Este trabajo fue apoyado por el NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) y NIH subvenciones AR052785 AR046786 y (AEO y W. MW-).

1. Preparar 0 a 2 días de edad ratones recién nacidos para la disección de piel <ol><li> Eutanasia crías de ratón usando un CO 2 cámara durante al menos 20 min. Deja crías en el hielo hasta una hora hasta que la disección. P0-P2 ratones son muy recomendables como células preparadas a partir de los ratones más viejos han reducido la capacidad progenitor que se traduce en un menor rendimiento de injerto. Prepare un plato de etanol al 70% (para el paso 1,3) y tres platos de solución de lavado (para el paso 3) cuando esté listo para realizar la disección de la piel. Descongele Solución Dispasa y dejarlo a 4 ° C. Cervical dislocar las crías después del CO 2 sobre-exposición para garantizar la eutanasia. </li><li> Coloque cachorros sacrificados en una placa de cultivo en hielo y la transferencia a una campana de flujo estéril. </li><li> Lavar brevemente cachorros por inmersión en etanol al 70% y el lugar en placa de cultivo estéril. </li></ol> 2. Diseccionar la piel de ratón <ol><li> Cortar cada extremidad y la cola en la base del torso con tijeras estériles. </li><li> Sujete el cuerpo firmemente entre un par de cufórceps rved y crea una incisión a lo largo de la piel dorsal de la cabeza a la cola con un bisturí sin penetrar en la fascia subyacente. </li><li> Retire con cuidado la piel lejos de la línea media del ratón. </li><li> Agarre el ratón expuesto firmemente con el lado largo de las pinzas curvas e insertar otro par de pinzas curvas debajo de la piel en el extremo posterior del ratón y tire suavemente la piel en caderas hacia la media ventral del ratón. </li><li> Retire con cuidado la piel completamente del ratón con un movimiento suave y deseche la canal. </li></ol> 3. Lavar la piel con la solución e incubar Dispasa <ol><li> Colocar la piel en el primer plato de solución de lavado con la dermis hacia abajo. Corre piel hacia fuera y agite con una pinza. Deja la piel en el primer plato de la solución de lavado, mientras que la disección de la piel que viene. </li><li> Después de colocar la piel próxima disecados en el primer plato de solución de lavado, transferir la piel antes del segundo plato de solución de lavado. Mantenga pieles en the segunda solución de lavado hasta que todas las pieles se recogen. Transfiera todos los skins para el lavado final, agitar brevemente. </li><li> Añadir 10 ml de hielo frío Dispasa a una placa de cultivo estéril de 10 cm. Transferir la piel a la solución de Dispasa y aplanar la piel dermis hacia abajo. </li><li> Float piel durante 8-16 horas a 4 ° C (opción alternativa: 1 hora a 37 ° C). </li></ol> 4. Dermis Epidermis separada y <ol><li> Transferir la piel a una placa de cultivo estéril nueva y aplanar la piel dermis hacia abajo. Con cuidado, mantenga pulsada la dermis de una esquina con un bisturí. </li><li> Agarre la epidermis con pinzas y se desprenda lentamente lejos de la dermis. Epidermis deben pelar lejos como una sola pieza. La epidermis será blanca y fina y la dermis debe ser de color marrón, más grueso y gelatinoso. </li><li> Separe los dos tejidos en distintas placas de cultivo estériles. <ol class="lalpha"><li> Para que un gen específico dérmica caída / sobreexpresión injerto, tome la dermis y la carne picada en trozos muy pequeños con two escalpelos. Deseche epidermis. El día de la infección (paso 7), diseccionar otro conjunto de pieles de ratón para preparar células epidérmicas frescas, sin tratar de combinar con lentiviral células infectadas dérmicos. </li><li> Para hacer una epidérmico genes específicos desmontables / sobreexpresión injerto, corte cada epidermis en 6 - 8 piezas más pequeñas. Deseche dermis. El día de la infección (paso 7), diseccionar otro conjunto de pieles de ratón para preparar células frescas, dérmicos tratados para combinar con