Este trabajo fue apoyado por el Estado de Nueva York Departamento de Salud (C026878). SM fue un New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Apoyado en parte por Beca de Investigación N º 5-FY11-571 de la March of Dimes Foundation.

1. Preparación de células de alimentación Tenga en cuenta que todos los reactivos descritos a continuación deben ser preparados en forma estéril (ver Tablas 1 y 2). Este protocolo emplea la línea celular JK1 (célula Biolabs, Inc., catálogo # CBA-315) como alimentadores que es un derivado transformado de células adultas de ratón testiculares somáticos y se ha descrito en otra parte 3. Tenga en cuenta también que todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales y reglamentos. <ol><li> JK1 células pueden mantenerse en cultivo y se usaron con éxito como alimentadores hasta el paso 39. Cultura JK1 células en una placa de cultivo de 100 mm celular (BD Falcon, catálogo # 353003) con 10 ml de medio de filtro esterilizado alimentador crecimiento (DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal [FBS], 2 mM L-glutamina y antibióticos). Cuando el cultivo alcanza el 95% de confluencia, dividir las celdas 1:06 -1:10 ratio. </li><li> Eliminar el medio de confluente JK1 mono célula alimentadoracapa. </li><li> Lavar la capa de células una vez con PBS sin calcio y magnesio. </li><li> Añadir precalentado tripsina / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, catálogo n º 25-051-CI), y se incuba a 37 ° C durante 5-10 minutos. </li><li> Inactivar la tripsina con un volumen igual de medio de crecimiento alimentador. Recoger las células y se centrifuga a 300 xg durante 5 min. Volver a suspender las células en un medio alimentador de crecimiento. </li><li> Capa Pre-placas de múltiples pocillos de cultivo celular mediante la adición de suficiente solución de gelatina 0,4% para cubrir el pozo y eliminar después de 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Placa de ~ 250 células por mm 2 en recubierta con gelatina placa de cultivo celular (por ejemplo, formato 48-y 6 o bien-). Incubar cultivo a 37 ° C durante 16 a 24 h. </li><li> Retire el medio de cultivo de los pozos. PRECAUCIÓN: Para inactivar el crecimiento de células, añadir una solución fresca de mitomicina C a 10 ug / ml diluidos en DMEM a cada pocillo (por ejemplo 200 l / pocillo de una placa de 48 pocillos). Mitomicina-C es tóxica. Manipule y deseche con cuidado. Incubar a37 ° C durante 4 horas. </li><li> Eliminar mitomicina-C solución de células. Lavar 3 veces con DMEM antes de células madre de galvanoplastia. </li><li> Eliminar DMEM alimentador de células pocillos y añadir suficiente medio de células madre (100 l / pocillo de una placa de 48 pocillos; véase la Tabla 3) para prevenir la desecación de los comederos durante pasajes. Añadir SSC el mismo día, como se describe a continuación en las secciones 3,1 o ​​3,4, usando tamaños indicados de los pocillos que contienen alimentadores. </li></ol> 2. La disociación de ratón tejido testicular para obtener células germinales de los donantes <ol><li> Cosecha de testículos de ratones adultos en forma estéril y almacenar temporalmente los testículos en una cubierta de placa de Petri (sin adición de líquido). El plato debe colocaron inmediatamente en hielo para prevenir la desecación y mantener la viabilidad celular. </li><li> Utilizando pinzas estériles finos y una tijera bien en una campana de cultivo de células, hacer una incisión