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1。 0から2日間皮膚切開用オールド新生マウスを準備<ol><li>少なくとも20分間、CO 2チャンバーを用いた仔マウスを安楽死させる。解剖するまで最大1時間まで氷上に子犬のままにしておきます。古いマウスから調製した細胞は低い移植片収量がいる前駆容量を減らしているようにP0〜P2マウスを強くお勧めします。 70％エタノールの一皿（ステップ1.3）および洗浄溶液の3皿（ステップ3のために）皮膚切開を実行する準備を準備します。ディスパーゼソリューションを解凍し、4のままにしておく℃に子宮頸部は安楽死を確実にするために、CO 2露出オーバー後に子犬を脱臼。 </li><li>氷と無菌流フードへの転送上の培養皿に安楽死させた子犬を置きます。 </li><li>簡単に無菌培養皿に70％エタノールおよび場所に浸漬することによって、子犬を洗う。 </li></ol> 2。マウス皮膚を切開<ol><li>滅菌ハサミで胴体の付け根に各肢と尾を切り落とした。 </li><li> cuのペアの間にしっかりと身体を把握するrved鉗子基礎となる筋膜を貫通することなく頭からメスを用いて尾の背側の皮膚に沿って切り込みを入れる。 </li><li>慎重に持ち上げてマウスの正中線から皮膚の皮をむく。 </li><li>湾曲した鉗子の長辺でしっかりと露出してマウスを握り、マウスの後端に皮膚の下に湾曲した鉗子の別のペアを挿入し、ゆっくりとマウスの腹側半分に向かって腰の肌を引き出します。 </li><li>慎重に1滑らかな動きで完全にオフマウス皮膚剥離や死骸を捨てる。 </li></ol> 3。ディスパーゼソリューションで皮膚とインキュベートを洗う<ol><li>真皮側と洗浄液の最初の皿の中で皮膚を下に置きます。皮膚を広げてピンセットで撹拌します。次の皮膚を切開しながら洗浄溶液の第一皿に皮を残す。 </li><li>洗浄液の最初の皿の中で横に切開した皮膚を配置した後、洗浄液の第二の皿の前に肌を転送します。目でスキンを保つ電子第二洗浄液すべてのスキンが収集されるまで。最後の洗浄にスキンのすべてを譲渡、簡単に撹拌します。 </li><li>無菌10cmの培養皿に10mlの氷冷ディスパーゼを追加します。ディスパーゼソリューションに肌を転送し、皮膚真皮側を下にして平らにする。 </li><li> 4時8月16日時間のスキンをフロート℃（代替オプション：1時間、37℃）。 </li></ol> 4。別真皮と表皮<ol><li>新しい無菌培養​​皿に皮を転送し、皮膚真皮側を下にして平らにする。慎重にメスで1コーナーから真皮を押したままにします。 </li><li>ピンセットで表皮を握り、ゆっくりとはがし真皮から。表皮は1ピースとしてはがすべき。表皮は白と薄いであろうと真皮は、茶色がかった厚い、そしてゼラチン状である必要があります。 </li><li>独立した無菌培養皿に二つの組織を分離します。 <ol class="lalpha"><li>皮膚特異的な遺伝子ノックダウン/過剰発現は移植を行うには、真皮を取るとトンと非常に小さい部分にミンチWOのメス。表皮を破棄します。感染症（ステップ7）の日に、レンチウイルスに感染した皮膚細胞と組み合わせて、新鮮な未処理の表皮細胞を調製するために、マウスの皮の別のセットを解剖する。 </li><li>表皮特異的な遺伝子ノックダウン/過剰発現は移植を行うには、6に各表皮をスライス - 8小さなピースを。真皮を破棄します。感染症（ステップ7）の日に、レンチウイルスに感染した上皮細胞と結合するために、新鮮な未処理の真皮細胞を準備するために、マウスのスキンの別のセットを解剖する。 </li></ol></li></ol> 5。細分化した組織から初代マウス真皮細胞を（MDC）が解離する<ol><li> 1時間37℃で作りたてコラゲナーゼ溶液で皮膚片をインキュベートすることによって、MDCを解離する。子犬マウスあたりコラゲナーゼ溶液10mlを使用してください。 </li><li>優しく真皮を10分毎に含む溶液を混ぜる。顕微鏡下での解離の程度をチェックし、消化された細胞懸濁液は、主に単一細胞である必要があります。溶液は透明から曇りのように変更する必要があります真皮細胞は真皮から解離する。 </li><li>コラゲナーゼの活性を低下させるために10％の最終体積に真皮を含むコラゲナーゼ溶液にFBSを追加します。 </li><li>大型未消化塊と全体卵胞を除去するために新しい50 mlチューブに70μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を渡します。さらにコラゲナーゼを希釈するフロースルーの30ミリリットル当たりDMEM/10％FBSの10ミリリットルを追加します。 </li><li>遠心チューブは、さらに全体の卵胞を削除する5分間卓上遠心機で30 xgで消化された真皮を含む。 </li><li>慎重に、新しい50 mlチューブに上清を移す。 5分間卓上遠心機で200×gで遠心分離することにより細胞をペレット化。 </li><li> DMEM/10％FBS（子犬あたり1ml）とカウント細胞と細胞を懸濁。プレート感染のAmniomax C-100メディア（ステップ7）を持つ細胞、または（ステップ9）移植用レンチウイルスに感染したKCと結合する。典型的な収量は子犬あたり20×10 6個の細胞である。 </li></ol> 6。プライマリケラチノサイトの関連付けを解除細分化した組織からの（KC） <ol><li> 15分間37℃で新たに解凍0.05％トリプシン-EDTAで表皮片をインキュベートすることによりKCを解離する。子犬マウス当たりトリプシン-EDTAの7ミリリットルを使用しています。 </li><li>表皮ごとに5分を含む静かに回してソリューションを提供します。 </li><li>トリプシンの活性を低下させるトリプシン-EDTAを含む表皮に中和溶液の等量を追加します。 </li><li> 5分間卓上遠心機で200×gで遠心分離することにより細胞をペレット化。残りの未消化の組織が上に浮くはずです。 </li><li>慎重に消化されていない組織で上清の大部分を取り除く。妨害することなく、細胞ペレットを10mlのピペットを用いて残りの上清を取り除きます。 PBSで細胞ペレットを再懸濁します。ケースKCSで完全にペレット化していない、上清の大半を捨て、細胞の大部分をペレットになるまで遠心操作を繰り返します。 </li><li>残りの組織または凝集塊を除去するために新しい管に70μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液をこす。 </li><li>遠心分離により細胞をペレット化5分間卓上遠心機で200×gで。 </li><li> CNT-07メディアまたはPBS（子犬あたり1ml）とカウント細胞内で細胞を懸濁。感染細胞をプレーティングする（ステップ7）のためにCNT-07を使用し、（ステップ9）移植のためのレンチウイルス感染MDCSと結合するためにPBSを使用しています。典型的な収量は子犬当たり3から10×10 6個の細胞である。 </li></ol> 7。 shRNAまたはcDNAを含むレンチウイルスで初代培養細胞に感染感染の当日（ステップ9）移植当日のウイルスに感染した細胞と結合する、新鮮な未処理のプライマリKCSまたはMDCを準備するために、マウスのスキンの別のセットを解剖する。 <ol><li><ol class="lalpha"><li> MDCのため、プレート4×10で37 AmnioMAX-C100メディアインキュベートした10 cmのプレート当たり6 MDCS°C〜50％の細胞密度で翌日感染の+ 5％のCO 2。通常のMDCの3-4プレートは1片を生成するために使用されており、10月12日のプレートの合計は、1つの実験では3の移植片を生成するために必要とされています。あるいは、MDCがfを添付し、広めることができまたは37℃で2時間の最小℃+ 5％CO 2及び感染症の細胞播種の同じ日に行う。 