lentiviral infectados por células epidérmicas. </li></ol></li></ol> 5. Disociar Pilas Ratón piel (mDCs) del tejido picado <ol><li> Disociar mDCs por incubación de piezas dérmicos con solución de colagenasa recién hecho a 37 ° C durante 1 hr. Utilizar 10 ml de solución de colagenasa por ratón cachorro. </li><li> Mezclar suavemente dermis solución que contiene cada 10 min. Comprobar el grado de disociación con un microscopio con la suspensión de células digieren las células deben ser en su mayoría individuales. La solución debe pasar de transparente a opaco comocélulas dérmicas se disocian de la dermis. </li><li> Añadir FBS para solución de colagenasa que contiene dermis hasta un volumen final de 10% para reducir la actividad de la colagenasa. </li><li> Pase la suspensión celular a través de un colador de 70 micras de células en un tubo de 50 ml nuevo para eliminar grandes grupos no digeridos y los folículos enteros. Añadir 10 ml de DMEM/10% de FBS por 30 ml de el flujo a través para diluir aún más la colagenasa. </li><li> Tubos de centrífuga que contiene dermis se digirió a 30 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min para eliminar adicionalmente folículos enteros. </li><li> Transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo 50 ml. Pellet las células por centrifugación a 200 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min. </li><li> Resuspender las células con FBS DMEM/10% (1 ml por cachorro) y contar las células. Células de la placa con Amniomax C-100 medios de comunicación para la infección (paso 7), o para combinar con lentivirus infectados por KC para el injerto (paso 9). Rendimiento típico es de 20 x 10 6 células por cachorro. </li></ol> 6. Disociar queratinocitos Primarias (KC) de tejido picado <ol><li> KC disociar mediante la incubación de piezas epidérmicas con recién descongelada 0,05% de tripsina-EDTA a 37 º C durante 15 min. Utilice 7 ml de tripsina-EDTA por ratón cachorro. </li><li> Agite suavemente la solución que contiene epidermis cada 5 minutos. </li><li> Añadir un volumen igual de solución neutralizante de tripsina-EDTA que contiene epidermis para reducir la actividad de la tripsina. </li><li> Pellet las células por centrifugación a 200 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min. Tejido restante no digerido debe flotar en la parte superior. </li><li> Con cuidado vierta mayor parte del sobrenadante con el tejido no digerido. Remover el sobrenadante restante con una pipeta de 10 ml sin célula inquietante pellet. Resuspender pellet de células con PBS. En las KCs de casos no se sedimentan completamente, se vierte la mayor parte del sobrenadante y repetir la centrifugación hasta que la mayoría de las células se sedimentan. </li><li> Colar suspensión de células a través de 70 micras filtro de células en un tubo de nuevo para eliminar el tejido restante o grumos. </li><li> Pellet células por centrifugacióna 200 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min. </li><li> Resuspender las células en los medios de comunicación CnT-07 o PBS (1 ml por cada cachorro) y las células de recuento. Use CnT-07 para células en placas de infección (paso 7), el uso de PBS para combinar con lentivirus infectados mDCs para el injerto (paso 9). Rendimiento típico es de 3-10 x 10 6 células por cachorro. </li></ol> 7. Infectar las células primarias con lentivirus que contienen shRNA o cDNA El día de la infección diseccionar otro conjunto de pieles de ratón para preparar las KCs frescos, no tratados primarios o mDCs para combinar con células infectadas por virus en el día de injerto (paso 9). <ol><li><ol class="lalpha"><li> Para mDCs, placa de 4 x 10 6 mDCs por placa de 10-cm con Amniomax-C100 medios de comunicación y se incuba a 37 ° C + 5% de CO 2 para la infección día siguiente a la densidad celular del 50%. Por lo general, las placas 3-4 de mDCs se utilizan para generar un injerto, y un total de 10-12 