Este trabajo fue apoyado por F31NS086765 (KAC), F31NS076235 (MAP), y R01 NS052669 (GKP) y EIA9100012. Los autores agradecen a Eileen Kasperek de experiencia y asistencia en la biología molecular y el cultivo de tejidos; y Jason Myers para compartir los datos obtenidos a partir de principios de neuronas corticales prefrontales.

1. Cultivo Celular y Expresión de proteínas <ol><li> Mantener las células HEK293 (número de ATCC CRL-1573) entre los pasajes 22 y 40, que incluye pasajes realizados por la ATCC, en cultivo en monocapa en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina a la mezcla de 5% de CO 2 y 37 ° C. Entre los experimentos, las células de paso en matraces T25 a 5-20 diluciones en un volumen final de 10 ml. Nota: El uso de células durante estos pasajes garantiza la salud celular favorable que permita la formación de sellado óptimo y estabilidad parche. </li><li> Para la transfección, la placa de células HEK293 en placas de 35 mm a una densidad de ~ 10 5 células / placa, que corresponde a ~ 0,5-0,6 ml de suspensión de células por plato y crecer las células en 2 ml de medio de 18-24 h. </li><li> En un tubo estéril de centrífuga de 1,5 ml, preparar la mezcla de transfección durante cuatro platos de 35 mm mediante la adición de (en este orden): (1) 1 g de cada ADNc (GluN1, GluN2A, y GFP); (2) 315 l deagua doblemente destilada (ddH2O); (3) 350 l de 42 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico ácido (HEPES), y (4) 35 l de CaCl2 2,5 M gota a gota, que se utiliza para formar el precipitado. </li><li> Tubo Vortex durante 5 segundos y añadir 175 l de suspensión de la transfección en cada uno de los cuatro platos de 35 mm chapada el día anterior, que ahora contiene células a 50-60% de confluencia, e incubar las células a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Aspirar el medio de transfección, se lava con PBS y se reemplaza con 2 ml de medio de crecimiento suplementado con 2 mM de MgCl 2 para evitar que la excitotoxicidad mediada por receptor de NMDA 9. Nota: Las células se pueden utilizar para registros electrofisiológicos mensaje 24-48 h de la transfección. </li></ol> 2. Preparación del electrodo <ol><li> Generar 2 pipetas de registro simétricas tirando de tubos de vidrio borosilicato con un extractor vertical. Basándose en el tamaño y la geometría de la punta resultante, más pipetas formausando una pulidora. Nota: El tamaño de la punta puede ser evaluado visualmente y eléctricamente. Visualmente, el diámetro exterior debe estar en el rango de 1.4 a 5.6 micras. Eléctricamente, una punta de tamaño óptimo, cuando se llena con solución extracelular, debe producir resistencias en el rango MΩ 12-24 (véase la Figura 2B). </li><li> Use una solución de la pipeta, lo que para los experimentos con células adjunta representa el medio extracelular que producirá la actividad del canal máximo y altas amplitudes de corriente. Nota: Para los receptores de NMDA, esto corresponde a una solución que contiene concentraciones de saturación de los agonistas (glutamato y glicina), EDTA 1 mM, que quela inhibidores catiónicos divalentes y bloqueadores, y tiene concentraciones fisiológicas de sodio (150 mM) como único ion permeable ( en mM: 1 glutamato, glicina 0,1, NaCl 150, KCl 2,5, EDTA 1, y 10 lambda HepBs, tamponada a pH 8,0 con NaOH 1 N). </li></ol> 3. Patch-clamp grabación celular conectado <ol><li> Abrir softwa adquisición de datos QuBre (www.qub.buffalo.edu), y seleccione la ventana de adquisición en virtud de &#39;diseño&#39;. Abra un nuevo archivo de datos QuB (QDF) haciendo clic en &#39;New Data &quot;bajo el menú desplegable titulado&#39; File &#39;e introduzca los siguientes parámetros iniciales: la tasa de muestreo, 40 kHz; A escala / D, 3000; canal de salida, 1; y el tamaño de los datos A / D, 2. Ajuste la escala de amplitud de 0,1 V / pA haciendo clic derecho en el archivo de datos, la selección de propiedades, y hacer clic en la pestaña &#39;datos&#39;. Nota: Estos parámetros pueden ser refinados para cada configuración usando un modelo de células en el modo de célula-adjunto. Instrucción adicional sobre la adquisición de datos con el software QuB y propiedades QDF están en línea en www.qub.buffalo.edu. </li><li> Seleccionar un plato de 35 mm que contiene células que expresan canal iónico y reemplazar el medio de cultivo con 2 ml de PBS que contiene calcio y magnesio; montar el plato en la platina del microscopio y se centran en el campo celular mediante microscopía de contraste de fases para evaluar que las células