MDCは線維芽細胞様の形態を持つことになります。 </li><li> KCのために、プレート12×10で37 CNT-07メディアインキュベートした10 cmのプレート当たり6 KC℃の翌日感染の+ 5％のCO 2。あるいは、KCは添付して2時間の最小値に対して広がる37℃+ 5％CO 2と同じ日に感染を実行できます。 KCの通常3から4プレートは、1片の生成に使用されます。 10月12日のプレートの合計は、1つの実験のための3つの移植片を生成するために必要とされています。 KCSは、石畳の形態を持つことになります。 </li></ol></li><li> 37℃で8μg/ mlのポリブレンソリューション℃+ 5％CO 2で5〜10分間細胞をPreincubate。 </li><li>交換媒体とレンチを追加するには、[+ 8μg/ mlのポリブレンソリューション。レンチウイルス力価は、構築に使用され、感染する前に決定されるべきであるに応じて異なります。 </li><li> 32℃で1時間卓上遠心機で200×gでプレートを遠心°;レンチウイルスで細胞を感染させるために、C。 </li><li>レンチウイルス含有培地を取り除き、新鮮な培地を追加します。 KCは、新鮮な培地を添加する前に戻ってPBSで一回細胞を洗浄する。通常、感染した細胞は37℃で±5％のCO 2を一晩回復。あるいは、移植片のために細胞をトリプシン処理前℃+ 5％のCO 2で37回復の少なくとも2時間を可能にします。代表的な結果セクションで説明したように、感染効率を確認するために、培養感染細胞の小さな部分に進みます。 </li></ol> 8。グラフト感染した細胞を準備する<ol><li>手順4〜6を使用して皮膚からの新鮮な一次MDCSまたはKCSを分離します。氷冷滅菌PBS中に再懸濁します。細胞をカウントする。 </li><li><ol class="lalpha"><li>皮膚特異的な遺伝子ノックダウン/過剰発現は移植のために、8分間37℃で0.05％トリプシン-EDTAを用いてプレートから感染したMDCを解離する。 </li><li>表皮特異的な遺伝子ノックダウン/過剰発現は移植のために、プレートUSIから感染KCを解離で、37 ngの0.125パーセントトリプシン-EDTA℃で15分間インキュベートする。 </li></ol></li><li> DMEM + 10％FBS（MDC）がまたは中和溶液（KC）を使用して、トリプシン活性を中和する。 50mlチューブにトリプシン処理した細胞を移す。 </li><li> 5分間卓上遠心機で200×gで遠心分離することにより細胞をペレット化。 </li><li>氷冷滅菌PBS中に再懸濁します。細胞をカウントする。 </li><li>作りたての未処理相手細胞型とウイルスに感染した細胞を兼ね備えています。 1グラフトは、4℃で氷冷滅菌PBSおよびペレット卓上遠心機で細胞スラリーで7から10×10 6 KCSと7月10日×10 6 MDCを組み合わせる50〜100μlの氷冷滅菌PBSに細胞を再懸濁する。 nu / nuマウス室は準備が整うまで、氷上で細胞を維持。 </li></ol> 9。 nu / nuマウスの背面に創傷床とFix商工会議所を作成移植前日に、70％エタノールに浸漬することによって、オートクレーブ滅菌したシリコン室と手術器具を滅菌する。 70％ETHAを交換チャンバーを使用する前に滅菌PBSでNOL。 <ol><li>腹腔内注射（100μl/10g体重）または他の好適な方法を介して、ケタミン（8 mg / ml）を/キシラジン（1.6 mg / ml）を用いて麻酔nu / nuマウス（7-12週齢の雌）。眼潤滑剤を適用します。マウスの下に加熱パッドを配置します。 </li><li>ヨウ素でヌードマウスの背部皮膚の消毒、アルコール綿棒で清掃してください。 </li><li> 1-3局所切開部位に0.25％Bupivicaineをドロップに追加します。