transversal en la túnica albugínea completamente sin seccionar el testículo (es decir, cortado ~ ½ - ¾ distancia Through) y usar fórceps para exprimir los túbulos seminíferos en una esquina de la placa; túnica de descarte y el tejido adjunto. Mantenga la placa de hielo en todas partes para mantener el tejido refrigerados, manteniendo así su integridad y prevenir la evaporación. </li><li> Pique rápidamente túbulos con tijeras finas de resorte al menos 3 min por testículo, mientras se mantiene la placa en hielo. </li><li> Recoger los fragmentos tubulares en un tubo cónico de 50 ml y se lava en ~ 40 ml de suero refrigerado PBS / 1% de albúmina bovina. </li><li> Centrifugar a 60 xg durante 10 minutos para separar fragmentos de los túbulos de los espermatozoides y los escombros. Desechar el sobrenadante. </li><li> En un tubo cónico de 15 ml, resuspender el sedimento en 3 ml por testículo de pre-calentado tampón de disociación (DMEM, 0,05% de tripsina, 0,03% de colagenasa tipo I, 80% U / ml de DNAsa I y 0,5 albúmina de suero bovino; Ver Tabla 2 para detalles más específicos de tampón de disociación). </li><li> Colocar el tubo cónico horizontalmente en un bastidor en un conjunto agitador a 150 rpm a 37 ° C durante 15 min para maximizar unagitation. </li><li> Centrifugue a 60 xg durante 10 minutos para separar las células individuales de trozos no disociadas. </li><li> Guardar los trozos de pellets que contienen hasta el siguiente paso. Recoger el líquido sobrenadante de la Etapa 2,8 y añadir 3 ml de DMEM/10% de suero fetal bovino para neutralizar tampón de disociación. Coloque el tubo en hielo temporalmente. </li><li> Repita los pasos 2,6 a 2,7 con el salvado de pellets desde el paso 2.9 para volver a digerir los trozos que quedan después del paso 2.8. </li><li> Añadir un volumen igual de FBS DMEM/10% para neutralizar tampón de disociación. </li><li> Recombine suspensión de la etapa 2,11 con suspensión de células salvado de paso 2,9. Centrifugar durante 5 min a 300 x g. </li><li> Resuspender el sedimento en medio de células madre en un volumen de 16 ml por cada par de testículos (ver Tabla 3). </li></ol> 3. Revestimiento de suspensión de células de testículo <ol><li> Placa de 2 ml de la suspensión celular por pocillo en una placa de 6-y que contiene células alimentadoras-mitóticamente inactivados con mitomicina-C y colocar en una incubadora de cultivo celular a 37 ygrados; C en 5% CO 2. </li><li> Después de 48 horas, el medio aspirado, añadir 2 ml de medio fresco y volver a la incubadora. </li><li> Después de 48 horas, añadir 0,5 ml de medio fresco de células madre a cada pocillo y retorno a la incubadora. </li><li> Después de 48 h, posteriormente se alimentan a las células tres veces por semana a partir de entonces como sigue hasta que las colonias grandes y discretas (&gt; 50 células) aparecen (dentro de 7 a 21 días). Por primera y segunda alimentación de cada semana (por ejemplo, Lunes y Miércoles) eliminar ~ 50% del medio y añadir de nuevo 50% en volumen de medio fresco. Para la alimentación tercero (por ejemplo, viernes), aspirar todo el medio y reemplazarlo con 2 ml de medio fresco. Este enfoque se basa en el razonamiento de que la evitación de cambios de medio completo minimiza fluctuaciones en las concentraciones de paracrina señales que son secretados al medio de cultivo 9. </li></ol> 4. Colony Picking primer paso para <ol><li> Eliminar el medio de los pocillos con colonias que se passaged