están sanas y bien unidos al platoen la moda monocapa (Figura 1A). Cambiar a la detección de fluorescencia para verificar que la transfección ha sido satisfactoria (Figura 1B). Nota: El rango de intensidades de fluorescencia se puede utilizar como una medida cruda de la expresión de la proteína. </li><li> Para la grabación de un solo canal, ajuste la salida de ganancia del amplificador para x10, la configuración de parche para β = 1, filtro analógico de 10 kHz, el modo de fijación de voltaje y el voltaje aplicado a 100 mV. Con la orden de retención de voltaje en la posición OFF, seleccione el botón de &#39;prueba del sello&#39;. </li><li> Basado en la fluorescencia y la salud de las células, elija una célula para reparar. Compruebe bajo contraste de fase que la célula es bien unidas a la placa, tiene una gran parte de la superficie de la célula expuesta para parches, y de lo contrario se ve saludable. Nota: Mantenga la iluminación de contraste de fase para evitar el blanqueo de la célula durante la aproximación y patch-sujeción. </li><li> Llenar una pipeta recién pulida con suficiente solución para que haga contacto con la electrodelectrónico y agite suavemente para eliminar las burbujas de aire que puedan estar atrapadas en la punta. Asegure la pipeta de la grabación en el headstage amplificador apretando el tornillo de sellado del soporte de pipetas y asegurarse de que el alambre de plata se encuentra inmersa en la solución de la pipeta. </li><li> El uso de un pequeño (5 cc) de la jeringa de plástico, que está conectado a la titular de la pipeta por tubo, se aplica una suave presión positiva para evitar que entren impurezas en y la obstrucción de la punta durante la aproximación (Figura 2A). </li><li> Usando el micromanipulador, dirija la pipeta en el baño y colocar directamente sobre la celda seleccionada para parchar (Figura 1C), cerrando el circuito eléctrico. Tome nota del osciloscopio, que debe indicar una forma de onda rectangular correspondiente al sello de la señal de prueba del amplificador (Figura 2B). Nota: Al entrar en el baño, la resistencia de la pipeta dentro del rango óptimo es 12-24 MΩ. Para una señal de prueba 5 mV, la corriente medida range corresponde a ~ 20-40 pA. </li><li> Durante la supervisión de la posición de la pipeta visualmente a través de la resistencia microscopio y pipeta eléctricamente en el osciloscopio, continuar la aproximación en pequeños incrementos hasta que la pipeta suavemente incide sobre la célula, y la señal de prueba disminuye ligeramente para indicar aumento de la resistencia (Figura 2B). </li><li> Para formar un cierre hermético, recoger la jeringa y aplicar una ligera presión negativa a través del tubo lateral tirando del émbolo de la jeringa, que tira de la membrana celular en la punta de la pipeta de grabación e inicia la formación de un sello resistencia GΩ 10. Tome nota de la forma de onda de la señal de prueba en el osciloscopio, en el que la formación del sello se indica por su aplanamiento completo, con sólo transitorios capacitivos visibles (Figura 2B). Nota: Si la señal no se aplane completamente la línea de base o hace ruido, esto indica un sellado débil con fuga de corriente sustancial alrededor del sello. Esto evitará que Resolving uno corrientes de los canales. Si este es el caso, retirar la pipeta de la célula y fuera de la bañera, retírelo de la etapa de la cabeza y lo descarta. Repita el proceso con una pipeta recién pulida hasta obtener un sello en el rango adecuado (≥ 1 GΩ). </li><li> En el amplificador, cambiar la palanca de mando externa de &#39;prueba de sellado&#39; en &#39;off&#39;; cambiar el orden de tensión que sostiene a positivo (lo que se ha establecido previamente en &#39;off&#39;); y aumentar la ganancia de x100. Observar el osciloscopio para la actividad del canal, que, si está presente, se muestra como desviaciones al alza cuadrados desde la línea de base previamente plana (Figura 2C). </li><li> Si se muestra la actividad del canal en el osciloscopio, adquirir datos en el archivo digital abierto previamente en QuB, pulsando el botón &quot;play&quot; seguido del botón &quot;record&quot;. Para detener la adquisición de datos, pulse el botón de parada en QuB, y guarde el archivo QDF a una facilidad retrievubicación capaces en el disco duro del ordenador seleccionando &quot;Guardar datos como ...