ピンセットで首の付け根にヌードマウスの背部皮膚をつまむ。 </li><li>滅菌ハサミで挟ま皮膚の小さな円形の穴（直径約1cm）を切り取ります。 </li><li>創傷床の上に無菌室を置き、周囲の皮膚とチャンバーの縁をカバーしています。 </li><li> 図2Aに示すように、チャンバの縁に沿って縫合（チャンバーあたり6ステッチ）に近い場所にセキュア室。 </li><li>室の準備ができている、優しくスワール細胞スラリーと1mlのシリンジに取り付け23ゲージの針に策定する。細胞スラリーは優しく、下部に凝縮されている場合針に描画する前に1ミリリットルピペットチップで再懸濁する。 </li><li>穿刺針を有するチャンバとゆっくり傷口に細胞を垂れる。 </li><li>クリーン、オートクレーブしたケージにマウスを置きます。ハウスケージあたり2マウスおよび水を飲むには、抗生物質やタイレノール（3 mg / ml）を加える。我々の経験では、ケージあたり2匹の雌マウスは、チャンバ、グラフト、または動物に有害な外傷をもたらしていない。 </li><li> 2分の1ケージの下温暖化パッドを置き、麻酔が切れるまでマウスを観察します。 </li></ol> 10。 7-9日後チャンバーを取外す<ol><li>ステップ9.1のようにチャンバーnu / nuマウスを麻酔。眼潤滑剤を適用します。 </li><li>ヨウ素とチャンバー周りの皮膚を消毒し、アルコール綿棒で清掃してください。 </li><li>慎重にステッチをカットし、チャンバから取り除く。 </li><li>優しくマウスからチャンバーを取外す。室に新しい皮膚移植スティック場合は、鉗子を用いてチャンバからチャンバの一部と優しく別個移植を持ち上げます。チャンバーの取り外し作業中には、移植を押したままにします。グラフトはトイレべき図2Bのようにkの鈍いと不透明。 </li><li>カチッと開いた傷口や縫合糸（2ステッチ）に対する抗生物質の薄膜と非接着パッドを適用します。 </li><li>パッドを固定し、傷口を保護するために、マウスの周りに包帯を巻きつけます。所定の場所に包帯を縫合。 </li><li>シリコン室は、薄い中性洗剤で洗浄することにより洗浄し、徹底的に脱イオン水で洗浄する。一晩70％エタノールでチャンバー、空気乾燥しており、店舗を浸す。 </li></ol> 11。毛の成長のためのマウスを調べ<ol><li>チャンバー除去の3日後に包帯やパッドを取り外します。移植片は乾燥して褐色に不透明でなければならない。 </li><li>髪の成長のために定期的にマウスを確認してください。髪は移植後16日目に表示するように開始する必要があります。 </li></ol>手順の概要 1日目は（2〜3時間）、生まれたばかりの子犬を生け贄に皮膚を除去し、4℃で一晩ディスパーゼに残す。 2日目（2〜3時間）：皮膚から初代培養細胞を分離し、推奨細胞密度でプレート。 3日目（3〜4時間）：レンチウイルスで細胞を感染させる。生まれたばかりの子犬の別のセットから皮膚を除去し、4℃で一晩ディスパーゼに残す。 4日目（6-8時間）：皮膚からの初代細胞を分離し、数えて、氷の上に残す。トリプシン処理し、遠心分離によりレンチウイルスに感染した細胞を回収し、カウントし、移植あたりのPBSを50から100μLに7から10×10 6真皮細胞及びケラチノサイトを兼ね備えています。マウスの創傷床を作成し、チャンバーを取り付け、床に傷を細胞混合物を適用します。 代替手順のアウトライン代替手順のアウトラインは、4日から3までの手順を短縮することができます。 <ol><li> 1時間（予定時刻5から7時間）37℃でディスパーゼでマウスの皮を処理することにより、1日目​​と2日目を兼ね備えています。 </li><li> 2時間めっきセル（推定時間5月7日時間）後にレンチウイルスで細胞を感染させることにより、2日目と3日目を兼ね備えています。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