y añadir medio fresco de células madre. </li><li> Identificar las colonias utilizando un objetivo de 10x. Con el microscopio ligeramente de-centrado, colonias SSC en el borde del pozo aparecerá como homogéneas brillantes racimos, que constan de muchas células de 11-12 micras de diámetro, en las que es difícil o imposible de discernir los bordes de las celdas individuales, ya que las células aparecen fusionados juntos (Figura 1A). Non-SSC colonias pueden aparecer más oscuras, más granular, o menos homogénea, con fronteras perceptibles (Figura 1A, cuadro). </li><li> Utilizando una punta de pipeta 200 l, con el conjunto pipetteman a 50 l, en primer lugar tomar medio del pozo y expulsar a mojar la punta. A continuación, empujar suavemente la colonia con la punta antes de que la suspensión rápida 50 l de medio para desalojar la colonia por succión en la punta (Figura 1B). </li><li> Expulsar el medio que contiene la colonia en un pocillo de una placa de 48-y que contiene células inactivadas de alimentación con 100 l de medio de células madre (Figura 1C). </li><li> Repita el paso4,3 y agregar hasta 8 colonias en el mismo pozo sin igual a 500 l por pocillo. </li><li> Repetir los pasos desde 4,3 hasta 4,5 para preparar pozos adicionales de la placa de 48 pocillos con colonias pasaje SSC. </li><li> Wells estará listo para dividir en 7-14 días o después de grandes cúmulos de hasta 500 células han surgido (Figura 1D). </li></ol> 5. La expansión posterior y Propagación de las ESC por trituración <ol><li> Las células en el paso uno debe ser subcultivado en alimentadores frescos después de hasta 14 días a una relación de división de 1:2 durante los primeros 3 pasajes y luego 01:04-01:06 (cada 7 días) después de la siguiente manera. Suavemente triturar colonias en marcha un pozo semi-confluentes (por ejemplo, ~ 300.000 SSC / pocillo de 6-así placa) con una punta de pipeta de 1 ml por medio de lavado a través de las células. Las colonias pueden observarse desprendimiento. Demasiada fuerza con la corriente de líquido hará que las células no deseadas de alimentación a salir también. </li><li> Recoger las células se muelen en un tubo cónico y se centrifuga a 300 xg durante5 min. Nota: Un paso tripsinización puede ser añadido de forma segura aquí si se desea por el investigador. </li><li> Aspirar el sobrenadante y volver a suspender en medio fresco de células madre a fondo por pipeteo hacia arriba y hacia abajo para interrumpir colonias. </li><li> SSC placa en células alimentadoras recién preparados inactivados con mitomicina-C como se describe en la sección 1. </li><li> Alimentar a las células tres veces por semana como sigue. Para la alimentación primero y segundo (por ejemplo, Lunes y Miércoles) añadir 50% en volumen de medio fresco. Para la alimentación tercero (por ejemplo, viernes), aspirar todo el medio y reemplazarlo con 2 ml de medio fresco. Las placas se hacen confluentes en 7-10 días. Los cultivos deben estar compuesta de células germinales&gt; 98% (es decir, &lt;1% la contaminación de células somáticas) después de pasajes 5-7, basado en la inmunotinción (por ejemplo, utilizando el murino de células germinales marcador GCNA) para distinguir las células germinales a partir de células somáticas 10. Nota: Estos métodos fueron desarrollados en cumplimiento de las normas y requisitos establecidos por la Instituciónal Cuidado de Animales y el empleo Comisión en el Weill Cornell Medical College. </li></ol>