&quot; en el menú desplegable titulado &#39;Archivo&#39;. </li></ol> 4. Datos de preprocesamiento y la idealización Nota: Información adicional se puede extraer de las grabaciones de canales individuales mediante análisis estadísticos que asigna a cada punto de datos a una clase de la conductancia apropiado (en el caso más simple, cerrado o abierto). Este proceso se conoce como idealización de datos y una breve descripción de la idealización de datos con los medios k segmentarias (SKM) Método 11 en QuB se describe a continuación. <ol><li> Abra el archivo de datos en QuB, y ver las huellas actuales de la interfaz &#39;Pre&#39; bajo &#39;layout&#39;. Visualice el archivo grabado sin filtrar (eliminar filtro digital) desmarcando la casilla &#39;Fc. </li><li> Escanear visualmente el registro para detectar las irregularidades y los artefactos (Figura 4A). Picos de corriente breves correctos que ocur dentro de la traza (Figura 4) mediante la selección de una región limpia adyacente de la misma clase de la conductancia, destacando esta región, haciendo clic derecho y seleccionando &#39;búfer de borrado ajustado. Zoom sobre la espiga hasta que los puntos de muestreo individuales son visibles, seleccione la región que sustituir y borrar resaltando sólo esta región y haga clic en &quot;borrar&quot;. </li><li> Definir la línea de base cero de corriente para el registro completo seleccionando una primera parte del registro donde la línea de base es estable, lo más destacado, haga clic derecho y seleccione &#39;línea de base set&#39;. Verifique que la guía que aparece con precisión representa el nivel básico (púrpura en la Figura 4B) </li><li> Identificar puntos en el disco donde la línea de base de datos en bruto se desvía visiblemente desde la línea de base establecida. Corrija esto seleccionando una pequeña sección de la línea de base en la región de desviarse, haga clic derecho y seleccione el comando &#39;agregar un nodo de referencia ». </li><li> Identificar las regiones del tque la grabación que contiene el exceso de ruido o los artefactos que no se pueden corregir fácilmente (Figura 4C). Resaltar la región para ser desechados, haga clic y seleccione &#39;Eliminar&#39;. Nota: En este caso la información cinética se pierde: el registro procesado será más corto y los puntos que se producen después de que el punto de empalme parecerá ser continuo con la región pre-ruido. </li><li> Para idealizar registros utilizando el algoritmo de SKM 11, resalte una parte de la traza que contiene tanto abierto como cerrado acontecimientos y entrar en la interfaz &#39;Mod&#39; bajo &#39;Layout&#39;. En el panel &quot;modelo&quot;, resalta una parte limpia de la traza que es representativa de la línea de base en todo el archivo, haga clic en el cuadrado negro (estado cerrado) y seleccione &quot;agarrar&quot;. Haga lo mismo para las aberturas de los canales, poniendo de relieve la conductancia abierto, haga clic derecho en el cuadrado rojo en el panel de &quot;modelo&quot; y seleccione &quot;agarrar&quot;. </li><li> Realice la idealizaciónción para el registro completo seleccionando el botón &#39;File&#39; en &#39;Origen de datos.&#39; Haga clic en la pestaña &quot;idealizar&quot; debajo de la sección &#39;Modeling&#39; para verificar que los parámetros deseados para el análisis son correctos y, a continuación, haga clic en &quot;Ejecutar&quot;. El resultado de la idealización, junto con el histograma de amplitud para el archivo completo, se superpone con los datos para permitir la inspección visual de la idealización (Figura 5). Nota: idealización inadecuada puede conducir a la generación de los &quot;eventos falsos, &#39;en el que QuB detecta aperturas y cierres de canales que no ocurren en realidad. Dentro de la resolución de grabación, que se establece por el filtro analógico del amplificador y la frecuencia de muestreo, la resolución con la que SKM detecta eventos abiertos y cerrados se puede controlar mediante el establecimiento de un tiempo muerto para los análisis. Tiempos muertos óptimos deben ser seleccionados por ensayo y error y dependerán de la frecuencia de muestreo, sin embargo, una buena regla general espara seleccionar un tiempo muerto que es de 2-3 muestras 12. </li><li> Para comprobar que la idealización representa con precisión los datos en bruto, escanear manualmente la traza idealizada. Tras la identificación de errores en la idealización, resalte la traza sobre el evento falso, haga clic derecho y seleccionar &quot;Unirse Idl. &#39; Nota: Para obtener opciones adicionales y una explicación detallada de los distintos comandos y funciones en QuB, consulte el Manual QuB línea (www.qub.buffalo.edu). </li></ol>