髪の再構成アッセイは、de novoの毛包形成のメカニズムを調べるためのユニークな臓器再生のモデルを提供します。ここでは、毛包形成における遺伝子の機能を決定するために有用で修正されたチャンバー髪アッセイを説明します。我々のアッセイは、我々はどちらかの真皮または表皮の細胞型において遺伝子の過剰発現またはノックダウンを達成するためのレンチウイルス発現技術を導入するために変更された報告室ヘア再構成アッセイ5、6,11、に基づいています。我々のアッセイは、組織特異的遺伝子ノックアウトを生成するために迅速な代替手段を提供します。このアッセイは、私たちは移植コレクションにレンチウイルスで初代細胞を感染から、わずか3週間で毛包形成における遺伝子機能を発揮することができます。我々のアッセイが1つの細胞型12にレンチウイルスによって組み合わせのshRNA / cDNAの配信を使用して遺伝的相互作用に対処するために拡張することができるだけでなく、真皮と表皮細胞の代表値との間のシグナリングの検査を可能にするES。 微妙な欠陥が観察しにくいですしながら私たちの髪アッセイは最高の、毛包の再生に強いゲインまたは機能喪失表現型を検出するのに適しています。我々は正常に私たちの毛髪再生アッセイ1,12を使用していくつかの遺伝子の真皮の特定の遺伝子の機能を明らかにした。 GFPマーカーに基づいたshRNAの10を発現するレンチウイルスベクターからの共発現は、ドナーの皮膚細胞を発現shRNAが再生された毛の移植に固執していることを実証した。 GFP陽性細胞は、再生毛包の毛乳頭（DP）（ 図3）で存在していた。細胞はGFPのさまざまなレベルを表現したのであるDP細胞はおそらく遺伝子ノックダウンの異なるレベルから成っていた、このように観察された毛包の表現型はnullに遺伝わい小体型の範囲であった。 このアッセイのための1つの改善はgraftin前に高shRNAを発現する細胞のための迅速かつ効率的な選択を確立することであろうグラム強いGFP発現細胞を精製するためにFACSを使用するなど。代替案は、このアッセイ9に変異または条件付きノックアウト細胞を置き換えることです。一次皮膚細胞は継代培養された後DPの効力が徐々に失われるので、一方に、DP細胞機能を維持することができる培養システムは非常に便利です。潜在的な培養システムは、人工ニッチまたは集約文化2,7,8,13由来生体材料の使用が含まれる。もう一つの改善点は、これは皮膚固有の損失またはで新鮮ケラチノサイト生成する仔マウスの第2のセット（ステップ7）の使用量を削減するように高い細胞回収率を持つ信頼性の高い表皮細胞凍結法の利得のを生成することになります機能研究。 髪の成長がやや少ない同期化され、卵胞の向きがよりランダムですが、このチャンバー髪アッセイは、毛包の密度と通常のマウスの皮膚と同様の品質を生成します。毛髪再生遺伝アッセイ含めたいくつかの制限電子レンチウイルスと細胞数の大量の要件、そして、それはそのようなパッチやフラップアッセイ3,4,14など髪の再構成アッセイの他の形態に比べて外科的方法の面で非常に集中的な労働である。しかし、髪の成長を検出するために毛包とタイムラインの品質は他のアッセイ4よりも優れています。私たちのターゲットと毛髪再生アッセイは、既存の遺伝的モデルへの迅速かつ便利なコンパニオンを提供しています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン-EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> CNT-07 </td><td>セルNテック</td><td> CNT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td>インビトロジェン</td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100の補足</td><td>インビトロジェン</td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>ファンギゾン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>ロッシュ</td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、タイプ1 </td><td>シグマ</td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>シグマ</td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td>組織培養ディッシュ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td>解剖用はさみ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 11から999 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 10から275 </td><td>湾曲した</td></tr><tr><td> Scalpal </td><td>メデックスサプライ</td><td> GRF-2975＃10 </td><td>サイズはありません。 10 </td></tr><tr><td> 70μmの細胞染色装置</td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15mlコニカル遠心管</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14から959-49D </td><td></td></tr><tr><td>アルコール綿棒</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23ゲージの針</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14から821-13F </td><td></td></tr><tr><td>瞳の潤滑剤</td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone-lodineスワブ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td>シリコンチェンバース</td><td>レナー社</td><td> F2U、30268 </td><td></td></tr><tr><td>縫合</td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td>柔軟性のある包帯</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td>非接着性包帯</td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 材料 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 洗浄液 PBS 500μg/ mlのペニシリン/ストレプトマイシン 12.5μg/ mlのファンギゾン 100μg/ mlのゲンタマイシン ディスパーゼソリューション HBSS 2.5 mg / mlの最終ディスパーゼ 100μg/ mlのゲンタマイシン 中和メディア HBSS 15％（v / v）のFBS コラゲナーゼ溶液 0.25％（w / v）のコラゲナーゼ、タイプ1 ontent &quot;&gt; 100μg/ mlのペニシリン/ストレプトマイシン 2.5μg/ mlのファンギゾン 50μg/ mlのゲンタマイシン ポリブレンソリューション HBSS 8μg/ mLで（w / v）のポリブレン</td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