placas son necesarios para generar tres injertos en un solo experimento. Como alternativa, vamos a unir y difundir mDCs fo un mínimo de 2 horas a 37 ° C + 5% de CO 2 y llevar a cabo la infección por el mismo día de la siembra celular. mDCs tendrá fibroblastos-como la morfología. </li><li> Por KC, placa de 12 x 10 6 KC por 10 cm de la placa con la CNT-07 medios de comunicación y se incuban a 37 ° C + 5% de CO 2 para la infección día siguiente. Alternativamente, KC permiten almacenar y extender durante un mínimo de 2 horas a 37 ° C + 5% de CO 2 y llevar a cabo la infección en el mismo día. Por lo general, las placas 3-4 de KC se utilizan para generar un injerto. Un total de 10-12 placas son necesarios para generar tres injertos para un experimento. KC tendrá morfología adoquines. </li></ol></li><li> Preincubar células durante 5-10 minutos con 8 mg / ml Solución Polybrene a 37 º C + 5% de CO 2. </li><li> Cambio de los medios de comunicación y añadir lentivirus + 8 mg / ml Solución Polybrene. Título lentiviral variará dependiendo de la construcción utilizada y debe ser determinado antes de la infección. </li><li> Centrifugar las placas a 200 xg en una centrífuga de mesa durante 1 hora a 32 °; C para infectar células con lentivirus. </li><li> Retire lentivirus que contienen los medios de comunicación y añadir medio fresco. Por KC, lavar las células una vez con PBS antes de volver a agregar un nuevo medio. Células infectadas usualmente recuperar durante la noche a 37 ° C + 5% de CO 2. Alternativamente, permita por lo menos dos horas de recuperación a 37 º C + 5% CO 2 antes de tripsinizando las células para los injertos. Seguir a la cultura una pequeña porción de las células infectadas para comprobar la eficiencia de la infección como se describe en la sección de resultados representativos. </li></ol> 8. Preparar células infectadas por injerto <ol><li> Aislar frescas mDCs primarios o KCS de la piel con los pasos 4-6. Resuspender las células en hielo frío PBS estéril. Contar las células. </li><li><ol class="lalpha"><li> Para dérmica gen específico desmontables / sobreexpresión de injerto, se disocian mDCs infectados de placas usando 0,05% de tripsina-EDTA a 37 º C durante 8 min. </li><li> Para epidérmico genes específicos desmontables / sobreexpresión injerto, se disocian KC infectados de placas using 0,125% de tripsina-EDTA a 37 º C durante 15 min. </li></ol></li><li> Neutralizar la actividad de tripsina usando FBS DMEM + 10% (mDCs) o solución neutralizante (KC). Transferir las células tratadas con tripsina a un tubo de 50 ml. </li><li> Pellet las células por centrifugación a 200 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min. </li><li> Resuspender las células en hielo frío PBS estéril. Contar las células. </li><li> Combine las células infectadas por virus con el recién preparada tipo de células sin tratar de contrapartida. Por un injerto, combinar 7-10 x 10 6 mDCs con 7-10 x 10 6 KCS en hielo frío PBS estéril y el pellet de células en suspensión de una centrífuga de mesa a 4 º C. Resuspender las células en 50 -100 l hielo frío PBS estéril. Mantenga las células en hielo hasta nu / nu ratones cámaras están listas. </li></ol> 9. Crear lecho de la herida y de la Cámara de Fix Volver a nu / nu ratones Un día antes del injerto, esterilizar los instrumentos quirúrgicos con cámaras de silicio autoclave y estéril por inmersión en etanol al 70%. Vuelva a colocar la eta 70%nol con PBS estéril antes de usar las cámaras. <ol><li> Anesthetize nu / nu ratón (7-12 semanas de edad hembras) usando ketamina (8 mg / ml) / xilazina (1,6 mg / ml) mediante inyección intraperitoneal (100 μl/10 g de peso corporal) o otro método preferente. Aplicar lubricante ocular. Coloque la almohadilla de calefacción inferior del ratón. </li><li> Desinfecte la piel desnuda de nuevo mouse con yodo y limpiar con toallitas de alcohol. </li><li> Añadir 1-3 gotas de 0,25% bupivicaína