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Sakmann and E Neher. , (1995).</li></ol>

Los autores de este manuscrito declarar que no tienen intereses financieros en competencia.

En el campo de los canales iónicos, un área importante de la investigación se dedica a la comprensión de la secuencia de acontecimientos que conduce al canal de apertura o mecanismo de compuerta del canal. Para la mayoría de los canales, este proceso es complejo e implica varios pasos cinéticos que no se puede deducir a partir de una señal multicanal macroscópica. Por el contrario, los experimentos pueden ser diseñados, donde la observación de la secuencia de los eventos de apertura / cierre en el registro de ...

Comunicación rápida a través de membranas biológicas depende casi exclusivamente de las proteínas de membrana oligómeros formadores de poros, comúnmente conocidos como canales. Estas proteínas son muy diferentes en las señales de activación, los mecanismos de activación periódica y propiedades de conductividad. Proteínas de los canales cuyos poros son selectivos para iones se clasifican como canales iónicos; su activación produce corrientes iónicas a través de la membrana, y sus respuestas se puede grabar con alta resolución en tiempo real utilizando técnicas electrofisiológicas. Las señales de activación abarcan una amplia gama de insumos químicos y físicos, incluyendo gradientes de concentración, las fuerzas mecánicas y eléctricas y la temperatura; por lo tanto, la clasificación más canales iónicos en ligando cerrada, mechanosensitive, voltaje cerrados o tipos sensibles al calor. En este artículo, se describen protocolos para registrar la actividad de un canal de un canal de ligando cerrada, el receptor de NMDA, y un canal de mechanosensitive, PIEZO1, utilizando la técnica de patch-clamp.0; Electrofisiología Patch-clamp es el primer y más utilizado método experimental suficientemente sensible para permitir la observación de moléculas individuales 1, 2. Además de esta exquisita sensibilidad, que se ha expandido enormemente las preparaciones biológicas susceptibles de grabación electrofisiológico y también ha permitido la observación de los canales iónicos en membranas intactas. En primer lugar, debido a que ambos de fijación de tensión y de grabación actual se llevan a cabo con el mismo electrodo, que puede ser utilizado para grabar señales a través de células pequeñas o parches de membranas. La técnica reveló que los canales iónicos no se restringen a las membranas excitables de músculos rana, electroplaques anguila, o axones gigantes del calamar 3, 4, sino que representan accesorios ubicuos de los mecanismos de señalización transmembrana y son intrínsecas a todos los tipos de membranas celulares de uni-o los organismos multicelulares, y también a las membranas intracelulares. Importaciónantly, la capacidad para registrar las corrientes transmembrana con sólo conectar una pipeta de vidrio de una célula intacta proporcionó la oportunidad sin precedentes para registrar la actividad de los canales iónicos en las membranas ininterrumpido nativas. Así, el adjunto técnica de patch-clamp de células, que se describe en este protocolo, permite el seguimiento de la actividad de los canales iónicos de forma continua durante decenas de minutos o más en su ambiente nativo. Bajo las fluctuaciones térmicas normales, todas las proteínas, incluyendo las proteínas de los canales iónicos, sufren cambios estructurales a lo largo de una escala de tiempo amplio, con los reordenamientos más rápidos y más frecuentes representados muy probablemente por los movimientos de las cadenas laterales y los cambios mucho más lentos y menos frecuentes representados por el reposicionamiento de toda dominios o subunidades, o en algunos casos por modificaciones post traduccionales o interacciones proteína-proteína 5, 6. Observando largos periodos en actividades generadas por una molécula puede ayudar a comprender la funcióndinámicas internacionales de los canales iónicos en las membranas intactas fisiológicos y proporciona información valiosa sobre el mecanismo de funcionamiento de la molécula observado. En