Este trabajo ha sido posible gracias a la financiación de la Wellcome Trust. JM (080.964) y SCW (080.948) fueron apoyados por becas Wellcome Trust y de DT por una beca de Confianza Malawi-Liverpool-Wellcome.

1. Recogida de muestras Las plaquetas pueden activarse fácilmente a través de la temperatura, la agitación o el almacenamiento, por lo que deben ser manejados con cuidado. El uso de tubos al vacío para recoger sangre para la preparación de plaquetas es inevitable en la mayoría de las situaciones clínicas, pero se debe considerar cuidadosamente como aspiración puede potencialmente causar la activación plaquetaria. Debido al protocolo clínico utilizado en nuestro centro de investigación, las muestras se recogen cuidadosamente vacutainers citrato de sodio. No hemos tenido ningún problema con la prematura activación plaquetaria en esta o en nuestro estudio anterior 12. Recopilamos la sangre para la preparación de plaquetas a partir del grupo sanguíneo O + individuos para reducir al mínimo el grupo sanguíneo de agregación no específica de antígeno. Asimismo, los donantes no han tomado la medicación en los días 7 a 10 anteriores, se sabe que algunos medicamentos influyen sobre la función plaquetaria. 1.1 Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP) <ol><li> Recoge aproximadamente 5 mlde la sangre entera desde un host ingenua la malaria o 2,5 ml de sangre de CM o malaria grave (SM) de los pacientes en un vacutainer de citrato de sodio (BD número de producto 36276). </li><li> Centrifugar la sangre total a 250 xg durante 10 min a temperatura ambiente. No centrifugar a 4 ° C como bajas temperaturas pueden causar que las plaquetas a agregarse. </li><li> Transferir cuidadosamente el sobrenadante turbio en un tubo de 15 ml limpio. Las plaquetas son fácilmente activados por las variaciones de temperatura y choques físicos y por lo tanto debe ser manejado con cuidado. Evite sacudidas o los movimientos bruscos del tubo. </li><li> Usar hematocitómetro de un Neubauer para contar y ajustar la suspensión de plaquetas a&gt; 300 x 10 3 plaquetas / l de donantes sanos y &lt;150 x 10 3 plaquetas / l de CM y los pacientes SM utilizando 1X tampón de fosfato (pH 7.2-7.4; PBS). Asegúrese de elegir un alto factor de dilución para facilitar el recuento de plaquetas y garantizar su exactitud. </li></ol> Nota: La malaria patients tienen un recuento de plaquetas reducido en comparación con los individuos sanos 16,17,18. Por lo tanto las concentraciones de plaquetas para CM y UM se ajustan de acuerdo a los recuentos de plaquetas promedio para los pacientes dentro de cada grupo de diagnóstico de la malaria. El P. falciparum fenotipo de aglutinación es común en los aislados CM y muestra una fuerte afinidad de unión por lo tanto, las concentraciones de plaquetas no afecta a la reducción de tamaño de agrupamiento o de la frecuencia ya que la concentración de plaquetas es estandarizado para todos los casos CM. 1.2 Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP) <ol><li> Para obtener PPP, centrifugar una parte del PRP obtenido anteriormente a 1500 xg durante 10 min. La mayoría de las plaquetas se sedimentan en la parte inferior del tubo. </li><li> Tanto PRP y PPP se pueden almacenar a 4 ° C durante hasta dos semanas. Lo ideal es utilizar las plaquetas frescas para el ensayo de aglutinación. Después de 8-10 días la mayor parte de las plaquetas son propensos a estar inactivo y probablemente agregada. </li></ol> 2. Parasite Cultura <ol><li> Lavar las sedimentadas pRBC tres veces con 5-10 ml de RPMI 1640 por centrifugación a 370 xg durante 5 min. Nota: en este protocolo todas las culturas empezaron a aproximadamente 1 ml de hematocrito (PCV) y se mantuvieron a 5% de hematocrito. Los cultivos se pueden iniciar con cualquier PCV de GRI y ajustarse en consecuencia con la no infectada RBC y los medios para alcanzar el hematocrito deseado. </li><li> Coloque el GRP en un matraz de cultivo y el suplemento con medio de cultivo estándar de la malaria de RPMI 1640 suplementado con 25 mM de HEPES, 5% Albumax II o 10% de suero y 40 mg / ml de gentamicina para lograr un hematocrito 5%. </li><li> Permeado frascos de cultivo con una mezcla de 92,5% de nitrógeno, 2,5% de oxígeno y dióxido de carbono al 5% antes de sellar e incubar. Alternativamente, el método de jarra de anaerobiosis hermético al aire de Trager-Jensen se puede utilizar. </li><li> Para pRBC obtiene directamente de los pacientes, incubar su frasco de cultivo de 24 a 36 horas en un 37 ° C incubadora de CO2 al 5% para obtener parásitos maduros. NOTA: Most laboratorio y líneas adaptadas al cultivo son muy fáciles de mantener en cultivo bajo condiciones estándar. Existen técnicas simples descritas a continuación que se pueden utilizar para sincronizar las diferentes etapas de parásitos para mantener la tasa de crecimiento. </li><li> Preparar un frotis de sangre delgado como se describe a continuación y examinar la maduración del parásito al microscopio óptico. </li></ol> 3. Thin Blood Film Slide Preparación <ol><li> Coloque aproximadamente 10-15 l de sangre en un extremo de un portaobjetos de vidrio esmerilado que descansa sobre una superficie plana. </li><li> Toque la gota de sangre con el borde de un segundo portaobjetos hasta que la sangre se distribuye uniformemente a través del borde de la segunda corredera. </li><li> Mientras mantiene la segunda diapositiva en un ángulo de 45 °, de forma rápida, pero suavemente, sin ejercer demasiada presión sobre la primera diapositiva, deslice la sangre a través de la primera diapositiva de hacer una película delgada de sangre que se distribuye uniformemente. Deje secar al aire. </li><li> Sumergir el portaobjetos en metanol durante 10 seg. Deje secar al aire. </li><li> Sumerja el portaobjetos en 2% Giemsa stain durante al menos 10 min. Aclarar exhaustivamente hasta que el agua salga clara. Deje secar al aire. </li><li> Examine diapositiva utilizando una lente de emulsión de aceite 90-100x en un microscopio de luz </li></ol> 4. Purificación y sincronización de las etapas asexuales La purificación de P. madura falciparum GRP es un paso necesario para el ensayo de aglutinación. En efecto, sólo los parásitos maduros son capaces de unirse a los receptores de plaquetas, ya que es en esta etapa del ciclo de vida que los ligandos pertinentes se expresan y sobresalen de la superficie de eritrocitos infectados. Hay varios métodos para purificar y sincronizar las etapas asexuales de P. falciparum: etapas asexuales tardías pueden ser enriquecidas por gradiente de Percoll 19; magnética de células de clasificación 20 o mediante el protocolo de gelatina de sedimentación 21 se describe aquí.. Sorbitol-sincronización selecciona para las etapas de anillo 22, después de lo cual los anillos se cultivaron durante 24-26 horas para obtener estados maduros (sin need para llevar a cabo la flotación de gelatina). 4.1 Plasmagel flotación Plasmagel flotación utiliza una solución similar a gelatina para seleccionar para el peso inferior nudoso eritrocitos a permanecer en solución, mientras que las formas de anillo densos y rosetas hunden hasta el fondo. Esta técnica da hasta un 90% de pureza de los eritrocitos infectados etapa-maduros y se puede utilizar tanto para el campo y aislamientos de laboratorio. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, plasmagel flotación elimina rosetas de GRI, así como los estados inmaduros que podrían resultar en una frecuencia reducida aglutinación en las muestras con una alta frecuencia de formación de rosetas. Sin embargo, la ausencia de la formación de rosetas GRP después de plasmagel de flotación no afectaría el ensayo de formación de grumos debido a la formación de rosetas es una interacción de los eritrocitos pRBC y no infectadas, mientras que la aglutinación es pRBCs la unión mediada por las plaquetas. El ligando implicado en estos dos rasgos es diferente; con complementar principalmente receptor de CR-1 en los eritrocitos no infectados que median la formación de rosetas.<ol><li> Solución Gelofusine Precalentar y medianas II-libre de suero / Albumax a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Transferir la cultura a un tubo estéril de 15 ml limpio y sedimentar las células por centrifugación a temperatura ambiente a 370 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante con cuidado a fin de no perturbar el sedimento y se resuspenden las células en un volumen igual de Gelofusine y medio libre de proteínas. </li><li> Transfiera la mezcla a un tubo estéril de 15 ml y se deja reposar durante 15-20 minutos en un 37 ° C incubadora o hasta una demarcación clara se puede ver entre un nivel superior e inferior. </li><li> Transferir cuidadosamente la capa superior a un tubo nuevo estéril de 15 ml y añadir 10 ml de RPMI fresco. </li><li> Centrifugar a 370 xg durante 5 minutos y desechar cuidadosamente el sobrenadante. </li><li> Evaluar fase parasitemia y de desarrollo de frotis de sangre delgado y examinar bajo un microscopio de luz como se describe en la sección 4. </li></ol> NOTA: Mature gama pRBC entre 60-90% de los eritrocitos infectados depending sobre la parasitemia inicial del cultivo. Para un alto porcentaje de parásitos maduros, utilice las culturas con una parasitemia inicial de ≥ 10%. 5. Ensayo de Aglutinación <ol><li> Utilice hematocitómetro del Neubauer para contar y ajustar la suspensión pRBC obtenido después de la flotación plasmagel a 1 x 10 8 pRBC / l. </li><li> En un tubo de 1,5 ml frescos, resuspender GRP a 5% de hematocrito, naranja de acridina a 20 mg / ml de concentración final y PRP en 10% del volumen total. En lugar de naranja de acridina, culturas parásitos se pueden teñir con 25 g / ml de bromuro de etidio durante 5 min antes de su uso. Por ejemplo, para una mezcla de reacción de 200 l, añadir 10 l de GRI maduro, 20 l de 300 x 10 3 plaquetas / l de PRP de donantes sanos o 150 x 10 3 / l plaquetas de pacientes SM y 170 l de medio libre de proteínas. NOTA: La relación de las plaquetas: pRBC en las reacciones finales es 20:01. Esto es importante ya que se permite la máximaum frecuencia de agregación de una muestra que se determine. Si se agregan las plaquetas menos en los controles y luego no todos los pRBCs agrupamiento podría tener la oportunidad de agruparse. </li><li> De la misma manera preparar los siguientes controles, células rojas de la sangre no infectadas y PRP, y pRBC con PPP para determinar el papel de las plaquetas en la formación de grumos pRBCs. </li><li> Transferir la suspensión a un vial cónico ml con tapón de rosca 1,5-2,0. </li><li> Colocar el vial con agitación suave por laminado a 10-12 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Compruebe si la formación de un grupo húmedo diapositiva preparada con la pipeta 10 l de pRBC ± mezcla de plaquetas en un portaobjetos, cubra con un vaso resbalones y examen con fluorescencia. </li><li> El muestreo puede hacerse en intervalos de 15-20 min para un total de 120 min. Un grupo se considera como un conjunto de tres o más eritrocitos infectados. </li></ol>