al sitio de la incisión por vía tópica. Apriete la piel del ratón de nuevo desnuda en la base del cuello con una pinza. </li><li> Corte un pequeño agujero circular (~ 1 cm de diámetro) en la piel pellizcada con tijeras estériles. </li><li> Coloque la cámara estéril en lecho de la herida y cubrir los bordes de la cámara con la piel circundante. </li><li> Cámara de fijación en su lugar con suturas a lo largo de los bordes de la cámara (6 puntadas por cámara), como se muestra en la Figura 2A. </li><li> Cuando las cámaras están listas, remover suavemente suspensión celular y en la elaboración de una aguja de calibre 23 unida a una jeringa de 1 ml. Si suspensión de células se ha condensado en la parte inferior, suavementeresuspender con una punta de pipeta ml antes de sacar la aguja. </li><li> La punción con aguja y cámara lenta por goteo células sobre la herida. </li><li> Coloque los ratones en jaulas limpias y autoclave. Casa 2 ratones por jaula y añadir antibióticos y Tylenol (3 mg / ml) para el agua potable. En nuestra experiencia, dos ratones hembras por jaula no han dado lugar a trauma adversa a la cámara, injerto o animales. </li><li> Coloque la almohadilla térmica menos de la mitad de la jaula y observar los ratones hasta que la anestesia desaparezca. </li></ol> 10. Retire Cámara Después de 7-9 días <ol><li> Anestesie cámaras nu / nu ratones como en el paso 9.1. Aplicar lubricante ocular. </li><li> Desinfecte la piel alrededor de la cámara con yodo y limpiar con toallitas de alcohol. </li><li> Corte con cuidado y quitar puntos de sutura de la cámara. </li><li> Retire con cuidado la cámara de ratón. Si las nuevas púas de injerto de piel a la cámara, levantar parte de la cámara y del injerto suavemente separado de la cámara utilizando fórceps. Mantenga injerto hacia abajo durante la extracción de la cámara. Injerto debe look mate y opaca como en la Figura 2B. </li><li> Aplicar una almohadilla no adherente con una película fina de los antibióticos sobre la herida abierta y la sutura en su lugar (2 puntos). </li><li> Envuelva vendaje alrededor del ratón para sujetar la almohadilla y proteger la herida. Suture vendaje en su lugar. </li><li> Las cámaras de silicio están limpiarse con jabón suave y enjuagar con agua desionizada. Remoje las cámaras en el 70% de etanol durante la noche, el aire seco y almacenar. </li></ol> 11. Examine ratón para el crecimiento del pelo <ol><li> Retire los vendajes y la almohadilla después de 3 días de la remoción de la cámara. Injerto debe ser seco y opaco a marrón. </li><li> Entrada ratones periódicamente para el crecimiento del cabello. El cabello debe comenzar a mostrar a los 16 días después del injerto. </li></ol> Procedimiento Esquema Día 1 (03.02 h): Sacrificio cachorros recién nacidos, quitar la piel y dejar actuar dispasa a 4 ° C durante la noche. Día 2 (03.02 h): Aislar las células primarias de la piel yplaca a una densidad celular recomendada. Día 3 (3-4 h): infectar células con lentivirus. Quite la piel del otro grupo de cachorros recién nacidos y dejar actuar dispasa a 4 ° C durante la noche. Día 4 (08.06 h): Aislar las células primarias de la piel, contar y dejar en hielo. Recuperar lentivirus células infectadas por tripsinización y centrifugación, contar y combinar 7-10 x 10 6 células dérmicas y queratinocitos en 50-100 l de PBS por injerto. Crear lecho de la herida en el ratón, coloque la cámara, y aplique la mezcla de células lecho de la herida. Procedimiento alternativo Outlines Esquemas alternativos procedimiento acortará el procedimiento de cuatro días a tres. <ol><li> Combinar Día 1 y Día 2 por tratamiento de las pieles de ratón en dispasa a 37 ° C durante una hora (hr tiempo estimado 5-7). </li><li> Combinar Día 2 y Día 3 mediante la infección de células con lentivirus después de células en placas durante dos horas (hr tiempo estimado 5-7). </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