contraste con la creciente comprensión de la diversidad de los canales de iones a través de tipos de células y etapas de desarrollo, el conocimiento sobre la composición molecular de los canales iónicos en membranas nativas es aún limitada. Todos los canales de iones son proteínas multiméricas y la mayoría de los canales de iones nativos ensamblan a partir de varios tipos de subunidades que producen proteínas de diversidad molecular amplia, que a menudo se acompaña con diversas propiedades de conductancia y de activación periódica. Por esta razón, los canales iónicos de composición molecular definido se estudiaron después de la expresión en sistemas heterólogos. En particular, las células HEK293, que son una línea clonal de células embrionarias humanas inmortalizadas de riñón 7, ganado amplia aceptación como el sistema preferido para la expresión heteróloga de los canales iónicos recombinantes. Entre el hombreY ventajas que elevaron las células HEK293 como el sistema de elección para la electrofisiología de canales de iones son la facilidad y asequibilidad de cultivo y mantener los cultivos estables de larga duración, su capacidad para llevar a cabo después de la traducción de plegado, el procesamiento y el tráfico de proteínas de mamíferos, y en muchos casos , su bajo nivel o incluso ausencia de la expresión endógena para el canal de interés 7, 8. Expresando los canales iónicos recombinantes y estudiar sus propiedades funcionales en células HEK293 sigue siendo un enfoque valioso para obtener información sobre las propiedades de estructura-función de los canales iónicos así como las propiedades específicas de las isoformas de los canales iónicos y sus roles en el tejido nativo. Los protocolos que se describen en este artículo se pueden aplicar igualmente a los canales iónicos recombinantes expresadas en células HEK293 y para los canales iónicos nativas. En resumen, la técnica de patch-clamp, a través de su capacidad sin precedentes para resolver señals de una molécula sigue siendo, hasta la fecha, el método más directo para observar el comportamiento de las moléculas individuales. En su modo celular conectado, la grabación de patch-clamp permite períodos largos de observación que, cuando se hace por una molécula, pueden proporcionar una visión excepcional sobre el funcionamiento de los canales iónicos. A continuación se presenta un protocolo para la obtención de alta resolución grabaciones actuales de parches adjuntos de células que contienen una proteína de canal iónico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:189px;">Chemicals</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">Various</td>
			<td style="width:205px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosillicate Glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF-150-86-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bright field inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1x51</td>
			<td>Nikon also has similar microscopes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluroescent box</td>
			<td>X-cite</td>
			<td>Series 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid Light Guide</td>
			<td>X-cite</td>
			<td>OEX-LG15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td colspan="2">Axon Axopatch 200B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Table</td>
			<td>TMC</td>
			<td align="right">63561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIDAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>776844-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polisher</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Microforge MF-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Faraday Cage</td>
			<td>TMC</td>
			<td align="right">8133306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Pressure Clamp</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA HSPC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pressue/Vaccuum Pump</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA PV-PUMP</td>
			<td>For HSPC-1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-channel cell-attached patch-clamp recording