毛包の形態形成、上皮由来ケラチノサイトと基礎の間充織間の相互作用を必要とする複雑なプロセスは、器官形成および組織特異的シグナル伝達を研究するための魅力的なモデル系である。毛包の発達は、遺伝的に扱いやすいですが、このプロセスのための本質的な要因を迅速かつ再現性の分析が課題として残されている。ここでは、ターゲットに過剰発現または組織特異的にレンチウイルスを用いた要因のshRNAによるノックダウンを生成する手順について説明します。毛髪再生モデル5、6、11の修正版を使用して、我々は、毛包の形態形成につながる上皮間葉シグナル伝達経路の研究を促進するために、堅牢なゲインまたはプライマリマウスケラチノサイトや真皮の細胞における機能喪失型の分析を実現することができます。我々は、レンチウイルスcontaiを届ける、毛乳頭細胞やその前駆体を含む新鮮な一次マウスケラチノサイトおよび真皮細胞を分離する方法について説明し細胞集団の一つにshRNAまたはcDNAのどちら寧、およびヌードマウスの背中に完全に形成された毛包を生成するためにセルを結合します。このアプローチでは、三週間以内に、毛包を生成するために必要な組織特異的な要因の分析を可能にし、既存の遺伝モデルに迅速かつ便利なコンパニオンを提供しています。