Ensayos de pelo reconstitución proporcionar un modelo de regeneración de órganos única para examinar el mecanismo de formación de novo folículo del cabello. Aquí se describe un ensayo de cámara de pelo modificado útil para determinar la función de genes en la formación de folículos pilosos. Nuestro ensayo se basa en el ensayo de reconstitución cámara informó cabello 5, 6,11, que se modificó para introducir una técnica de expresión lentiviral para lograr la sobreexpresión del gen o una caída en cualquiera de los tipos de células dérmicas o epidérmicas. Nuestro ensayo proporciona una alternativa rápida a la generación de tejidos específicos de knockout genético. Este ensayo nos permite demostrar la función de genes en la formación del folículo piloso en tan sólo tres semanas después de infectar células primarias con lentivirus a la colección del injerto. Nuestro ensayo pueden ser aplicados a las interacciones genéticas utilizando combinación shRNA / entrega de ADNc por lentivirus en un tipo de célula 12, así como permite el examen de la señalización entre el typ célula dérmica y epidérmicaes. Nuestro ensayo de pelo es el más adecuado para la detección de fenotipos fuertes ganancia o pérdida de función en la regeneración del folículo piloso, mientras que los defectos sutiles son más difíciles de observar. Hemos demostrado con éxito la función dérmica gen específico de unos pocos genes utilizando nuestro ensayo regeneración del cabello 1,12. Basado en el marcador GFP co-expresó a partir del vector lentivirus expresar shRNA 10, hemos demostrado que la expresión de shRNA células donantes dérmicos persistió en los injertos de pelo regeneradas. GFP-positivas las células estaban presentes en la papila dérmica (DP) de los folículos pilosos regeneradas (Figura 3). Las células DP probable constaba de diferentes niveles de gen desmontables como células expresaron niveles variables de GFP, por lo tanto el fenotipo del folículo del pelo observada fue de un rango de genética hypomorph a null. Una mejora para esta prueba será establecer una selección rápida y eficiente para los altos células que expresan shRNA antes grafting como el uso de FACS para purificar fuertes que expresan GFP-células. Una alternativa es sustituir las células mutantes knockout o condicional en este ensayo 9. Por otra parte, un sistema de cultivo que puede preservar la función DP celular es muy útil como potencia DP se pierde gradualmente una vez que las células dérmicas primarias se pasan. Sistemas de cultivo potenciales incluyen el uso de biomateriales derivados de nicho artificial o cultivos de agregación 2,7,8,13. Otra mejora será generar un método fiable epidérmico congelación celular con una velocidad de células de alta recuperación ya que esto reducirá el uso de la segunda serie de crías de ratón (paso 7) para generar queratinocitos frescas en dérmico específico de pérdida o de ganancia de- estudios de función. Este ensayo pelo cámara produce densidad de folículos pilosos y calidad similar a la piel de un ratón normal, aunque el crecimiento del pelo es un poco menos sincronizados y orientación folículo es más aleatoria. A pocas limitaciones del ensayo de regeneración del cabello genética incluídoe el requisito de gran cantidad de lentivirus y el número de células, y es una labor muy intensa en términos de métodos quirúrgicos en comparación con otras formas de ensayos de reconstitución del cabello tales como el parche y ensayos de solapa 3,4,14. Sin embargo, la calidad de los folículos pilosos y de escala de tiempo para detectar el crecimiento del cabello es superior a otros ensayos 4. Nuestro ensayo dirigido la regeneración capilar proporciona un compañero rápido y cómodo a los actuales modelos genéticos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Cnt-07 </td><td> Celular N Tec </td><td> CnT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AMINOMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AMINOMAX-C100 Suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispasa </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> La colagenasa, Tipo 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultivo de tejido </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras de disección </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> curva </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex Supply </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> Tamaño no. 10 </td></tr><tr><td> 70 micras de tinción celular </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos cónicos de centrífuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49D </td><td></td></tr><tr><td> Hisopos de alcohol </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> Calibre 23 aguja </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Ojo lubricante </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providona-Lodine hisopos </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silicio Cámaras </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Suturas </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Vendaje flexible </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Apósito no adherente </td><td> Telfa </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiales </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solución de lavado PBS 500 g / ml penicilina / estreptomicina 12,5 ug / ml de Fungizone 100 ug / ml de gentamicina Dispasa solución HBSS 2,5 mg / ml final Dispasa 100 ug / ml de gentamicina Medios neutralizantes HBSS 15% (v / v) de FBS La colagenasa solución 0,25% (w / v) de colagenasa, Tipo 1 ONTENIDO &quot;&gt; 100 ug / ml de penicilina / estreptomicina 2,5 g / ml de Fungizone 50 ug / ml de gentamicina Polybrene solución HBSS 8 mg / ml (w / v) Polybrene </td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