<ol>
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No hay conflictos de interés declarado.

Hemos descrito un ensayo de aglutinación de plaquetas mediada utilizado para el estudio de GRP en los aislados clínicos directamente en el campo. Agregación plaquetaria mediada, un comportamiento característico de P. falciparum aislados clínicos, se ha identificado como un fenotipo adhesivo distinto, frecuente en los aislamientos de unión a CD36 12,23-24. Hemos utilizado este ensayo para identificar tres puntos principales: 1) una fuerte in vitro fenotipo de aglutinación de P. falciparum aislado de niños de Malawi que se asocia con la gravedad de la enfermedad y el diagnóstico 2) nuevo receptor mediaties P-selectina aglutinación de las plaquetas junto con CD36, 3) el grado de trombocitopenia presente en pacientes con CM es suficiente para limitar aún más la formación de grumos en pRBC in vitro 12. La participación de las plaquetas en la formación del grupo se demuestra mediante el examen de una preparación húmeda diapositiva como se describe en la sección 6. Las plaquetas pueden aislarse de PRP mediante centrifugación a altas velocidadescon el fin de reducir al mínimo la sangre reacciones antigénicas del grupo, sin embargo, se utilizó PRP conjunto a fin de minimizar prematura activación de las plaquetas y de la manipulación excesiva de la centrifugación de alta velocidad. Actividad de las plaquetas se puede medir mediante la prueba de agregación plaquetaria utilizando débiles agonistas de plaquetas o epinefrina, difosfato de adenosina (ADP) 25 como se describe en 26. Hay varios aspectos del ensayo que han sido previamente mal caracterizado, siendo uno de ellos la importancia de seleccionar fuentes de PRP y el efecto de los grupos de antígenos en sangre en el resultado del ensayo. Preparamos PRP de personas que eran del grupo sanguíneo O + y no había tomado algún medicamento en los últimos 7-10 días antes de extraer la sangre, ya que algunos medicamentos pueden afectar el comportamiento de las plaquetas. Otros factores que pueden afectar la formación de grumos éxito incluyen GRP hematocrito, niveles de parasitemia y la longitud del ensayo de aglutinación. Uso de alta hematocrito y plaquetas coUNT sería difícil decir si el grupo es realmente un grupo o si hay demasiadas células están simplemente sentados juntos porque están densamente empaquetadas 15. Aglutinación también aumenta generalmente con tiempos de incubación más largos. Estas son todas pautas útiles que deben ser considerados en el diseño de estudios de aglutinación. Encontramos que las muestras de diferentes grupos clínicos pueden ser analizados en paralelo usando PRP del mismo donante si es posible hacerlo, pero en la configuración de recursos limitados, tales como los sitios de campo de la piscina transfusión se limita generalmente. Por lo tanto, es difícil tener un solo donante + O para estandarizar los ensayos. Por lo tanto, identificamos varios donantes + S para asegurar la compatibilidad de grupo sanguíneo sea posible. El uso de múltiples donantes también es útil en los casos de grandes tamaños de muestras para que la carga de la donación de sangre no entra en un solo individuo. Los puntos de muestreo a 15-20 min son mucho más factible si una sola person está llevando a cabo los ensayos, teniendo en cuenta los preparativos húmedo diapositivas y la realización de la cinética de ensayo y sin tiempos de muestreo que se superponen. La mayor parte de los datos es microscópica visual y algo objetivo, por lo tanto, es importante que el recuento de células se verifica por más de una persona. En ese caso, el manejo de una muestra a la vez puede permitir el análisis completo de tres y cincuenta y siete muestras de un día en función de la eficiencia personal. Aglutinación de plaquetas mediada puede llevarse a cabo utilizando tanto aislamientos clínicos y de laboratorio. Para las líneas de laboratorio, se recomienda que CD36 parásitos de unión se utilizan para maximizar la formación de conglomerados de frecuencias. El ensayo puede ser acoplado con otros ensayos de aglutinación, tales como formación de rosetas o utilizado en ensayos de inhibición de la aglutinación que permitan el estudio de los receptores en las plaquetas que pueden mediar la unión de GRI, un aspecto poco entendido y examinado de este fenotipo.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