図1に我々は、3週齢回生毛移植では、平滑化（SMO）、重要Shhのシグナル伝達成分の経皮特有のレンチウイルスshRNAノックダウンの結果を示す。単独でレンチウイルスベクターを用いて、制御グラフトは堅牢な髪の成長（ 図1A）を示しています 。髪の成長の損失Smoの結果とは対照的に、皮特有のノックダウン（ 図1B）。ヘマトキシリン·エオシン染色は、対照群と実験条件における毛包の段階（ 図1C、D）を示しています。同様の治療から髪の成長の表現型は、レンチウイルスベクター単独感染陽性コントロールを含む、実験間で可変することができます。したがって陽性対照の移植は常に移植片の30％が瘢痕化や移植片の不完全な添付ファイルの結果として失敗することがありますように、基準として全ての実験に含まれるべきである。再1因子のcDNAを過剰発現しているような、2つの因子間の相互作用をテストする場合は、別の要因のSCUEのshRNAによるノックダウン、1つは常に単独グラフトマニフェストにノックダウン、各実験における機能喪失型の結果を含める必要があります。これは、特定の遺伝子が、毛包の再生経路を乱す方法と、2つの遺伝子がどのように相互作用するかを決定するために必要な範囲を提供します。 チャンバー（ 図2A）の除去は慎重に行わなければなりません。新たに形成されたグラフトは鈍い面（ 図2B）とわずかに不透明でなければならない。移植は、移植片が創傷床に接続されたままで確認することが重要ですので、そっと片側を持ち上げると、チャンバに固執することがあります。グラフトは3日後にはかなり安定していて、ドレッシングを取り外すときに少し難しさを提示しなければならない。堅牢な髪の成長は、3週間後（ 図2C）後に観察されるべきである。 MDCSまたはKCSのどちらかを省略すると、任意の毛（ 図2D）11なしで回復した創傷部位になります。のいずれかで、細胞死や細胞の喪失図1Bに示すように、細胞の種類も真皮Smoのノックダウンの減少毛髪再生とは対照的に、無毛をもたらす。 成功したアッセイを確保するためには、移植する前に、適切な過剰発現またはノックダウン効率が90％以上の細胞のウイルス感染を達成するために重要です。移植手順の時間的な制約のために、我々は移植実験を開始する前に、トラブルシュートはウイルス感染効率を推奨し、常に損失または利得の発現を確認するための手順を移植当日に細胞の小さな部分を保存します。レンチウイルス力価は、構築物に使用され、90〜100％の効率を達成するために、感染する前に決定されるべきであるに応じて異なります。我々は、レンチウイルスベクターからGFPを共発現させ、ウイルス感染効率を監視する。我々は日常的に定量PCRおよび/またはウェスタンブロットを行うノックダウンまたは過剰発現の程度を決定する。ラベルを付けるために蛍光タグでデュアル発現ベクターを利用したウイルス感染した細胞シグナルと成熟した移植片で私たちの構築物を発現する細胞の数のperduranceを報告するための方法を提供します。我々は、SMOのshRNAとの組み合わせでレンチウイルスベクターpSicoR-CMV-GFPを10からCMVプロモーターによって駆動されるGFPを使用しています。 図3では、我々はGFPを代表する毛包の毛乳頭にlentivirally発現されている3週齢皮膚固有の移植を示す。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> 図1。毛包の成長の組織学的分析（A）空のレンチウイルスベクターおよび未処理ケラチノサイトに感染して皮膚細胞と制御毛髪再生グラフトの表示（B）平滑ノックダウンは、毛包の損失未処理ケラチノサイトの結果と組み合わせて真皮の細胞にレンチウイルスshRNAを用いた。 （C）はヘマトキシリン·エオシン染色は、成長期毛fを示していますコントロール移植片におけるolliclesは真皮に分け拡張し、（D）は平滑ノックダウン毛包がいじけたままで、大部分は不在。すべての画像は、3週間後に移植されています。スケールバーは100μmを表します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> 図2。初代細胞を移植。縫合チャンバハウジングプライマリー真皮細胞とケラチノサイトとの（）nu / nuマウスは、（B）室の除去は、文字に鈍いと不透明で、新たに形成されたスキンを公開しています。野生を使用して移植に（C）が十分に成長した毛移植後3週目で一次真皮細胞とケラチノサイトを入力します（D）はケラチノサイトせず、一次皮膚細胞を添加すると、3週間後に無毛につながる。同様の結果は、真皮細胞のない一次ケラチノサイトを加えて見られている。 図3。 3週齢の再生された移植片から毛乳頭の乳頭におけるGFP発現のメンテナンス。共焦点画像。 GFPは、レンチウイルスベクターから真皮の細胞集団に発現し、真皮乳頭（緑）で検出された。バーシカン（赤）が毛乳頭と核はヘキスト（青）を持つラベルであった境界が設定されます。 （注）GFPは真皮細胞ではなく、周囲のケラチノサイトに特異的に発現されています。スケールバーは20μmを表す。