Proteínas de los canales iónicos son dispositivos universales para la comunicación rápida a través de membranas biológicas. La firma temporal del flujo iónico que generan depende de las propiedades intrínsecas a cada proteína del canal, así como el mecanismo por el cual se genera y se controla y representa un área importante de la investigación actual. Información acerca de la dinámica de funcionamiento de proteínas de los canales de iones se puede conseguir mediante la observación de largos tramos de corriente producida por una única molécula. Descrito aquí es un protocolo para la obtención de patch-clamp grabaciones de corriente de la célula-adjunto de un canal para un canal de iones cerrada ligando, el receptor de NMDA, expresado de forma heteróloga en células HEK293 o de forma nativa en las neuronas corticales. También se proporcionan instrucciones sobre cómo adaptar el método a otros canales iónicos de interés al presentar el ejemplo del canal PIEZO1 mecano-sensible. Este método puede proporcionar datos con respecto a las propiedades de conductancia del canal y la secuencia temporal de Opeconformaciones n cerrados que componen el mecanismo de activación del canal, lo que ayuda a comprender sus funciones en la salud y la enfermedad.

Recombinante receptores NMDA Los receptores NMDA se unen y responden a la acción simultánea de dos co-agonistas: glutamato y glicina. Se reúnen como heterotetrámeros de dos subunidades de unión a glicina GluN1 y dos glutamato vinculante subunidades GluN2. GluN2 subunidades están codificadas por cuatro genes (AD) y de éstos las formas más ampliamente transcritas en el cerebro son GluN2A en adultos y GluN2B en animales jóvenes. Debido a la diversidad de los subtipos d...

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One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

one-channel-cell-attached-patch-clamp-recording

Research

JoVE Journal

Biology

24.1K vistas.  University at Buffalo, SUNY.  Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas. 

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Métodos para grabaciones de parche Capacidad de la pinza del cáliz

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Investigación

Biología

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pulido a presión para la Mejora de pipetas de patch-clamp grabación

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Registro electrofisiológico en el Drosophila Embrión

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Ambulatory ECG Recording in Mice

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although the surface ECG is utilized for short-term measurements of waveform intervals, it is not practical for long-term studies of heart rate variability or the capture of rare episodes of arrhythmias. Implantable ECG telemeters offer the advantages of simple surgical implantation, long-term recording of electrograms in ambulatory mice, and scalability with simultaneous recordings of multiple animals. Here, we present a step-by-step guide to the implantation of telemeters for ambulatory ECG recording in mice. Careful adherence to aseptic technique is required for favorable survival results with the possibility of implantation and recording from weeks to months. Thus, implantable ECG telemetry is a valuable tool for detection of critical information on cardiac electrophysiology in ambulatory animal models such as the mouse. 

Telemetric ECG has emerged as an essential tool in evaluating animal models for cardiac arrhythmias and sudden cardiac death. Here, we present a stepwise guide to telemetric ECG recordings for application in long-term ambulatory ECG monitoring in mice.

Ambulatorio de grabación ECG en ratones

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Preparación de liposomas gigantes de la Imagen y Patch-Clamp Electrofisiología

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...