Morfogénesis del folículo piloso, un proceso complejo que requiere la interacción entre epitelios derivados de queratinocitos y el mesénquima subyacente, es un sistema de modelo atractivo para estudiar el desarrollo de órganos y la señalización específica de tejido. Aunque el desarrollo del folículo piloso es genéticamente tratable, análisis rápido y reproducible de los factores esenciales para este proceso sigue siendo un desafío. Aquí se describe un procedimiento para generar la sobreexpresión dirigida o shRNA mediada desmontables de factores utilizando lentivirus en una manera específica de tejido. Uso de una versión modificada de un modelo de la regeneración del cabello 5, 6, 11, se puede lograr robusta ganancia o pérdida de la función de análisis en los queratinocitos primarios de ratón o células dérmicas para facilitar el estudio de epitelio-mesenquimales vías de señalización que conducen a la morfogénesis del folículo piloso . Se describe cómo aislar frescas queratinocitos primarios de ratón y células dérmicas, que contienen células de la papila dérmica y sus precursores, entregar lentivirus contaiNing ya sea shRNA o de ADNc a una de las poblaciones de células, y las células se combinan para generar completamente formados folículos de pelo en la espalda de ratones desnudos. Este enfoque permite el análisis de tejidos específicos de los factores necesarios para generar los folículos pilosos en tres semanas y proporciona un compañero rápida y conveniente a los actuales modelos genéticos.