P. falciparum causa la mayoría de las infecciones de malaria graves. Los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a la malaria cerebral (CM) no se entienden completamente y varias hipótesis se han propuesto, incluyendo la obstrucción mecánica de microvasos por P. células falciparum-eritrocitos parasitados (GRP). En efecto, durante la etapa intra-eritrocítica del ciclo de vida, P. falciparum tiene la capacidad única para modificar la superficie de los eritrocitos infectados mediante la exportación de antígenos de superficie con diferentes propiedades adhesivas sobre la membrana de glóbulos rojos. Esto permite que el secuestro de GRP en múltiples tejidos y órganos por adhesión a las células endoteliales que revisten la microvasculatura de las vénulas post-capilares 1. De este modo, las formas maduras del parásito evitar liquidación esplénica de los eritrocitos infectados deformado 2 y restringen su medio ambiente a una presión de oxígeno de baja más favorable 3. Como consecuencia de esta SEQUESTración, es sólo parásitos asexuales y gametocitos inmaduros que pueden ser detectados en la sangre periférica. Cytoadherence y secuestro de pRBC maduros como para los receptores de escenario para numerosos expresadas en camas microvasculares se produce en la enfermedad severa y complicaciones. Sin embargo, varias líneas de evidencia sugieren que sólo los fenotipos adhesivos específicos son susceptibles de ser asociados con consecuencias patológicas graves de la malaria. Un ejemplo de tales interacciones huésped-específicas del parásito se ha demostrado in vitro, en donde la capacidad de la molécula-1 de adhesión intercelular para apoyar la unión de GRP con particulares propiedades adhesivas se ha relacionado con el desarrollo de la malaria cerebral 4,5. La placenta también ha sido reconocido como un sitio de la acumulación de GRP preferencial en las mujeres embarazadas infectadas por la malaria, con sulfato de condroitina A expresada en sincitiotrofoblastos que recubren el espacio intervellosa placentaria como el receptor principal 6. Rosetas de pRBC teritrocitos no infectados o a través del receptor del complemento 1 (CD35) 7,8 también se ha asociado con la enfermedad grave 9. Uno de los más recientemente descrito P. falciparum fenotipos cytoadherence es la capacidad de la GRP a formar montones mediadas por plaquetas in vitro. La formación de tales grupos pRBC requiere CD36, una glicoproteína expresada en la superficie de las plaquetas. Otro receptor humano, gC1qR/HABP1/p32, expresada en diversos tipos de células incluyendo las células endoteliales y las plaquetas, también se ha demostrado para facilitar la adhesión GRP en las plaquetas para formar grupos 10. Si la aglutinación se produce in vivo no está clara, pero puede dar cuenta de la importante acumulación de plaquetas descritos en la microvasculatura del cerebro de los niños de Malawi que murieron por CM 11. Además, la capacidad del aislado clínico culturas a agruparse in vitro estaba directamente relacionado con la gravedad de la enfermedad en Malawi 12 </sup&gt; Y pacientes mozambiqueños 13, (aunque no en Malí 14). Con varios aspectos del fenotipo de aglutinación pRBC mal caracterizado, los estudios actuales sobre este tema no han seguido un procedimiento estandarizado. Este es un problema importante debido a la conocida alta variabilidad inherente en el ensayo 15. A continuación, presentamos un método in vitro para el agrupamiento de plaquetas mediada por P. falciparum con la esperanza de que va a proporcionar una plataforma para un método consistente para otros grupos y crear conciencia de las limitaciones en la investigación de este fenotipo en estudios futuros. Al estar basado en Malawi, proporcionamos un protocolo diseñado específicamente para una configuración de un recurso limitado, con la ventaja de que los aislados clínicos recién recogidas se pueden examinar para fenotipo sin necesidad de criopreservación.