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Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

ゲインまたは機能喪失を媒介するためにレンチウイルスを用いて、毛包の再生モデルの組織特異的分析。

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K ビュー.  Stanford University School of Medicine. ゲインまたは機能喪失を媒介するためにレンチウイルスを用いて、毛包の再生モデルの組織特異的分析。

ビデオ: Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

発生生物学

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported for in vitro differentiation of keratinocytes cultured in two-dimensional (2D) submerged manners using various induction conditions. Described here is a procedure for 2D in vitro keratinocyte differentiation method by contact inhibition and subsequent molecular characterization by RNA-seq. In brief, keratinocytes are grown in defined keratinocyte medium supplemented with growth factors until they are fully confluent. Differentiation is induced by close contacts between the keratinocytes and further stimulated by excluding growth factors in the medium. Using RNA-seq analyses, it is shown that both 1) differentiated keratinocytes exhibit distinct molecular signatures during differentiation and 2) the dynamic gene expression pattern largely resembles cells during epidermal stratification. As for comparison to normal keratinocyte differentiation, keratinocytes carrying mutations of the transcription factor p63 exhibit altered morphology and molecular signatures, consistent with their differentiation defects. In conclusion, this protocol details the steps for 2D in vitro keratinocyte differentiation and its molecular characterization, with an emphasis on bioinformatic analysis of RNA-seq data. Because RNA extraction and RNA-seq procedures have been well-documented, it is not the focus of this protocol. The experimental procedure of in vitro keratinocyte differentiation and bioinformatic analysis pipeline can be used to study molecular events during epidermal differentiation in healthy and diseased keratinocytes.

Presented here is a stepwise procedure for in vitro differentiation of human primary keratinocytes by contact inhibition followed by characterization at the molecular level by RNA-seq analysis.

RNA-Seq解析によるヒト原発性角化細胞のインビトロ分化の特徴

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

遺伝学

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of TGF-&#946; signaling can lead to breast cancer. TGF-&#946; elicits its effects on proliferation and differentiation via specific cell surface TGF-&#946; type I and type II receptors (i.e., T&#946;RI and T&#946;RII) that contain an intrinsic serine/threonine kinase domain. Upon TGF-&#946;-induced heteromeric complex formation, activated T&#946;RI elicits intracellular signaling by phosphorylating SMAD2 and SMAD3. These activated SMADs form heteromeric complexes with SMAD4 to regulate specific target genes, including plasminogen activation inhibitor 1 (PAI-1, encoded by the SERPINE1 gene). The induction of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) allows epithelial cancer cells at the primary site or during colonization at distant sites to gain an invasive phenotype and drive tumor progression. TGF-&#946; acts as a potent inducer of breast cancer invasion by driving EMT. Here, we describe systematic methods to investigate TGF-&#946; signaling and EMT responses using premalignant human MCF10A-RAS (M2) cells and mouse NMuMG epithelial cells as examples. We describe methods to determine TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation by Western blotting, SMAD3/SMAD4-dependent transcriptional activity using luciferase reporter activity and SERPINE1 target gene expression by quantitative real-time-polymerase chain reaction (qRT-PCR). In addition, methods are described to examine TGF-&#946;-induced EMT by measuring changes in morphology, epithelial and mesenchymal marker expression, filamentous actin staining and immunofluorescence staining of E-cadherin. Two selective small molecule TGF-&#946; receptor kinase inhibitors, GW788388 and SB431542, were used to block TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation, target genes and changes in EMT marker expression. Moreover, we describe the transdifferentiation of mesenchymal breast Py2T murine epithelial tumor cells into adipocytes. Methods to examine TGF-&#946;-induced signaling and EMT in breast cancer may contribute to new therapeutic approaches for breast cancer.

We describe a systematic workflow to investigate TGF-&#946; signaling and TGF-&#946;-induced EMT by studying the protein and gene expression involved in this signaling pathway. The methods include Western blotting, a luciferase reporter assay, qPCR, and immunofluorescence staining.

乳がんおよび正常細胞におけるTGF-βシグナル伝達とTGF β誘発性上皮間葉間質転移の研究

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

がん研究

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

マウス皮膚や毛包パターニングおよび感覚軸索形態の解析への応用のフラットマウントイメージング

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

神経科学

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

頭蓋顔面の開発時には外胚葉上皮のシグナリング特性を評価する

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

生物学

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...