En la Figura 1 se muestra el resultado de la dermis-específico desmontables shRNA lentiviral de Smoothened (Smo), un componente crítico de señalización de Shh, en un injerto de pelo 3 semanas de edad regenerativa. Injertos de control usando vector lentiviral solo muestran el crecimiento del cabello robusta (Figura 1A). Por el contrario, cutánea específica de caída de los resultados de DOM en pérdida de crecimiento del pelo (Figura 1B). Hematoxilina y eosina representa la etapa de folículos pilosos en el control y las condiciones experimentales (Figura 1C, D). El fenotipo de crecimiento del cabello de tratamientos similares puede ser variable entre los experimentos, incluyendo el control positivo con infección lentiviral vector solo. Por lo tanto injertos de control positivos siempre debe ser incluido en cada experimento como referencia como 30% de los injertos pueden fallar como resultado de la cicatrización o una inserción incompleta de injertos. En el caso de pruebas de una interacción entre dos factores tales como la sobreexpresión de cDNA de un factor de volverSCUE shRNA mediada desmontables de otro factor, uno siempre debe incluir injertos desmontables únicamente para manifestar el resultado de pérdida de función en cada experimento. Esto proporcionará una gama necesaria para determinar cómo un gen en particular perturba el folículo piloso vía regeneración y cómo dos genes interactúan. La eliminación de la cámara (Figura 2A) se debe hacer con cuidado. El injerto recién formado debe ser ligeramente opaco con una superficie mate (Figura 2B). El injerto puede adherirse a la cámara, por lo que levantando suavemente un lado es importante asegurarse de que el injerto permanece unida al lecho de la herida. El injerto es bastante estable después de tres días, y debe presentar poca dificultad cuando se retira el vendaje. El crecimiento del cabello sólido debe ser observada después de tres semanas (Figura 2C). La omisión de cualquiera de mDCs o KCS resultará en un sitio de la herida se recuperaron sin pelo (Figura 2D) 11. La muerte celular o pérdida de células en uno de lostipos de células también da como resultado ningún pelo, en contraste con la regeneración del cabello reducida en dermo-Smo desmontables como se muestra en la Figura 1B. Para garantizar un ensayo de éxito, es fundamental para lograr mayor que 90% de infección viral de las células con sobreexpresión apropiado o eficiencia desmontables antes del injerto. Debido a las limitaciones de tiempo del procedimiento de injerto, se recomienda Eliminación de perturbaciones eficiencias de infección viral antes de iniciar un experimento de injerto, y siempre guardar una pequeña porción de las células en el día de injerto procedimiento para verificar la pérdida o ganancia de expresión. Título lentiviral variará dependiendo de la construcción utilizada y debe ser determinado antes de la infección para conseguir 90-100% de eficiencia. Nos supervisar la eficiencia de la infección viral con GFP coexpressed a partir del vector lentiviral. En forma rutinaria realizar PCR cuantitativa y / o Western blot para determinar el alcance de desmontables o sobreexpresión. Utilizando la expresión de doble vectores con marcadores fluorescentes para etiquetarlas células infectadas viralmente proporciona una manera de informar perdurance de señal y el número de células que expresan los constructos en los injertos maduros. Usamos GFP dirigido por un promotor CMV del vector lentiviral pSicoR-CMV-GFP 10 en combinación con Smo shRNA. En la figura 3, se muestra un 3 semanas de edad dermo-injerto específico donde se lentivirally GFP-expresado en la papila dérmica de un folículo piloso representante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Figura 1. El análisis histológico de crecimiento del folículo piloso. (A) Vista de injerto de control de la regeneración del cabello con células dérmicas infectadas con el vector lentiviral vacío y queratinocitos no tratados. (B) desmontables Smoothened utilizando shRNA lentiviral en células dérmicas combinados con los resultados queratinocitos no tratados en la pérdida de los folículos pilosos. (C) Hematoxilina y eosina tinción muestra f cabello anágenoollicles en los injertos de control se extienden hacia abajo en la dermis y (D) Smoothened de folículos pilosos siendo desmontables retraso en el crecimiento y en gran parte ausente. Todas las imágenes son tres semanas después del injerto. La barra de escala indica 100 micras. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Figura 2. Injerto de células primarias. (A) nu / nu ratón con suturados alojamiento de cámara primarios células dérmicas y queratinocitos. (B) la eliminación de la cámara expone la piel recién formada que es opaco y opaco en el carácter. (C) pelos completamente crecido sobre injerto usando silvestre primaria Tipo de células dérmicas y queratinocitos a las tres semanas después del injerto. (D) Adición de células dérmicas primarias sin queratinocitos conduce a ningún pelo después de tres semanas. Se observan resultados similares con la adición de queratinocitos primarios sin células dérmicas. Figura 3. Mantenimiento de la expresión de GFP en papila dérmica. Confocal imágenes de papila dérmica de un injerto de 3 semanas de edad regenerado. GFP se expresó en la población de células dérmicas de un vector lentiviral y detectado en la papila dérmica (verde). Versican (rojo) demarca la papila dérmica y los núcleos se etiqueta con Hoechst (azul). Nota GFP se expresa específicamente en las células dérmicas, pero no en los queratinocitos circundantes. La barra de escala indica 20 m.

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Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Tejido análisis específico de un modelo de regeneración del folículo del pelo utilizando lentivirus para mediar ganancia o pérdida de función.

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K vistas.  Stanford University School of Medicine. Tejido análisis específico de un modelo de regeneración del folículo del pelo utilizando lentivirus para mediar ganancia o pérdida de función.

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Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

El apareamiento y la separación de la Tétrada Chlamydomonas reinhardtii Para el análisis genético

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Investigación

Biología

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

La disección de Gyrus dentado del hipocampo de ratones adultos

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Mediada por adenovirus eliminación de moléculas de señalización genética en cultivos de fibroblastos de embriones de ratón primaria

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Los ensayos farmacológicos y genéticos funcionales para manipular la regeneración de la planaria Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensión celular

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Extracción y análisis de cortisol de Derechos Humanos y de mono de pelo

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

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