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	<li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+proliferation+in+culture+and+germline+transmission+of+mouse+male+germline+stem+cells.">Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells.</a> Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).</li><li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125++germline+progenitors.">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li><li>Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++testicular+stromal+cells+support+long-term+expansion+of+embryonic+and+adult+stem+and+progenitor+cells.">CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.</a> Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).</li><li>Ogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+morphological+characterization+of+mouse+spermatogonial+stem+cell+lines.">Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+aging+is+detrimental+to+mouse+spermatogonial+stem+cell+function.">In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function.</a> Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).</li><li>Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+male+germ+line+stem+cells+in+mice.">Aging of male germ line stem cells in mice.</a> Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).</li><li>Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. 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MS cánones de Weill Cornell Medical College a través de una licencia para la célula Biolabs, Inc. para distribuir JK1 células.

Este método para derivar las ESC adultos con testículos adultos derivados de células de alimentación es robusto y ha tenido éxito cuando comunes orígenes genéticos (por ejemplo FVB, C57BL6 y mixtos 129SV/C57Bl/6) y diferentes cepas mutantes fueron empleados 2,3,7,14. De hecho, el microambiente creado por el sistema de cultivo es suficiente para superar algunas de las barreras genéticas a mantener las SSC adultos in vivo (por ejemplo, en el caso de PLZF - / - de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Diluyente para tampón de disociación </td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25 a 051-CI </td><td></td></tr><tr><td> Células madre de base mediana (StemPro-34) </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td> Requiere la suplementación como por Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> Tallo suplementos de células medianas </td><td> vario </td><td> véase la Tabla 3 </td><td> Requiere la suplementación como por Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 células </td><td> Célula Biolabs, Inc. </td><td> CBA-315 </td><td> Se puede sustituir por adultos células del estroma testicular como por Seandel et al. (2007) </td></tr><tr><td> mitomicina-C (CUIDADO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4287 </td><td> Tóxico; Manipular con cuidado. </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> 0,4% de solución en agua </td></tr><tr><td> EVOS xl digital, microscopio invertido </td><td> Grupo de Microscopía Avanzada </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Reactivos y equipos específicos. * Véase la Tabla 3 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Diluyente para tampón de disociación </td></tr><tr><td> tripsina (1:250) </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td> Tampón de disociación: Final 0,05% peso / vol </td></tr><tr><td> colagenasa tipo I, 235 U / ml </td><td> Worthington </td><td> CLS1 235 </td><td> Tampón de disociación: Final 0,03% peso / vol </td></tr><tr><td> DNAsa I </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> DN25 </td><td> Tampón de disociación: Final 80 U / ml </td></tr><tr><td> albúmina de suero bovino </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE-100g </td><td> Tampón de disociación: Final 0,5% peso / vol </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 2. Tampón de disociación </td></tr><tr><td> StemPro SFM-34 </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 suplemento de nutrientes </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> Suplementos adicionales ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> No esenciales de aminoácidos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> MEM Vitamina solución </td><td> Life Technologies </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> albúmina de suero bovino </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico Solución </td><td> Mediatech </td><td> 30 a 004-CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) glucosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8769 </td><td> 6 mg / ml </td></tr><tr><td> β-estradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E2758 </td><td> 30 ng / ml </td></tr><tr><td> progesterona </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 ng / ml </td></tr><tr><td> suero bovino fetal </td><td> variable </td><td> n / a </td><td> 1% </td></tr><tr><td> bovino holo-transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1283 </td><td> 100 g / ml </td></tr><tr><td> insulina </td><td> Gemini Bio-Productos </td><td> 700-112P </td><td> 25 ug / ml </td></tr><tr><td> GDNF humano </td><td> La vida Techngías </td><td> PHC7041 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF humano </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0023 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> EGF de ratón </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0313 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> putrescina </td><td> Research Organics </td><td> 0778P </td><td> 60 micras </td></tr><tr><td> selenita de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> ácido pirúvico </td><td> Alfa Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 ug / ml </td></tr><tr><td> DL-ácido láctico </td><td> JT Baker </td><td> 0196-04 </td><td> 1 g / ml </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Life Technologies </td><td> 21985-023 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> ácido ascórbico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> 100 mM </td></tr><tr> &lt;td&gt; D-biotina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4639 </td><td> 10 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 3. Stem medio celular </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Nota: Añadir suplementos continuación antes de utilizar medio. Filtrar esterilizar y mantener a 4 ° C. El medio es estable durante al menos 2 semanas. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ** Se han empleado diferentes fabricantes, formulaciones y / o números de lote de estos reactivos sin efectos nocivos aparentes. En general, los reactivos de grado de cultivo de células se debe emplear. </td></tr></tbody></table>

serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines

Madre de espermatogonias y células progenitoras (SSC) de los testículos representan un ejemplo clásico de las células madre adultas de mamífero y preservar la fertilidad durante casi toda la vida del animal. Aunque los mecanismos precisos que gobiernan la auto-renovación y diferenciación in vivo son difíciles de estudio, los sistemas se han desarrollado varios previamente para propagar las ESC murinas in vitro usando una combinación de medios de cultivo especializados y células alimentadoras 1-3. La mayoría de las incursiones in vitro sobre la biología de las ESC han derivado líneas celulares de los recién nacidos, posiblemente debido a la dificultad en la obtención de líneas de células adultas 4. Sin embargo, el testículo continúa madurando hasta ~ 5 semanas de edad en la mayoría de las cepas de ratón. En el periodo post-natal período, los cambios dramáticos se producen en la arquitectura de los testículos y en la biología de las células somáticas y de espermatogénesis, incluyendo alteraciones en los niveles de expresión de numerosas células madre relacionadogenes. Por lo tanto, neonatalmente derivados de las líneas SSC no completamente puede recapitular la biología de las ESC adultos que persisten después de los testículos adultos ha alcanzado un estado estable. Hay varios factores que han dificultado la producción de líneas de CSS históricamente adultos. En primer lugar, la proporción de células madre funcionales puede disminuir durante la edad adulta, ya sea debido a factores intrínsecos o extrínsecos 5,6. Además, como con otras células madre adultas, que ha sido difícil para enriquecer las SSC suficientemente partir de células adultas testiculares totales sin utilizar una combinación de inmunoselección u otras estrategias de clasificación 7. Estrategias comúnmente empleadas incluyen el uso de ratones criptórquidos como una fuente de células donantes debido a una mayor proporción de células madre para otros tipos de células 8. Sobre la base de la hipótesis de que la eliminación de las células somáticas de la cultura inicial altera las interacciones con el nicho de células madre, que son esenciales para la supervivencia SSC, previamente desarrollado métodos para derivar l adultoines que no requieren inmunoselección o donantes criptórquidos sino más bien emplear enriquecimiento de serie de las ESC en cultivo, denominado en lo sucesivo SESC 2,3. El método se describe a continuación implica un procedimiento sencillo para derivar líneas SSC adultos mediante la disociación de adulto donante túbulos seminíferos, seguido de plaqueo de las células en los alimentadores que comprenden una línea de células del estroma testicular (JK1) 3. A través de pasada en serie, fuertemente adherente, contaminando las células germinales no se agotan a partir del cultivo de enriquecimiento concomitante de SSC. Los cultivos producidos de esta manera contienen una mezcla de espermatogonias en diferentes estadios de diferenciación, que contienen las ESC, en base a largo plazo la capacidad de auto-renovación. El quid de la SESC método es que permite a CSC para hacer la difícil transición de la auto-renovación en vivo a largo plazo de la auto-renovación in vitro en un microambiente radicalmente diferente, produce a largo plazo las líneas de cooperación Sur-Sur, libre de contaminacióncélulas somáticas, y permite así la posterior manipulación experimental de las ESC.

La aparición de paso por cero de tipo salvaje, las colonias adultas SSC después de 7 días se muestra en la figura 1. Tridimensionales colonias están compuestas de una capa de células planas unidas a los alimentadores o de la matriz extracelular subordinado depositados por los alimentadores con múltiples capas de las ESC que crecen en la parte superior. Mientras las ESC sanos son brillantes refráctil y de manera uniforme 11 a 12 m de diámetro, los bordes de las celdas son difíciles de distinguir...

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Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Un método sencillo para obtener y mantener la madre de espermatogonias y las líneas de células progenitoras de ratones adultos se presenta aquí. El método utiliza las células de alimentación se originan en el compartimiento de células somáticas de los testículos de ratón adulto. Esta técnica es aplicable a las cepas de ratones comunes, incluyendo transgénicos, knock-out y knock-en ratones.

Enriquecimiento de serie de la madre de espermatogonias y células progenitoras (SSC) en Cultura para la derivación de largo plazo de ratones adultos Líneas SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

serial-enrichment-spermatogonial-stem-progenitor-cells-sscs-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

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Video: Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Investigación

Biología

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

El aislamiento y la expansión a gran escala de células humanas adultas Colonia progenitoras endoteliales formación

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Derivación de células madre de ratón a partir de blastocistos Trofoblasto

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas epiteliales de la piel humana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...