. Este enfoque permite el estudio del control mitótico en imperturbable poblaciones de células en el nivel de célula única. Ciclina B curvas de degradación de facilitar conocimientos directos en la actividad de la APC / C y así indirectamente reflejan el estado de la SAC 6. Este enfoque, aunque establece en bas...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del producto </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Reportero línea celular </td><td> generado internamente como se describe 6 </td><td> 11 clonar células informadoras (U2OS basados ​​ciclina B-SNAP células que expresan) </td><td></td></tr><tr><td> Ciclina B-retroviral vector de expresión de SNAP </td><td> generado internamente como se describe 6 </td><td> pLNCX2-ciclina B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolred libre de DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> La suplementación con FCS, piruvato sódico, penicilina / estreptomicina-micina requiere </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> Solución de 400 mM en DMSO </td></tr><tr><td> Opstics Plato Especial, 96 y </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 bien, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopía unidad </td><td> Olimpo </td><td> IX-81 microscopio inverso con cámara climática </td><td></td></tr><tr><td> Objetivo </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO objetivo de 20x (AN 0,75) </td><td></td></tr><tr><td> Adquisición de software </td><td> Olimpo </td><td> Scan ^ R Adquisición de software (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Análisis de software </td><td> Olimpo </td><td> Scan ^ R Análisis de software (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Distribución equitativa de los cromosomas entre las dos células hijas durante la división celular es un requisito previo para garantizar la estabilidad genética 1. Imprecisiones en la separación de los cromosomas son una característica de malignidad y asociado con la enfermedad progresiva 2-4. El punto de control de ensamblaje del huso (SAC) es un mecanismo de vigilancia mitótico que retiene las células en metafase hasta que cada cromosoma individual ha establecido una unión bipolar estable para el huso mitótico 1. El SAC ejerce su función por la interferencia con la activación de APC / C subunidad Cdc20 para bloquear la proteolisis de securin y ciclina B y así separación de los cromosomas y la salida de mitosis. Fijación incorrecta de cromosomas impide el silenciamiento de SAC señalización y provoca la inhibición continuada de APC / C Cdc20 hasta que se resuelva el problema para evitar missegregation cromosómica, aneuploidía y tumores malignos 1. La mayoría de los estudios que abordaron la influence de apego indebido cromosómico en APC / C dependiente de proteólisis aprovechó la interrupción del husillo mediante despolimerización de microtúbulos o la estabilización de los medicamentos para interferir con apego a los microtúbulos cromosómicos. Dado que la interferencia con la cinética de microtúbulos pueden afectar el transporte y localización de reguladores críticos, estos procedimientos llevan un riesgo de inducir efectos artificiales 5. Para estudiar cómo el SAC interfiere con la APC / C dependiente de proteólisis de ciclina B durante la mitosis en las poblaciones de células imperturbable, hemos establecido un sistema de histonas H2-GFP-base que permitió la monitorización simultánea de la alineación de los cromosomas en metafase mitótica y la proteólisis de la ciclina B 6 . Para describir perfiles proteolíticos, hemos generado una ciclina B quimérico molécula indicadora con un resto C-terminal de SNAP 6 (Figura 1). En una reacción de auto-etiquetado, la SNAP-resto es capaz de formar enlaces covalentes conalkylguanine-portadoras (sustrato SNAP) 7,8 (Figura 1). Moléculas de sustrato SNAP son fácilmente disponibles y llevar a un amplio espectro de diferentes fluorocromos. Quiméricos ciclina B-SNAP moléculas se vuelven marcado después de la adición del sustrato de SNAP-membrana permeable al medio de crecimiento 7 (Figura 1). Después de la reacción de marcaje, la intensidad de la ciclina B-SNAP fluorescencia cae en una reacción de tipo de pulso y persecución manera y las intensidades de fluorescencia reflejan los niveles de ciclina B degradación 6 (Figura 1). Nuestro sistema facilita el seguimiento de mitótico APC / C dependiente de la proteolisis en un gran número de células (o varias poblaciones de células) en paralelo. De esta manera, el sistema puede ser una herramienta valiosa para identificar agentes / moléculas pequeñas que son capaces de interferir con la actividad proteolítica en la metafase a anafase de transición. Además, como la síntesis de la ciclina B durante la mitosis Recientemente se ha sugerido como un mecanicista importantesm en el fomento de un bloque mitótico en ratones y seres humanos al mantener los niveles de ciclina expresión B 9,10 estables, este sistema nos ha permitido analizar la proteólisis de ciclina B como un elemento de un equilibrio satisfactorio 6.

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Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Metafase anafase transición se activa a través de la promoción de complejos anafase (APC / C)-dependiente de ubiquitinación y posterior destrucción de la ciclina B. En este caso, hemos establecido un sistema que, a raíz de pulso-caza etiquetado, permite monitorizar la proteólisis de ciclina B en poblaciones de células enteras y facilita la detección de interferencia por el puesto de control mitótico.

El estudio de la proteólisis de ciclina B en el nivel de células individuales en poblaciones de células enteras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.4K vistas.  University Medical Center Freiburg. Metafase anafase transición se activa a través de la promoción de complejos anafase (APC / C)-dependiente de ubiquitinación y posterior destrucción de la ciclina B. En este caso, hemos establecido un sistema que, a raíz de pulso-caza etiquetado, permite monitorizar la proteólisis de ciclina B en poblaciones de células enteras y facilita la detección de interferencia por el puesto de control mitótico.

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Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

De células enteras grabaciones de la Luz evocados excitatorios de las corrientes sinápticas en la porción de retina

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Investigación

Biología

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

La obtención de ARN de alta calidad a partir de poblaciones de células individuales en tejido cerebral humano post-mortem

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Método para la medición de la cinética de fusión viral a nivel de partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

La medición cuantitativa de invadopodios mediada por proteolisis de la matriz extracelular en contextos simples y multicelulares

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Generación de Dispersed presomitic mesodermo Cultivos Celulares for Imaging del pez cebra Segmentación del Reloj en células individuales

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Análisis de retrotransposition LINE-1 en el Núcleo Un piso

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocolo CÚBICO Visualiza la expresión de la proteína en la resolución de la celda individual en su totalidad para la piel Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.