Un ejemplo de un ensayo de grupo de plaquetas mediada por el uso de aproximadamente el 70% etapas maduras de P. falciparum después del enriquecimiento por Plasmagel flotación se muestra en la Figura 2. Un grupo es un conjunto de tres o más eritrocitos infectados. La tinción con naranja de acridina o bromuro de etidio puede ser visualizada por microscopía de fluorescencia. El naranja de acridina es espectralmente similares a la fluoresceína, con un máximo de excitación a 502 nm y un máximo de emisión a 525 nm (verde), mientras que el bromuro de etidio tiene un máximo de excitación a 493 nm y un máximo de emisión a 620 nm (similar a colorantes de rodamina, rojo ). Los montones son fácilmente identificables en el microscopio como con la luz normal aparecen como agregados celulares y bajo de fluorescencia en forma de manchas de color verde o rojo cuando se tiñen con naranja de acridina o bromuro de etidio colorantes, respectivamente, como se muestra en la figura 2 (punto de tiempo de 30 min usando naranja de acridina ). El más grande de los grupos, el más grande es el agregado celular aparece sinder la luz normal y el más grande de los puntos de color verde o rojo bajo fluorescencia para los respectivos colorantes. Dado que el ADN diana colorantes y por lo tanto núcleos mancha, plaquetas y RBC no infectados no se detectan bajo microscopía fluorescente debido a su falta de núcleos. Formación aleatoria de pequeños grupos pRBC de 4,7 ± 1,6 pRBCs / de agrupamiento se producen después de 30 min. El tamaño de agrupamiento aumenta de manera significativa a un promedio de&gt; 15 pRBC / grumos después de la incubación durante 120 min con algunos grupos que contienen numerosos GRP / grupo que no se podía contar visualmente. Se calcula la frecuencia del fenotipo de aglutinación como el número de células infectadas presentes en grumos / 1000 células infectadas, contado en ensayos por duplicado. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> Figura 1. El flujo de trabajo de agrupamiento experimento. Plaquetaria rICH y plasma pobre en (A) y un p cultura de eritrocitos infectados por Plasmodium falciparum-(B) se preparan y luego se combinaron para el ensayo de aglutinación (C). <img alt="La figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> Figura 2. La aglutinación de eritrocitos infectados por P. aislar falciparum laboratorio. macizos formados por HB3 en el tiempo 0, 30 y 120 min en el plasma rico en plaquetas (A) y pobre formación de masa en plasma pobre en plaquetas (B). Limitaciones del ensayo Hay limitaciones que afectan específicamente a la función plaquetaria o influyen en el resultado y la mayoría de ellos ya se han destacado por Arman y Rowe 15. Aquí mencionamos algunos de los posibles problemas que podrían surgir en diferent etapas del ensayo: <ol><li> La adaptación de aislados clínicos en el cultivo in vitro puede ser un desafío ya que a veces se requieren períodos de cultivo más largos con el fin de lograr una alta parasitemia suficiente para permitir la formación de grumos. Con altas tasas de variación antigénica en P. falciparum, el fenotipo adhesivo de la cultura-adaptado parásito no puede reflejar la población de parásitos infectar original después de tiempos prolongados en cultivo. </li><li> Con el fin de evitar la aglutinación no específica debida a los antígenos de grupos sanguíneos, los donantes de plaquetas se deben emparejar para el antígeno de grupo sanguíneo con aislados clínicos utilizados en el mismo ensayo, o el antígeno del grupo sanguíneo O-donante universal utilizado. Sin embargo, los individuos con grupo sanguíneo O-son raros en sitios africanos como Malawi, por lo que las plaquetas de uso general se obtienen de la sangre del grupo O + donantes y tiene que ir acompañada por el grupo sanguíneo. </li><li> Contando grupos en una preparación de portaobjetos húmedo es engorroso y difícil para la captura de imagen como el cells están en constante movimiento. Por lo general, pRBC acumulan en los bordes de la hoja de la cubierta o que tienden a pegarse entre sí formando grumos &quot;falsas&quot; que pueden ser fácilmente confundidos con grupos reales. Con el fin de reducir el movimiento de células, permitir que las células sedimentar durante 15 min a temperatura ambiente antes del análisis. </li><li> El ensayo de aglutinación es sensible al tiempo y por lo tanto sólo permite una muestra a ser analizada por persona a la vez para una precisión óptima. Muestreo puntos de tiempo para dos muestras diferentes se pueden superponer fácilmente, lo que resulta no coincidentes puntos de tiempo de muestreo entre las muestras si se manejan más de una muestra al mismo tiempo. En tales circunstancias, el software cuantitativa sofisticado podría calcular los tamaños de agrupamiento o como alternativa anticuerpos específicos de células podría ser utilizado para analizar la composición de los grupos. Aunque estas técnicas pueden mejorar en gran medida la importancia de los datos, en entornos de escasos recursos, donde es probable que se use este ensayo, las técnicas y los equipos no están disponibles. </li></ol>

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A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Este método investiga el fenotipo de aglutinación de plaquetas mediada por<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Eritrocitos infectados (GRI) en aislados clínicos. Esto se realiza mediante el aislamiento y la co-incubación de plasma rico en plaquetas y una suspensión de GRP.

Un protocolo simple para el agrupamiento de plaquetas mediada por<em&gt; Plasmodium falciparum</emEritrocitos&gt; por el VIH en un recurso pobre ajuste

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

18.6K vistas.  Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme. Este método investiga el fenotipo de aglutinación de plaquetas mediada por Plasmodium falciparum-Eritrocitos infectados (GRI) en aislados clínicos. Esto se realiza mediante el aislamiento y la co-incubación de plasma rico en plaquetas y una suspensión de GRP.

Video: A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protocolo para la producción de un cruce genético de los parásitos de la malaria de roedores

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Investigación

Inmunología e Infección

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocolo para la recolección y la tinción de los hemocitos del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocolo Chelex simple para la extracción de ADN a partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Separación de los<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-eritrocitos infectados por medios magnéticos

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Un protocolo para el análisis de la hepatitis C de replicación del virus

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

Alto Rendimiento Purificación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los merozoitos Para uso en opsonizante Antibody Ensayos

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Métodos para investigar el papel de Regulación de pequeños ARN ribosomal y ocupación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.